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Chiarire la pressione pre-colonna rispetto alla pressione del sistema rispetto alla contropressione per le colonne preconfezionate utilizzate con il sistema di purificazione äkta

Chiarire la pressione pre-colonna rispetto alla pressione del sistema rispetto alla contropressione per le colonne preconfezionate utilizzate con il sistema di purificazione äkta


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Sfondo: Sto usando il sistema Äkta pure per la purificazione delle proteine, con colonne preconfezionate di GE-healthcare. Solo per fare un esempio, utilizzo la colonna HisTrap da 5 mL (IMAC: cromatografia di affinità con metalli immobilizzati). Comprendo gli effetti del superamento eccessivo dei limiti di pressione di una colonna, e quindi impostare vigorosamente la pressione pre-colonna a 0,5 MPa ogni volta che utilizzo l'Akta. Tuttavia, sto iniziando a chiedermi come dovrei pensare alla diversa pressione e se 0,5 MPa è corretto per le diverse colonne che sto utilizzando.

Mi è stato insegnato a impostare sempre la pressione pre-colonne, il che ha senso poiché per quanto ne so - questa è la pressione effettiva all'interno della colonna (pressione percepita dalla resina). Tuttavia, se apro la documentazione sulla colonna HisTrap da 5 ml di GE-healthcare, non riesco a trovare molto sul limite di pressione pre-colonna. Trovo anche i termini limite massimo di contropressione nella documentazione per la colonna e pressione del sistema.

Domande: In che modo la pressione del sistema è diversa dalla pressione delle precolonne? Devo calcolare io stesso la pressione pre-colonna come effetto delle dimensioni e della lunghezza del tubo che porta alla colonna? C'è un buon articolo o una pagina web che attraversi questa teoria a un livello di base?

Sembra ovvio, ma come si può creare una contropressione in un sistema che non è chiuso e va da una parte (o forse è l'Äkta a creare la pressione)?


C'è un buon articolo o una pagina web che attraversi questa teoria a un livello di base?

Sì, il capitolo 7 del manuale collegato da Andreas Tosstorff è una buona fonte, ed è anche la fonte delle immagini sottostanti. Anche i manuali per il sistema ÄKTA e le colonne HisTrap trattano la pressione in modo dettagliato.

Come si può creare contropressione in un sistema che non è chiuso e va a senso unico?

Questa è una domanda di fisica e, non essendo un fisico, non posso entrare nei dettagli. Tuttavia, uso anche il sistema ÄKTA per FPLC e potrei essere in grado di fornire una qualche forma di risposta. Qualsiasi fluido che si muove attraverso il tubo subisce una certa resistenza, ad esempio, attrito tra il fluido e le pareti del tubo, pieghe nel tubo e ostruzioni come filtri, miscelatori, valvole, ecc. Anche se il sistema è aperto a un'estremità, c'è resistenza al flusso di fluido attraverso di esso che crea contropressione. Le maggiori fonti di contropressione nel sistema FPLC a basse portate sono i filtri, i limitatori di flusso (se installati) e la colonna stessa.

In che modo la pressione del sistema è diversa dalla pressione delle precolonne?

La pressione del sistema per ÄKTA viene misurata sulla pompa. Questa misurazione di per sé non è molto informativa. Le pressioni importanti per la sicurezza della colonna sono le pressioni pre e post colonna (la pressione misurata immediatamente prima e dopo la colonna, rispettivamente) e la differenza tra queste due (la pressione attraverso la colonna). La tua colonna ha due limiti di pressione:

  1. Limite di pressione hardware: questa è la pressione massima che la colonna stessa resisterà prima che si verifichi il rischio di guasto. Lo so per esperienza dopo che una valvola malfunzionante ha fornito 4 volte la pressione hardware massima alla mia colonna. Nel mio caso, il fallimento ha significato che la parte superiore della colonna è saltata. La pressione pre-colonna non deve superare il limite di pressione hardware.
  2. Limite pressione resina: è la pressione massima che la resina all'interno della colonna può sopportare prima di collassare. La pressione attraverso la colonna non deve superare il limite di pressione della resina.

Devo calcolare io stesso la pressione pre-colonna come effetto delle dimensioni e della lunghezza del tubo che porta alla colonna?

Alcuni sistemi ÄKTA sono in grado di misurare direttamente le pressioni pre e post colonna. Il mio non lo è e non so il tuo. Nel caso in cui la pressione venga misurata alla pompa, la pressione precolonna è uguale alla contropressione tra la pompa e la colonna (causata dal tubo/filtro/ecc.) sottratta dalla pressione del sistema misurata. Per determinarlo, essenzialmente disconnettere la parte superiore della colonna, far funzionare il sistema nelle condizioni previste e registrare la pressione misurata (questa è la contropressione generata prima della colonna). Il manuale per le mie colonne (HiTrap Q) spiega questo passo dopo passo, e anche il tuo potrebbe farlo.

Il manuale spiega anche come determinare la pressione attraverso la colonna in modo simile. Tuttavia, nella mia esperienza, il percorso del flusso dopo la colonna è relativamente non restrittivo (a meno che non sia installato un limitatore di flusso) e il suo contributo alla contropressione è relativamente trascurabile. Quindi la pressione attraverso la colonna è ragionevolmente uguale alla pressione precolonna, che è anche ragionevolmente uguale alla pressione misurata del sistema. Inoltre, in ogni manuale che leggo, sono elencate alcune affermazioni sull'effetto di:

La pressione massima sul letto impaccato (Δp) è un limite approssimativo. Dipende dalle caratteristiche del mezzo cromatografico e dalla viscosità del campione/liquido. Il valore misurato include anche la pressione generata dal tubo della colonna. Per molte colonne, la portata consigliata è una linea guida migliore per proteggere il letto impaccato.

In effetti, il manuale delle mie colonne non elenca nemmeno il limite di pressione della resina e ci sono voluti degli scavi sostanziali per scoprire di cosa si tratta effettivamente. Corro sempre alla portata consigliata e imposto l'allarme di pressione del sistema al limite di pressione della resina (0,3 mPa nel mio caso rispetto al limite hardware di 0,5 mPa) senza nessuna delle correzioni sopra menzionate. Tuttavia, a seconda del sistema e dell'utilizzo, potrebbe essere necessario realizzarli.