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Può un miRNA essere sovraregolato e sottoregolato nella stessa malattia?

Può un miRNA essere sovraregolato e sottoregolato nella stessa malattia?


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Sono un tipo computazionale e quindi mi scuso se la domanda è stupida.

Lo stesso miRNA può mostrare upregulation e downregulation nella stessa malattia? (Non nello stesso esperimento, però). Per es. può esserci un'istanza di miRNAhsa-miR-21essere sovraregolato in una malattia glioblastoma in 1 studio e in un altro studio c'è un'occorrenza dihsa-miR-21essere down-regolato nel glioblastoma. È possibile?

Ad esempio ho trovato:hsa-miR-345-> sovraespressione nel cancro del pancreas (PMID: 16966691) e,hsa-miR-345-> downregulation nel cancro del pancreas (PMID: 17149698)

Eventuali indicazioni sarebbero apprezzate.


Poiché le malattie sono spesso complesse, non è sorprendente trovare geni specifici (sia geni che codificano miRNA che geni che codificano proteine) che vengono regolati con deferenza quando vengono confrontati diversi studi di malattie dal suono simile. In altre parole, cose comeglioblastomaoCancro al pancreasdovrebbero essere trattati come etichette che descrivono stati patologici grossolanamente simili (cioè eccessiva proliferazione di cellule gliali e pancreatiche, rispettivamente), piuttosto che come etichette di uno stato cellulare specifico associato a un particolare modello di espressione genica.


RNA e stress ossidativo nella malattia di Alzheimer: focus sui microRNA

Lo stress ossidativo (OS) è uno dei principali meccanismi patogenetici della malattia di Alzheimer (AD), che è strettamente associato ad altri eventi chiave nella neurodegenerazione come la disfunzione mitocondriale, l'infiammazione, la disregolazione dei metalli e il misfolding delle proteine. Gli RNA ossidati sono identificati nel cervello dei pazienti con AD nella fase prodromica. Infatti, mRNA, rRNA e tRNA ossidati portano a una sintesi proteica ritardata o aberrante. L'OS interferisce non solo con questi macchinari traslazionali ma anche con i meccanismi regolatori degli RNA non codificanti, in particolare i microRNA (miRNA). I miRNA possono essere ossidati, il che causa il misconoscimento degli mRNA bersaglio. Inoltre, l'OS influenza l'espressione di più miRNA e, al contrario, i miRNA regolano molti geni coinvolti nella risposta dell'OS. Curiosamente, diversi miRNA incorporati nei regolatori a monte o nei bersagli a valle dell'OS sono coinvolti anche nelle vie neurodegenerative nell'AD. In particolare, sette miRNA sovraregolati (miR-125b, miR-146a, miR-200c, miR-26b, miR-30e, miR-34a, miR-34c) e tre miRNA sottoregolati (miR-107, miR-210, miR-485 ), che sono tutti associati all'OS, si trovano nelle regioni cerebrali vulnerabili dell'AD nella fase prodromica. Prove crescenti suggeriscono che i miRNA alterati possono servire come bersagli per lo sviluppo di strumenti diagnostici o terapeutici per l'AD in fase iniziale. Concentrarsi su un repressore trascrizionale neuroprotettivo, REST, e sul concetto di ormesi che sono rilevanti per la risposta del sistema operativo può fornire indizi per aiutarci a comprendere il ruolo del sistema dei miRNA nei meccanismi di adattamento cellulare e dell'organismo al sistema operativo.


Sfondo

Nell'ultimo decennio, i miRNA non codificanti hanno suscitato l'interesse degli scienziati e la loro esplorazione ha rivoluzionato la biologia. Da quando il primo miRNA è stato scoperto in Caenorhabditis elegans nel 1993 [1] è stato riportato un numero crescente di miRNA per varie specie. Attualmente, la versione 20 del miRBase [2],[3] contiene 24.521 voci che rappresentano i miRNA precursori delle forcine, che esprimono 30.424 prodotti di miRNA maturi in 206 specie. Per Homo sapiens, in questo database sono attualmente inclusi più di 2.500 diversi miRNA maturi.

I piccoli miRNA non codificanti sono noti per essere coinvolti in processi biologici cruciali come la proliferazione, l'apoptosi, la differenziazione o lo sviluppo [4]-[6]. È noto che oltre il 50% di tutti i geni nel genoma umano sono bersagli di miRNA e, quindi, i miRNA sono coinvolti nella regolazione di una molteplicità di vie metaboliche e regolatorie in modo tale che ora l'analisi di rete integrativa di miRNA e mRNA diventa sempre più possibile [7]-[9]. Quindi, profili di miRNA anormali sono stati associati a molti processi patogeni umani, come dimostrato da molti studi che si sono concentrati su profili di miRNA derivati ​​dai tessuti (ad esempio, da pazienti con cancro ai polmoni [10], cancro al seno [11] o glioblastoma [12]) . Poiché questi piccoli acidi nucleici eccellono nella loro elevata stabilità, sono diventati ancora più attraenti come candidati biomarcatori. Ciò sottolinea anche il potenziale dei biomarcatori di miRNA derivati ​​dal sangue periferico per scopi diagnostici. Molti gruppi hanno studiato i profili di miRNA circolanti dal siero per varie malattie (insufficienza cardiaca sistolica non ischemica [13], tubercolosi polmonare [14], cancro del polmone non a piccole cellule [15],[16], cancro al seno [17], cancro [18], o cancro ovarico [19]), mentre noi e altri abbiamo sviluppato procedure operative standardizzate per misurare i profili di miRNA da sangue periferico intero (infarto del miocardio [20], cancro del polmone [21], sclerosi multipla [22],[23 ], melanoma [24], cancro ovarico [25], malattia polmonare ostruttiva cronica [26], glioblastoma [27] e malattia di Alzheimer [28]).

Nella presente meta-analisi, abbiamo analizzato un totale di 848 miRNA in 1.049 campioni (contenenti i 454 campioni pubblicati nel nostro precedente studio [29]) misurati da sangue intero raccolto in provette di sangue PAXgene. La coorte studiata include controlli sani e pazienti con diagnosi di una delle 19 malattie di diverse classi di classificazione internazionale delle malattie (ICD)-10 (10 entità tumorali e 9 malattie non tumorali i dettagli sulle diverse dimensioni della coorte sono presentati nella Tabella 1) . I nostri risultati forniscono una panoramica completa del miRnome della malattia umana. Utilizzando questa ricca fonte di dati, abbiamo mirato a identificare i profili di miRNA rappresentativi di uno stato di malattia generale e a identificare le firme di miRNA adatte a discriminare diverse malattie dai controlli e l'una dall'altra.


Materiale e metodi

Raccolta di campioni

Tra il 2014 e il 2016, abbiamo raccolto il tessuto BC tumorale insieme al tessuto sano adiacente dai pazienti, solo dopo aver ottenuto il consenso informato da ciascun paziente e l'approvazione da parte del comitato etico istituzionale dell'Università di Medicina e Farmacia Iuliu Hatieganu, Cluj-Napoca, Romania (UMPh), con l'autorizzazione n. 673A/20.11.2012. Abbiamo conservato le resezioni transuretrali dei tessuti del tumore della vescica (TURBT) in azoto liquido fino all'elaborazione del campione e all'estrazione dell'RNA. Quando le procedure chirurgiche e patologiche lo consentivano, i chirurghi prelevavano il tessuto sano, adiacente al tumore, da ciascun paziente. Inizialmente abbiamo valutato l'espressione di Her2 e TP53 utilizzando il protocollo di colorazione immunoistochimica standard. I campioni di tessuto accoppiati (sani e tumorali) successivamente utilizzati per il microarray e le analisi di sequenziamento di nuova generazione sono indicati come coorte di pazienti UMPh. Il secondo gruppo di campioni raccolti era per la convalida qRT-PCR e ha chiamato il set di convalida che abbiamo raccolto questa coorte di pazienti aggiuntiva.

Elaborazione del campione e valutazione di microarray

L'estrazione e l'isolamento dell'RNA totale da 23 campioni accoppiati (tessuto vescicale normale e tumorale) viene eseguita utilizzando il protocollo TriReagent (Sigma-Aldrich). Lo spettrofotometro NanoDrop-1000 è stato utilizzato per misurare la concentrazione di RNA. Le sonde per microarray sono state sintetizzate da quantità uguali di 100 ng di RNA totale, utilizzando il protocollo per microarray di miRNA basato sulla versione 3.1 di settembre 2015 (Agilent Technologies) che includeva un kit completo di etichettatura e ibridazione (cat n. 5190–0456 Agilent) e un kit di purificazione passaggio con Micro Bio-Spin P-6 Gel Column (Biorad). Lo scanner per microarray SureScan (Agilent Technologies) ha scansionato i vetrini del microarray e il software Feature Extraction 12.0 ha eseguito l'estrazione dei dati. L'ultimo passo nella valutazione del microarray è stato quello di identificare i miRNA primari alterati. Gene Spring GX v.13.0, applicando una soglia di cambiamento di piega (FC) di 2 t-test moderato e correzione del tasso di rilevamento falso (P-valore ≤0,05), ha analizzato i dati del microarray e ha generato i confronti di tessuti tumorali di basso grado rispetto a quelli di alto grado tumore di basso grado rispetto ai tessuti sani tumori di alto grado rispetto ai tessuti sani (dati disponibili su Arrayexpress, ID: E-MTAB- 8356).

Analisi dei dati TCGA del cancro della vescica

Abbiamo eseguito un'analisi supplementare al terzo livello di sequenziamento dei miRNA da 409 tumori della vescica e 19 tessuti sani, adiacenti ai tumori, ottenuti dal portale dati TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/ ). I dati sono stati analizzati in GeneSpring GX v.13.0, applicando il precedente valore di cut-off definito.

Valutazione miRNA qRT-PCR su campioni di tessuto

Abbiamo selezionato per convalidare tre trascritti sovraregolati (miR-23a, miR-141-3p e miR-205-5p) e due trascritti sottoregolati (miR-139-5p e miR-143-5p) dai campioni di tessuto accoppiati. L'RNA è stato estratto utilizzando il metodo basato su TriReagent per la convalida qRT-PCR è stata eseguita su 18 tessuti vescicali sani e 18 tessuti tumorali della vescica. Abbiamo eseguito la sintesi del cDNA utilizzando una miscela di 7,5 μl di trascrizione inversa contenente 0,72 μl di primer RT, 50 ng di RNA totale e 0,5 μl di trascrittasi inversa MultiScribe, 0,75 μl di tampone di trascrizione inversa (10 ×), 0,075 μl di dNTP (100 mM) , 0,1 μl di inibitore della RNasi secondo il protocollo Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). La miscela di cDNA viene incubata in provette PCR per 30 min a 16°C, 30 min a 42°C e 5 min a 85°C. qRT-PCR è stata eseguita utilizzando la macchina PCR in ViiA7 (Applied Biosystems) con un volume totale di miscela di reazione di 12,5 μl questa miscela di reazione è costituita da 6,25 μl di cDNA (diluito 1:6 con acqua priva di nucleasi), 5,63 μl di SSoAdvanced Universal Probe Supermix (Bio-Rad) e primer da 0,73 μl per ogni miRNA. Le reazioni sono state impostate come segue: fase iniziale di denaturazione a 95 °C per 180 s, seguita da 39 cicli a 95 °C per 5 s e, infine, a 60 °C per 30 s. Il livello di espressione di ciascun miRNA è calcolato dal ciclo soglia (CT). Il livello di espressione relativa è stato calcolato utilizzando –ΔΔCT metodo e U6 per la normalizzazione.

Valutazione TP53 mediante qRT-PCR su campioni di tessuto vescicale

I tecnici di laboratorio hanno sintetizzato il cDNA utilizzando il kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems). La preparazione della reazione di qRT-qPCR ha utilizzato SYBR Select Master Mix (Life Technologies) ed è stata eseguita utilizzando ViiA7. Sono state utilizzate le seguenti condizioni: 95 °C per 2 min, 40 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 1 min. La FC dell'espressione genica è stata calcolata con la CT metodo, utilizzando B2M come gene housekeeping.

Sequenziamento di nuova generazione di campioni di cancro alla vescica

Un certo numero di 22 campioni di cancro alla vescica, gli stessi analizzati mediante microarray (tranne un campione dalla coorte di pazienti microarray con bassa concentrazione di DNA), sono stati sequenziati utilizzando Ion Ampliseq Cancer Panel e Ion Torrent PGM Next Generation Sequencing (Thermo Fischer Scientific) questo pannello contiene la mutazione hot spot più rilevante. Le librerie di ampliconi sono state preparate con 20 ng di DNA e lo Ion Ampliseq™ Library Kit 2.0 (Life Technologies) e questo è stato seguito da una fase di purificazione utilizzando AMpure XP Beads (Beckman Coulter). Infine, Qubit 2.0 è stato utilizzato per la quantificazione utilizzando il kit Qubit HS DNA. Per il sequenziamento, sono state utilizzate quattro librerie diluite a 100 pM con codice a barre per ciascun chip Ion 316 (Thermo Fischer Scientific). Ion Torrent PGM Machine (Thermo Fischer Scientific) ha eseguito il sequenziamento, utilizzando il kit Ion PGM HI-Q Sequencing 200. Il software Torrent Suit 5.6 e Ion Reporter 5.6 hanno eseguito l'analisi bioinformatica, in particolare per l'allineamento del trimming dei dati e la chiamata delle varianti.

Analisi funzionale e identificazione dei geni bersaglio

L'analisi IPA ha determinato i miRNA con livelli di espressione alterati per identificare le reti più rilevanti, i percorsi alterati e il loro rispettivo significato biologico. Per l'identificazione dei geni bersaglio più rilevanti per i nostri miRNA, sono stati utilizzati i seguenti database e webserver: miRTarBase (https://bio.tools/mirtarbase) miRNet (https://www.mirnet.ca/) e miRtargetLink (https://www.mirnet.ca/) ://ccb-web.cs.uni-saarland.de/mirtargetlink/).


Riepilogo dell'autore

Cardiomiopatia cronica della malattia di Chagas (CCC), una cardiomiopatia dilatativa aggressiva causata da Tripanosoma cruzi, è una delle principali cause di cardiomiopatia in America Latina. Poco si sa dei meccanismi molecolari responsabili della sua gravità. Gli autori studiano il possibile ruolo dei microRNA nella regolazione dell'espressione genica in percorsi rilevanti e processi patobiologici. Geni differenzialmente espressi (DEG) e miRNA differenzialmente espressi (DEM), piccoli RNA che possono regolare l'espressione genica, associati allo sviluppo di una grave cardiomiopatia. Il mediatore infiammatorio Interferone-γ era l'induttore più probabile dell'espressione genica nel CCC e la maggior parte dei geni apparteneva alla risposta immunitaria, alla fibrosi, all'ipertrofia e al metabolismo mitocondriale. Un numero discreto di mRNA espressi in modo differenziale ha preso di mira un numero elevato di mRNA espressi in modo differenziale in più processi. Inoltre, diversi percorsi avevano più bersagli regolati da microRNA, suggerendo un effetto sinergico. I risultati suggeriscono che i microRNA orchestrano l'espressione di più geni nei principali processi fisiopatologici nel tessuto cardiaco CCC.

Citazione: Laugier L, Ferreira LRP, Ferreira FM, Cabantous S, Frade AF, Nunes JP, et al. (2020) i miRNA possono svolgere un ruolo importante nel controllo dell'espressione genica nei processi patobiologici chiave nella cardiomiopatia della malattia di Chagas. PLoS Negl Trop Dis 14(12): e0008889. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0008889

Editore: Juan M. Bustamante, Università della Georgia, STATI UNITI

Ricevuto: 30 marzo 2020 Accettato: 14 ottobre 2020 Pubblicato: 22 dicembre 2020

Diritto d'autore: © 2020 Laugier et al. Questo è un articolo ad accesso aperto distribuito secondo i termini della Creative Commons Attribution License, che consente l'uso, la distribuzione e la riproduzione senza restrizioni con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore e la fonte originali siano citati.

Disponibilità dei dati: I dati di espressione genica sono stati depositati nel database GEO (GSE84796 e GSE111544).

Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto dall'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), dall'Università di Aix-Marseille (Direction des Relations Internationales), dal programma ARCUS II PACA Brésil, CNPq (Consiglio nazionale delle ricerche brasiliano) e FAPESP ( Agenzia di finanziamento statale per la ricerca di San Paolo-Brasile). ECN e CC sono state destinatarie di un programma internazionale finanziato dall'ANR francese e dalle agenzie FAPESP brasiliane (Br-Fr-chagas). AFF tiene borse di studio dall'Agenzia di finanziamento della ricerca statale di San Paolo, FAPESP. ECN e JK hanno ricevuto un premio per la produttività del Consiglio per lo sviluppo scientifico e tecnologico - CNPq. CC è titolare di una posizione di professore a tempo determinato sostenuto dal consolato francese in Brasile e dall'Università di São Paulo (USP). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Interessi conflittuali: Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.


Conclusioni

È ormai ampiamente riconosciuto che la complessità delle interazioni molecolari che avvengono a livello cellulare può oscurare significativamente le conseguenze attese dei processi molecolari caratterizzati in vitro [30, 31]. I nostri risultati indicano che gli effetti regolatori diretti e indiretti dei cambiamenti nei livelli di espressione dei miRNA in vivo sono interattivi e complessi ma suscettibili di modellazione a livello di sistema. Abbiamo dimostrato che TOM può spiegare una componente importante delle conseguenze inaspettate dei cambiamenti nei livelli di espressione dei miRNA sui loro mRNA bersaglio. Sebbene il modello sia stato sviluppato e valutato nel contesto del cancro ovarico, riteniamo che possa essere applicabile anche in altri contesti biologici, incluso il potenziale uso futuro nella progettazione razionale di strategie basate su miRNA per il trattamento del cancro e di altre malattie.


Conclusioni

Nel complesso, in questo studio le analisi del percorso hanno evidenziato l'arricchimento dei geni DE nelle vie di risposta immunitaria e antivirale innate in PM e DM e hanno replicato i risultati precedenti secondo cui la segnalazione dell'interferone è sovraregolata in PM e DM e più altamente sovraregolata e spostata verso la segnalazione di interferone di tipo II nel sottogruppo anti-Jo1 [14, 15]. Inoltre, questo studio ha evidenziato l'arricchimento di geni disregolati nelle vie delle cellule T-helper nel sottoinsieme positivo anti-Jo1 e ha indicato un possibile ruolo per la regolazione di miR-96-5p di ADK nella patogenesi dell'IIM.


Può un miRNA essere sovraregolato e sottoregolato nella stessa malattia - Biologia

Obbiettivo La metaplasia intestinale e la metaplasia spasmolitica che esprime polipeptidi (SPEM) sono considerate precursori neoplastici dell'adenocarcinoma gastrico e sono entrambe caratterizzate da alterazioni dell'espressione genica rispetto allo stomaco normale. Poiché i miRNA sono importanti regolatori dell'espressione genica, abbiamo cercato di studiare il ruolo dei miRNA sullo sviluppo delle metaplasie dello stomaco.

Design Abbiamo eseguito il profilo di miRNA utilizzando un approccio quantitativo di trascrizione inversa-PCR su metaplasia intestinale umana microdissezionata con cattura laser e SPEM. L'integrazione dei dati del profilo miRNA con un precedente profilo mRNA dagli stessi campioni è stata eseguita per rilevare potenziali circuiti regolatori miRNA-mRNA. La trasfezione di linee cellulari di cancro gastrico con miRNA e inibitori selezionati è stata utilizzata per valutare i loro effetti sull'espressione di bersagli putativi e ulteriori marcatori di metaplasia.

Risultati Abbiamo identificato diversi geni come potenziali bersagli di miRNA alterati durante la progressione della metaplasia. Abbiamo mostrato prove che HNF4γ (sovraregolato nella metaplasia intestinale) è preso di mira da miR-30 e che miR-194 prende di mira un noto co-regolatore dell'attività di HNF4, NR2F2 (sottoregolato nella metaplasia intestinale). I marcatori di metaplasia intestinale come VIL1, TFF2 e TFF3 sono stati sottoregolati dopo la sovraespressione di miR-30a in modo HNF4γ-dipendente. Inoltre, la sovraespressione di HNF4γ era sufficiente per indurre l'espressione di VIL1 e questo effetto è stato potenziato dalla downregulation di NR2F2.

Conclusioni L'interazione dei due fattori di trascrizione HNF4γ e NR2F2 e la loro regolazione coordinata da parte di miR-30 e miR-194, rispettivamente, rappresentano una rete di fattori di trascrizione da miRNA responsabile dell'espressione delle trascrizioni intestinali nelle linee cellulari dello stomaco durante lo sviluppo della metaplasia intestinale.


Può un miRNA essere sovraregolato e sottoregolato nella stessa malattia - Biologia

Obbiettivo I microRNA (miRNA) regolano l'espressione dei geni coinvolti nell'attivazione immunitaria. È stato intrapreso uno studio per caratterizzare la firma dei miRNA e identificare nuovi geni coinvolti nella regolazione delle risposte immunitarie nel lupus eritematoso sistemico (LES).

metodi L'espressione di 365 miRNA nelle cellule mononucleate del sangue periferico di pazienti con LES e controlli sani è stata analizzata utilizzando TaqMan Low Density Arrays. I risultati sono stati convalidati mediante PCR quantitativa in tempo reale e potenziali geni bersaglio sono stati identificati utilizzando un software di analisi predittiva. L'effetto di miR-21 sulla funzione delle cellule T è stato valutato mediante trasfezione con antago-miR-21 o pre-miR-21.

Risultati Una firma di 27 miRNA è stata identificata in pazienti con LES 19 miRNA correlati con l'attività della malattia. Otto miRNA sono stati deregolati specificamente nelle cellule T e quattro miRNA nelle cellule B. miR-21 era sovraregolato e fortemente correlato con l'attività della malattia del LES (r 2 = 0,92). Rispetto ai controlli, i linfociti T CD4 di pazienti con LES avevano una maggiore espressione di miR-21 basale e indotta dall'attivazione. Il silenziamento di miR-21 ha invertito il fenotipo attivato delle cellule T da pazienti con LES, vale a dire, maggiore proliferazione, produzione di interleuchina 10, espressione di CD40L e la loro capacità di guidare la maturazione delle cellule B in CD19 + CD38 hi Ig-secernenti IgD-(cellule plasmatiche. La sovraespressione di mMiR-21 nelle cellule T normali ha portato all'acquisizione di un fenotipo attivato.Lo studio di putativi bersagli genici ha mostrato che PDCD4 (un inibitore selettivo della traduzione proteica) è stato soppresso da miR-21 e la sua espressione è stata ridotta nel LES attivo.

Conclusioni I miRNA rappresentano potenziali biomarcatori nel LES poiché la loro espressione riflette i processi patogeni sottostanti e si correla con l'attività della malattia. Il miR-21 sovraregolato influenza l'espressione di PDCD4 e regola le risposte aberranti delle cellule T nel LES umano.


Ringraziamenti

Gli autori riconoscono Rachel Merrill per l'assistenza con la preparazione della figura.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) sotto il Ruth L. Kirschstein National Research Service Award NIH 5T32DK007115 dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (JAW) dal NIH National Cancer Institute con il numero di premio F30CA217027 (JAW ) il NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 del National Institute of General Medical Sciences (RMO), il Gabrielle's Angel Foundation Award (RMO) e il Leukemia & Lymphoma Society Scholar Award (RMO).


Guarda il video: Introduction to MicroRNA - Anna M. Krichevsky (Febbraio 2023).