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Esiste un limite massimo pratico alla quantità di nucleotidi o geni in un plasmide trasformato?

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Attualmente sto lavorando a un progetto di biologia sintetica che prevede di lavorare con molte parti diverse. Alla fine vorrei integrare questi geni trasformando un singolo plasmide. Ho sentito (casualmente) che 9-10 geni estranei su un plasmide trasformato è spesso il limite massimo pratico per questi tipi di esperimenti, senza una vera spiegazione se non "oltre a questo, semplicemente non funziona".

Esiste un limite massimo pratico alla dimensione della quantità di geni in un plasmide trasformato, assumendo che tutti debbano essere esprimibili? Cosa causa questo limite superiore?


Dalla mia esperienza nel mondo dei mammiferi (e questo può valere anche per i sistemi batterici), non è tanto il numero di geni nel plasmide quanto la sua dimensione effettiva. Più grande è il costrutto, più difficile sarà inserirlo nelle celle bersaglio in un unico pezzo, senza degradazione o taglio. Poiché l'efficienza di trasformazione è inferiore, ottieni meno costrutti interi per cella, quindi a seconda di come hai impostato i tuoi promotori, il livello di espressione complessivo può essere significativamente inferiore. Il problema con la suddivisione dei tuoi geni tra due o più plasmidi è che ognuno avrà efficienze di trasformazione diverse e ci sarà un certo numero (forse grande) di cellule che non ottengono l'intero complemento di geni, interferendo con l'analisi del fenotipo. E ancora, dovrai anche considerare i tassi di espressione differenziale.

Tuttavia, una volta ottenuto il vettore nelle cellule in un unico pezzo, teoricamente dovrebbero essere tutti espressi a livelli approssimativamente uguali (assumendo promotori identici). È possibile che si verifichi un ostacolo sterico tra più complessi di trascrizione - semplicemente non so abbastanza sulla trascrizione batterica e sugli effetti dei plasmidi circolari da dire.

Un modo per aggirare molti di questi fattori sarebbe quello di utilizzare un cromosoma artificiale batterico o BAC. I BAC sono vettori di 7-10 kb in cui possono essere clonati inserti fino a 1 milione di bp e vengono quindi elettroporati nelle cellule. Una delle (molte) cose interessanti di loro è che controllano la propria duplicazione e il partizionamento alla divisione cellulare, quindi le generazioni successive dovrebbero avere essenzialmente lo stesso numero di copie dell'originale. Sono stati ampiamente utilizzati durante il Progetto Genoma Umano per amplificare ampie sezioni di DNA per il sequenziamento, ma sono utilizzati anche in molti altri studi, inclusa la biologia sintetica. OpenWetWare ha un elenco di alcuni comuni e NEB vende sistemi pBeloBAC11.


Sintesi genica artificiale

Sintesi genica artificiale, o sintesi genica, si riferisce a un gruppo di metodi utilizzati nella biologia sintetica per costruire e assemblare geni da nucleotidi de novo. A differenza della sintesi del DNA nelle cellule viventi, la sintesi genica artificiale non richiede DNA modello, consentendo di sintetizzare praticamente qualsiasi sequenza di DNA in laboratorio. Comprende due fasi principali, la prima delle quali è la sintesi del DNA in fase solida, talvolta nota come stampa del DNA. [1] Questo produce frammenti di oligonucleotidi che sono generalmente inferiori a 200 paia di basi. Il secondo passaggio prevede quindi il collegamento di questi frammenti di oligonucleotidi utilizzando vari metodi di assemblaggio del DNA. Poiché la sintesi genica artificiale non richiede DNA stampo, è teoricamente possibile realizzare molecole di DNA completamente sintetiche senza limiti sulla sequenza nucleotidica o sulla dimensione.

La sintesi del primo gene completo, un tRNA di lievito, è stata dimostrata da Har Gobind Khorana e collaboratori nel 1972. [2] La sintesi dei primi geni codificanti peptidi e proteine ​​è stata eseguita nei laboratori di Herbert Boyer e Alexander Markham, rispettivamente. [3] [4] Più recentemente sono stati sviluppati metodi di sintesi genica artificiale che consentiranno l'assemblaggio di interi cromosomi e genomi. Il primo cromosoma sintetico di lievito è stato sintetizzato nel 2014 e sono stati sintetizzati anche interi cromosomi batterici funzionali. [5] Inoltre, la sintesi genica artificiale potrebbe in futuro utilizzare nuove coppie di basi azotate (coppie di basi non naturali). [6] [7] [8]


Cosmid

UN cosmide, descritto per la prima volta da Collins e Hohn nel 1978, è un tipo di plasmide ibrido (spesso usato come vettore di clonazione) che contiene sequenze cos, Sequenze di DNA originarie del fago Lambda. I cosmidi possono essere usati per costruire librerie genomiche.

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I cosmidi sono in grado di contenere da 37 a 52 kbp di DNA, mentre i plasmidi normali sono in grado di trasportare solo 1-20 kbp. Possono replicarsi come plasmidi se hanno un'opportuna origine di replicazione: per esempio SV40 ori nelle cellule di mammifero, ColE1 ori per la replicazione del DNA a doppio filamento o f1 ori per la replicazione del DNA a singolo filamento nei procarioti. Spesso contengono anche un gene per la selezione come la resistenza agli antibiotici, in modo che le cellule trasfettate possano essere identificate mediante piastratura su un terreno contenente l'antibiotico. Quelle cellule che non assorbissero il cosmide non sarebbero in grado di crescere.

Tuttavia, a differenza dei plasmidi, possono anche essere confezionati in capsidi fagici, il che consente il trasferimento dei geni estranei all'interno o tra le cellule mediante trasduzione. I plasmidi diventano instabili dopo che una certa quantità di DNA è stata inserita in essi, perché la loro maggiore dimensione è più favorevole alla ricombinazione. Per aggirare ciò, viene invece utilizzata la trasduzione fagica. Ciò è reso possibile dal estremità coesive, conosciuto anche come cos siti. In questo modo, sono simili all'uso del fago lambda come vettore, ma solo questo Tutti i geni lambda sono stati cancellati ad eccezione del cos sequenza.

200 paia di basi lunghe ed essenziali per il confezionamento. Contengono a cosN sito in cui il DNA viene intaccato in corrispondenza di ciascun filamento, a distanza di 12 bp, dalla terminasi. Ciò provoca la linearizzazione del cosmide circolare con due "estremità coesive" o "appiccicose" di 12 bp. Il DNA deve essere lineare per adattarsi alla testa di un fago. Il cosB sito trattiene il terminase mentre sta intaccando e separando i fili. Il cosQ il sito del cosmide successivo (poiché la replica del cerchio rotante spesso si traduce in concatemeri lineari) è tenuto dalla terminasi dopo che il cosmide precedente è stato impacchettato, per prevenire la degradazione da parte delle DNasi cellulari.

A causa della dimensione fissa della testa del fago, la terminase può confezionare solo cosmidi che sono tra il 75% e il 105% della lunghezza del fago normale. Quindi il limite superiore pratico della dimensione dell'inserto è di circa 40 kb, poiché dovranno esserci anche origini di replicazione, geni di selezione e siti di clonazione multipli. Per impacchettare ancora più DNA in un vettore, è possibile utilizzare cromosomi artificiali batterici o cromosomi artificiali di lievito.


9.3: Clonazione ed espressione ricombinante

Per realizzare le applicazioni sopra descritte, i biochimici devono essere in grado di estrarre, manipolare e analizzare gli acidi nucleici. Per comprendere le tecniche di base utilizzate per lavorare con gli acidi nucleici, ricorda che gli acidi nucleici sono macromolecole costituite da nucleotidi (uno zucchero, un fosfato e una base azotata). I gruppi fosfato su queste molecole hanno ciascuno una carica negativa netta. Un intero insieme di molecole di DNA nel nucleo degli organismi eucarioti è chiamato genoma. Il DNA ha due filamenti complementari collegati da legami idrogeno tra le basi appaiate.

A differenza del DNA nelle cellule eucariotiche, le molecole di RNA lasciano il nucleo. L'RNA messaggero (mRNA) viene analizzato più frequentemente perché rappresenta i geni codificanti proteine ​​che vengono espressi nella cellula.

Le tecniche di isolamento del DNA sono state descritte nella sezione 5.1 e sono il primo passo utilizzato per studiare o manipolare gli acidi nucleici. L'RNA può anche essere estratto ed è studiato per comprendere i modelli di espressione genica nelle cellule. L'RNA è naturalmente molto instabile perché gli enzimi che scompongono l'RNA sono comunemente presenti in natura. Alcuni sono addirittura secreti dalla nostra stessa pelle e sono molto difficili da inattivare. Durante l'estrazione dell'RNA, vengono utilizzati inibitori della RNasi e il trattamento speciale della vetreria per ridurre il rischio di distruzione del campione durante l'isolamento

Elettroforesi su gel

Poiché gli acidi nucleici sono ioni caricati negativamente a pH neutro o alcalino in un ambiente acquoso, possono essere spostati da un campo elettrico. L'elettroforesi su gel è una tecnica utilizzata per separare le molecole cariche in base alla dimensione e alla carica. Gli acidi nucleici possono essere separati come interi cromosomi o come frammenti. Gli acidi nucleici vengono caricati in una fessura a un'estremità di una matrice di gel, viene applicata una corrente elettrica e le molecole caricate negativamente vengono tirate verso l'estremità opposta del gel (l'estremità con l'elettrodo positivo). Le molecole più piccole si muovono attraverso i pori del gel più velocemente delle molecole più grandi, questa differenza nella velocità di migrazione separa i frammenti in base alle dimensioni. Gli acidi nucleici in una matrice gel sono invisibili finché non vengono colorati con un composto che consente loro di essere visti, come un colorante. Frammenti distinti di acidi nucleici appaiono come bande a distanze specifiche dalla parte superiore del gel (l'estremità dell'elettrodo negativo) in base alle loro dimensioni (Figura 5.15). Una miscela di molti frammenti di varie dimensioni appare come un lungo striscio, mentre il DNA genomico non tagliato è solitamente troppo grande per attraversare il gel e forma un'unica banda larga nella parte superiore del gel.

Figura 5.15 Elettroforesi su gel di DNA. Sono mostrati frammenti di DNA da sei campioni eseguiti su un gel, colorati con un colorante fluorescente e visualizzati alla luce UV. (credito: modifica del lavoro di James Jacob, Tompkins Cortland Community College)

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

I dettagli della PCR sono discussi nella sezione 5.1. Questa tecnica viene utilizzata nella clonazione del DNA per aumentare rapidamente il numero di copie di specifiche regioni del DNA.

Clonazione

In generale, la clonazione significa la creazione di una replica perfetta. Tipicamente, la parola è usata per descrivere la creazione di una copia geneticamente identica. In biologia, la ricreazione di un intero organismo viene definita "clonazione riproduttiva". Molto prima che venissero fatti tentativi per clonare un intero organismo, i ricercatori hanno imparato a copiare brevi tratti di DNA e un processo noto come clonazione molecolare.

La clonazione molecolare consente la creazione di copie multiple di geni, espressione di geni e studio di geni specifici. Per ottenere il frammento di DNA in una cellula batterica in una forma che verrà copiata o espressa, il frammento viene prima inserito in un vettore di clonazione.

UN vettore di clonazione è un piccolo pezzo di DNA che può essere mantenuto stabilmente in un organismo e nel quale può essere inserito un frammento di DNA estraneo per scopi di clonazione. Il vettore di clonazione può essere DNA prelevato da un virus, dalla cellula di un organismo superiore, oppure può essere il plasmide di un batterio. Il vettore contiene quindi caratteristiche che consentono l'inserimento o la rimozione conveniente di un frammento di DNA al o dal vettore, ad esempio trattando il vettore e il DNA estraneo con un enzima di restrizione che taglia il DNA. I frammenti di DNA così generati contengono estremità smussate o sporgenze note come estremità adesive, e il DNA vettoriale e il DNA estraneo con estremità compatibili possono quindi essere uniti insieme mediante legatura molecolare. Dopo che un frammento di DNA è stato clonato in un vettore di clonazione, può essere ulteriormente subclonato in un altro vettore progettato per un uso più specifico.

Esistono molti tipi di vettori di clonazione, ma quelli più comunemente usati sono i plasmidi geneticamente modificati. La clonazione viene generalmente eseguita prima utilizzando Escherichia colie clonazione di vettori in E. coli includono plasmidi, batteriofagi (come fago e lambda), cosmidi e cromosomi artificiali batterici (BAC). Alcuni DNA, tuttavia, non possono essere mantenuti stabilmente in E. coli, per esempio frammenti di DNA molto grandi. Per questi studi possono essere utilizzati altri organismi come il lievito. I vettori di clonazione nel lievito includono i cromosomi artificiali di lievito (YAC).

Figura 5.16 Esempio di un vettore di clonazione comune.

Tutti i vettori di clonazione comunemente usati in biologia molecolare hanno caratteristiche chiave necessarie per la loro funzione, come un sito di clonazione adatto con enzimi di restrizione e un marcatore selezionabile. Altri possono avere funzionalità aggiuntive specifiche per il loro utilizzo. Per motivi di semplicità e praticità, la clonazione viene spesso eseguita utilizzando E. coli. Pertanto, i vettori di clonazione utilizzati spesso hanno elementi necessari per la loro propagazione e mantenimento in E. coli, come un funzionale origine della replicazione (ori). L'origine della replicazione di ColE1 si trova in molti plasmidi. Alcuni vettori includono anche elementi che consentono loro di essere mantenuti in un altro organismo oltre a E. coli, e questi vettori sono chiamati vettori navetta.

Sito di clonazione

Tutti i vettori di clonazione hanno caratteristiche che consentono di inserire o rimuovere comodamente un gene nel vettore. Questo potrebbe essere un sito di clonazione multipla (MCS) o polylinker, che contiene molti siti di restrizione univoci. I siti di restrizione nella MCS vengono prima scissi dagli enzimi di restrizione, quindi un gene bersaglio amplificato dalla PCR, anch'esso digerito con gli stessi enzimi, viene ligato nei vettori utilizzando la DNA ligasi. La sequenza di DNA bersaglio può essere inserita nel vettore in una direzione specifica se lo si desidera. I siti di restrizione possono essere ulteriormente utilizzati per la subclonazione in un altro vettore, se necessario.

Altri vettori di clonazione possono utilizzare la topoisomerasi invece della ligasi e la clonazione può essere eseguita più rapidamente senza la necessità di una digestione di restrizione del vettore o dell'inserto. In questo metodo di clonazione TOPO un vettore linearizzato viene attivato attaccando la topoisomerasi I alle sue estremità, e questo vettore "attivato con TOPO" può quindi accettare un prodotto PCR legando entrambe le estremità 5' del prodotto PCR, rilasciando la topoisomerasi e formando un vettore circolare nel processo. Un altro metodo di clonazione senza l'uso di digestione e ligasi del DNA è la ricombinazione del DNA, ad esempio come utilizzato nel sistema di clonazione Gateway. Il gene, una volta clonato nel vettore di clonazione (chiamato clone di ingresso in questo metodo), può essere convenientemente introdotto in una varietà di vettori di espressione mediante ricombinazione.

Enzimi di restrizione

Enzimi di restrizione (chiamate anche endonucleasi di restrizione) riconoscono specifiche sequenze di DNA e le tagliano in modo prevedibile sono prodotte naturalmente dai batteri come meccanismo di difesa contro il DNA estraneo.

Come suggerisce il nome, le endonucleasi di restrizione (o enzimi di restrizione) sono &ldquolimitato&rdquo nella loro capacità di tagliare o digerire il DNA. La restrizione che è utile ai biochimici è solitamente a palindromo Sequenza del DNA. Le sequenze palindromiche sono la stessa sequenza avanti e indietro. Alcuni esempi di palindromi: RACE CAR, CIVIC, A MAN A PLAN A CANAL PANAMA. Per quanto riguarda il DNA, ci sono 2 filamenti che corrono antiparalleli tra loro. Pertanto, il complemento inverso di un filo è identico all'altro.

Come con una parola palindroma, questo significa che la sequenza palindromica del DNA legge la stessa avanti e indietro. Nella maggior parte dei casi, la sequenza legge lo stesso in avanti su un filo e all'indietro sul filo complementare. Le RE spesso tagliano il DNA in uno schema sfalsato. Quando si esegue un taglio sfalsato in sequenza, le sporgenze sono complementari (Figura 5.17).

Figura 5.17 Sequenze di riconoscimento degli enzimi di restrizione. In questo (a) sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione a sei nucleotidi, si noti che la sequenza di sei nucleotidi legge lo stesso nella direzione da 5&prime a 3&prime su un filamento come fa nella direzione da 5&prime a 3&prime sul filamento complementare. Questo è noto come palindromo. (b) L'enzima di restrizione fa rotture nei filamenti di DNA e (c) il taglio nel DNA provoca "estremità appiccicose". Un altro pezzo di DNA tagliato su entrambe le estremità dallo stesso enzima di restrizione potrebbe attaccarsi a queste estremità appiccicose ed essere inserito nello spazio creato da questo taglio.

I biologi molecolari tendono anche a usare queste speciali forbici molecolari che riconoscono i palindromi di 6 o 8. Usando 6 taglienti o 8 taglienti, le sequenze si verificano per lunghi tratti raramente, ma abbastanza spesso da essere utili.

EcoRI genera appiccicoso di estremità coesive piccolo genera estremità smussate

Figura 5.18 Enzimi di restrizione. Gli enzimi di restrizione riconoscono le sequenze palindromiche nel DNA e idrolizzano i legami fosfodiestere covalenti del DNA per lasciare estremità "appiccicose/coesive" o "smussate". Questa distinzione nel taglio è importante perché un EcoRI l'estremità adesiva può essere utilizzata per abbinare un pezzo di DNA tagliato con lo stesso enzima per incollarli o legarli di nuovo insieme. Mentre le endonucleasi tagliano il DNA, ligasi riunirli di nuovo insieme. DNA digerito con EcoRI può essere rilegato insieme con un altro pezzo di DNA digerito con EcoRI, ma non a un pezzo digerito con piccolo. Un altro taglierino smussato è EcoRV con una sequenza di riconoscimento di GAT | ATC.

Marcatore selezionabile

Un marcatore selezionabile viene trasportato dal vettore per consentire la selezione di cellule trasformate positivamente. La resistenza agli antibiotici è spesso usata come marcatore, un esempio è il gene della beta-lattamasi, che conferisce resistenza al gruppo delle penicilline di antibiotici beta-lattamici come l'ampicillina. Alcuni vettori contengono due marcatori selezionabili, ad esempio il plasmide pACYC177 ha sia il gene di resistenza all'ampicillina che quello alla kanamicina. I vettori navetta progettati per essere mantenuti in due diversi organismi possono anche richiedere due marcatori selezionabili, sebbene alcuni marcatori selezionabili come la resistenza alla zeocina e all'igromicina B siano efficaci in diversi tipi di cellule. Possono essere utilizzati anche marcatori di selezione auxotrofi che consentono a un organismo auxotrofico di crescere in un mezzo di crescita minimo, esempi di questi sono LEU2 e URA3 che vengono utilizzati con i loro corrispondenti ceppi auxotrofici di lievito.

Un altro tipo di marcatore selezionabile consente la selezione positiva del plasmide con gene clonato. Ciò può comportare l'uso di un gene letale per le cellule ospiti, come le tossine barnase, Ccda e parD/parE. Questo in genere funziona interrompendo o rimuovendo il gene letale durante il processo di clonazione e i cloni non riusciti in cui il gene letale rimane ancora intatto ucciderebbero le cellule ospiti, quindi vengono selezionati solo i cloni di successo.

Geni reporter

I geni reporter vengono utilizzati in alcuni vettori di clonazione per facilitare lo screening dei cloni di successo utilizzando le caratteristiche di questi geni che consentono di identificare facilmente il clone di successo. Tali caratteristiche presenti nei vettori di clonazione possono essere le lacZ&frammento alfa per &complementazione alfa nella selezione bianco-blu e/o gene marcatore o geni reporter in cornice con e fiancheggiando la MCS per facilitare la produzione di proteine ​​di fusione. Esempi di partner di fusione che possono essere utilizzati per lo screening sono la proteina fluorescente verde (GFP) e la luciferasi.

Figura 5.19 Geni reporter. In questo diagramma, la proteina di fluorescenza verde viene utilizzata come gene reporter per studiare le sequenze regolatorie a monte.

Elementi per l'espressione

Se si desidera l'espressione del gene bersaglio, allora anche un vettore di clonazione deve contenere elementi adatti per l'espressione del gene bersaglio clonato, inclusi un promotore e un sito di legame ribosomiale (RBS). Il DNA bersaglio può essere inserito in un sito che è sotto il controllo di un particolare promotore necessario per l'espressione del gene bersaglio nell'ospite scelto. Dove è presente il promotore, l'espressione del gene è preferibilmente strettamente controllata e inducibile in modo che le proteine ​​vengano prodotte solo quando richiesto. Alcuni promotori comunemente usati sono il T7 e lacca promotori. La presenza di un promotore è necessaria quando si utilizzano tecniche di screening come la selezione blu-bianco.

A volte vengono utilizzati vettori di clonazione senza promotore e RBS per la sequenza di DNA clonata, ad esempio quando si clonano geni i cui prodotti sono tossici per E. coli cellule. Anche il promotore e l'RBS per la sequenza di DNA clonata non sono necessari quando si crea per la prima volta una libreria di cloni genomici o cDNA poiché i geni clonati sono normalmente subclonati in un vettore di espressione più appropriato se è richiesta la loro espressione.

Tipi di vettori di clonazione

È disponibile un gran numero di vettori di clonazione e la scelta del vettore corretto può dipendere da una serie di fattori, come la dimensione dell'inserto, il numero di copie e il metodo di clonazione. Inserti di DNA di grandi dimensioni potrebbero non essere mantenuti stabilmente in un vettore di clonazione generale, specialmente per quelli con un numero di copie elevato, pertanto la clonazione di frammenti di grandi dimensioni potrebbe richiedere un vettore di clonazione più specializzato.

I plasmidi replicano autonomamente il DNA circolare extra-cromosomico. Sono i vettori di clonazione standard e quelli più comunemente usati. La maggior parte dei plasmidi generici può essere utilizzata per clonare un inserto di DNA di dimensioni fino a 15 kb. Molti plasmidi hanno un numero di copie elevato, ad esempio pUC19 che ha un numero di copie di 500-700 copie per cellula, e un numero di copie elevato è utile poiché produce una maggiore resa di plasmide ricombinante per la successiva manipolazione. Tuttavia, i plasmidi a basso numero di copie possono essere preferibilmente usati in certe circostanze, per esempio, quando la proteina del gene clonato è tossica per le cellule.

batteriofago

I batteriofagi più comunemente usati per la clonazione sono il fago lambda (&lambda) e il fago M13. Esiste un limite superiore alla quantità di DNA che può essere impacchettato in un fago (un massimo di 53 kb). Il genoma medio del fago lambda è di circa 48,5 kb (Figura 5.20). Pertanto, per consentire l'inserimento di DNA estraneo nel DNA fagico, i vettori di clonazione fagica potrebbero dover eliminare alcuni dei loro geni non essenziali per fare spazio al DNA estraneo.

Esiste anche un limite di dimensione inferiore per il DNA che può essere impacchettato in un fago e il DNA vettoriale troppo piccolo non può essere adeguatamente impacchettato nel fago. Questa proprietà può essere utilizzata per la selezione: il vettore senza inserimento potrebbe essere troppo piccolo, quindi solo i vettori con inserimento possono essere selezionati per la propagazione.

Figura 5.20 Fago lambda. (A) Rappresentazione schematica del genoma circolare del fago lambda (B) Diagramma della particella infettiva del fago lambda e (C) Micrografia elettronica del relativo batteriofago, vibriofago VvAWI. La barra indica una lunghezza di 50 nm.

I cosmidi sono plasmidi che incorporano un segmento di batteriofago e DNA lambda che ha i siti terminali coesivi (cos) che contiene elementi necessari per confezionare il DNA in particelle &lambda. Viene normalmente utilizzato per clonare grandi frammenti di DNA tra 28 e 45 Kb.

Cromosoma artificiale batterico

La dimensione dell'inserto fino a 350 kb può essere clonata nel cromosoma artificiale batterico (BAC). I BAC sono mantenuti in E. coli con un numero di copie di solo 1 per cella. I BAC sono stati spesso utilizzati per sequenziare il genoma degli organismi in progetti genomici, incluso il Progetto Genoma Umano. Un breve pezzo del DNA dell'organismo viene amplificato come inserto nei BAC e quindi sequenziato. Infine, le parti in sequenza vengono riorganizzate in silicone, con conseguente sequenza genomica dell'organismo. I BAC sono stati in gran parte sostituiti in questa capacità con metodi di sequenziamento più veloci e meno laboriosi come il sequenziamento shotgun dell'intero genoma e ora, più recentemente, il sequenziamento di nuova generazione.

Cromosoma artificiale del lievito

I cromosomi artificiali di lievito vengono utilizzati come vettori per clonare frammenti di DNA di dimensioni superiori a 1 mega base (1 Mb = 1000 kb = 1.000.000 di basi). Sono utili nella clonazione di frammenti di DNA più grandi come richiesto nella mappatura dei genomi come nel progetto del genoma umano. Contiene una sequenza telomerica, una sequenza che si replica autonomamente (caratteristiche necessarie per replicare i cromosomi lineari nelle cellule di lievito). Questi vettori contengono anche siti di restrizione adatti per clonare DNA estraneo e geni da utilizzare come marcatori selezionabili.

Cromosoma artificiale umano

I cromosomi artificiali umani possono essere potenzialmente utili come vettori di trasferimento genico per la consegna genica nelle cellule umane e come strumento per studi di espressione e determinazione della funzione cromosomica umana. Può trasportare frammenti di DNA molto grandi (non esiste un limite massimo di dimensione per scopi pratici), quindi non ha il problema della limitata capacità di clonazione di altri vettori, ed evita anche possibili mutagenesi inserzionali causate dall'integrazione nei cromosomi dell'ospite da parte di virus vettore.

Anche i vettori virali animali e vegetali che infettano le cellule vegetali e animali sono stati manipolati per introdurre geni estranei nelle cellule vegetali e animali. La naturale capacità dei virus di adsorbire le cellule, introdurre il loro DNA e replicarsi li ha resi veicoli ideali per trasferire DNA estraneo nelle cellule eucariotiche in coltura. Un vettore basato sul virus Simian 40 (SV40) è stato utilizzato nel primo esperimento di clonazione che coinvolge cellule di mammifero. Un certo numero di vettori basati su altri tipi di virus come Adenovirus e Papilloma virus sono stati utilizzati per clonare geni nei mammiferi. Attualmente, i vettori retrovirali sono popolari per la clonazione di geni nelle cellule di mammifero. In caso di trasformazione delle piante, virus tra cui il virus del mosaico del cavolfiore, il virus del mosaico del tabacco e i virus Gemini sono stati utilizzati con scarso successo.

Riepilogo della clonazione del DNA

La Figura 5.21 fornisce un riepilogo dei metodi di clonazione di base più ampiamente utilizzati nei laboratori di biochimica. Il DNA estraneo viene isolato o amplificato mediante PCR per ottenere materiale sufficiente per la procedura di clonazione. Il DNA viene purificato e tagliato con enzimi di restrizione, quindi miscelato con un vettore che è stato tagliato con gli stessi enzimi di restrizione. Il DNA può quindi essere ricucito insieme con la DNA ligasi. Il DNA può quindi essere trasformato in un sistema ospite, spesso batteri, per far crescere grandi quantità del plasmide contenente il DNA clonato.

Il patterning dei frammenti di restrizione e il sequenziamento del DNA possono essere utilizzati per convalidare il materiale clonato.

Figura 5.21 Diagramma che mostra le fasi principali della clonazione.

Per un video tutorial sulla clonazione del DNA, visita: HHMI - BioInteractive

I plasmidi con DNA estraneo inserito al loro interno sono chiamati molecole di DNA ricombinante perché contengono nuove combinazioni di materiale genetico. Le proteine ​​prodotte da molecole di DNA ricombinante sono chiamate proteine ​​ricombinanti. Non tutti i plasmidi ricombinanti sono in grado di esprimere geni. I plasmidi possono anche essere progettati per esprimere le proteine ​​solo se stimolati da determinati fattori ambientali, in modo che gli scienziati possano controllare l'espressione delle proteine ​​ricombinanti.

Clonazione riproduttiva

La clonazione riproduttiva è un metodo utilizzato per creare un clone o un copia identica di un intero organismo multicellulare. La maggior parte degli organismi pluricellulari si riproduce per via sessuale, che comporta l'apporto di DNA da due individui (genitori), rendendo impossibile generare una copia identica o un clone di uno dei due genitori. I recenti progressi della biotecnologia hanno reso possibile clonare in modo riproduttivo i mammiferi in laboratorio.

La riproduzione sessuale naturale prevede l'unione, durante la fecondazione, di uno spermatozoo e di un ovulo. Ciascuno di questi gameti è aploide, nel senso che contengono un set di cromosomi nei loro nuclei. La cellula risultante, o zigote, è quindi diploide e contiene due serie di cromosomi. Questa cellula si divide mitoticamente per produrre un organismo multicellulare. Tuttavia, l'unione di due cellule qualsiasi non può produrre uno zigote vitale ci sono componenti nel citoplasma della cellula uovo che sono essenziali per lo sviluppo precoce dell'embrione durante le sue prime divisioni cellulari. Senza queste disposizioni, non ci sarebbe alcuno sviluppo successivo. Pertanto, per produrre un nuovo individuo, sono necessari sia un complemento genetico diploide che un citoplasma dell'uovo. L'approccio alla produzione di un individuo clonato artificialmente consiste nel prendere l'uovo di un individuo e rimuovere il nucleo aploide. Quindi un nucleo diploide da una cellula corporea di un secondo individuo, il donatore, viene inserito nella cellula uovo. L'uovo viene quindi stimolato a dividersi in modo che lo sviluppo proceda. Sembra semplice, ma in realtà sono necessari molti tentativi prima che ciascuno dei passaggi venga completato con successo.

Il primo animale agricolo clonato fu Dolly, una pecora nata nel 1996. Il tasso di successo della clonazione riproduttiva all'epoca era molto basso. Dolly visse per sei anni e morì per un tumore ai polmoni (Figura 5.22). Si ipotizzava che poiché il DNA cellulare che ha dato origine a Dolly proveniva da un individuo più anziano, l'età del DNA potrebbe aver influenzato la sua aspettativa di vita. Dopo Dolly, sono state clonate con successo diverse specie di animali (come cavalli, tori e capre).

Ci sono stati tentativi di produrre embrioni umani clonati come fonti di cellule staminali embrionali. Nella procedura, il DNA di un essere umano adulto viene introdotto in una cellula uovo umana, che viene quindi stimolata a dividersi. La tecnologia è simile a quella utilizzata per produrre Dolly, ma l'embrione non viene mai impiantato in una madre surrogata. Le cellule prodotte sono chiamate cellule staminali embrionali perché hanno la capacità di svilupparsi in molti tipi diversi di cellule, come le cellule muscolari o nervose. Le cellule staminali potrebbero essere utilizzate per ricercare e infine fornire applicazioni terapeutiche, come la sostituzione dei tessuti danneggiati. Il vantaggio della clonazione in questo caso è che le cellule utilizzate per rigenerare nuovi tessuti sarebbero una perfetta corrispondenza con il donatore del DNA originale. Ad esempio, un paziente affetto da leucemia non richiederebbe un fratello con un tessuto compatibile per un trapianto di midollo osseo.

Figura 5.22 La pecora Dolly è stato il primo animale agricolo ad essere clonato. Per creare Dolly, il nucleo è stato rimosso da una cellula uovo di un donatore. L'uovo enucleato è stato posto accanto all'altra cella, quindi sono stati scioccati per fondersi. Sono stati scioccati di nuovo per iniziare la divisione. Le cellule sono state lasciate dividersi per diversi giorni fino a raggiungere uno stadio embrionale precoce, prima di essere impiantate in una madre surrogata.

Perché Dolly era un Finn-Dorset e non una pecora scozzese Blackface?

Perché anche se la cellula originale proveniva da una pecora Blackface scozzese e la madre surrogata era una Blackface scozzese, il DNA proveniva da un Finn-Dorset.

Ingegneria genetica

L'utilizzo della tecnologia del DNA ricombinante per modificare il DNA di un organismo per ottenere tratti desiderabili è chiamato ingegneria genetica. L'aggiunta di DNA estraneo sotto forma di vettori di DNA ricombinante generati dalla clonazione molecolare è il metodo più comune di ingegneria genetica. Un organismo che riceve il DNA ricombinante è chiamato a organismo geneticamente modificato (OGM). Se il DNA estraneo che viene introdotto proviene da una specie diversa, l'organismo ospite viene chiamato Transgenico. Batteri, piante e animali sono stati geneticamente modificati dall'inizio degli anni '70 per scopi accademici, medici, agricoli e industriali.

Guarda questo breve video che spiega come gli scienziati creano un animale transgenico.

Sebbene i metodi classici per studiare la funzione dei geni iniziassero con un dato fenotipo e determinassero la base genetica di quel fenotipo, le tecniche moderne consentono ai ricercatori di iniziare a livello di sequenza del DNA e chiedersi: &ldquoCosa fa questo gene o elemento del DNA?&rdquo Questa tecnica , chiamato genetica inversa, ha portato a invertire la metodologia genetica classica. Un esempio di questo metodo è analogo al danneggiamento di una parte del corpo per determinarne la funzione. Un insetto che perde un'ala non può volare, il che significa che la funzione dell'ala è il volo. Il metodo genetico classico confronta insetti che non possono volare con insetti che possono volare e osserva che gli insetti non volanti hanno perso le ali. Allo stesso modo, in un approccio di genetica inversa, la mutazione o l'eliminazione dei geni fornisce ai ricercatori indizi sulla funzione dei geni. In alternativa, la genetica inversa può essere utilizzata per far sì che un gene si sovraesprima per determinare quali effetti fenotipici possono verificarsi.

Tecnologia CRISPR

CRISPR sta per brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziatee rappresenta una famiglia di sequenze di DNA che si trovano all'interno dei genomi di organismi procarioti come batteri e archaea. Queste sequenze derivano da frammenti di DNA di batteriofagi che hanno precedentemente infettato il procariota e vengono utilizzate per rilevare e distruggere il DNA di fagi simili durante le infezioni successive. Quindi queste sequenze giocano un ruolo chiave nel sistema di difesa antivirale dei procarioti.

5.23 Struttura cristallina di un complesso di sorveglianza guidato da RNA CRISPR, Cascade, legato a un bersaglio ssDNA. Sistema CRISPR Subunità proteiche a cascata CasA, CasB, CasC, CasD e CasE (ciano) legate all'RNA CRISPR (verde) e al DNA virale (rosso) basate su PDB 4QYZ e rese con PyMOL.

Cas9 (o "proteina 9 associata a CRISPR") è un enzima che utilizza le sequenze CRISPR come guida per riconoscere e scindere specifici filamenti di DNA che sono complementari alla sequenza CRISPR. Gli enzimi Cas9 insieme alle sequenze CRISPR costituiscono la base di una tecnologia nota come CRISPR-Cas9 che può essere utilizzata per modificare i geni all'interno degli organismi. Questo processo di editing ha un'ampia varietà di applicazioni, tra cui la ricerca biologica di base, lo sviluppo di prodotti biotecnologici e il trattamento delle malattie.

Figura 5.24 Schema del meccanismo di difesa antivirale procariotico CRISPR.

Il sistema CRISPR-Cas è un sistema immunitario procariotico che conferisce resistenza a elementi genetici estranei come quelli presenti all'interno di plasmidi e fagi che fornisce una forma di immunità acquisita. L'RNA che ospita la sequenza spaziatrice aiuta le proteine ​​Cas (associate a CRISPR) a riconoscere e tagliare il DNA patogeno estraneo. Altre proteine ​​Cas guidate da RNA tagliano l'RNA estraneo. I CRISPR si trovano in circa il 50% dei genomi batterici sequenziati e quasi nel 90% degli archei sequenziati.


4.3. La reazione a catena della polimerasi (PCR)

In sostanza, la clonazione del DNA si traduce nella purificazione di un singolo frammento di DNA da una complessa miscela di molecole di DNA. La clonazione è una tecnica potente e il suo impatto sulla nostra comprensione di geni e genomi è stato incommensurabile. La clonazione, tuttavia, presenta uno svantaggio principale: è una procedura che richiede tempo e, in parte, difficile. Occorrono diversi giorni per eseguire le manipolazioni necessarie per inserire frammenti di DNA in un vettore di clonazione e quindi introdurre le molecole legate nelle cellule ospiti e selezionare i ricombinanti. Se la strategia sperimentale prevede la generazione di una grande libreria di cloni, seguita dallo screening della libreria per identificare un clone che contiene un gene di interesse (vedi Nota tecnica 4.3), potrebbero essere necessarie diverse settimane o addirittura mesi per completare il progetto.

Riquadro 4.3

Lavorare con una libreria clone. Collezioni di cloni utilizzate come fonte di geni e altri segmenti di DNA. Le librerie di cloni sono state utilizzate nella ricerca in biologia molecolare per molti anni e la loro importanza si estende ben oltre il loro ruolo di punto di partenza per (altro.)

La PCR integra la clonazione del DNA in quanto consente di ottenere lo stesso risultato - purificazione di un frammento di DNA specificato - ma in un tempo molto più breve, forse solo poche ore (Saiki et al., 1988). La PCR è complementare, non sostitutiva, alla clonazione perché ha i suoi limiti, il più importante dei quali è la necessità di conoscere la sequenza di almeno una parte del frammento da purificare. Nonostante questo vincolo, la PCR ha acquisito un'importanza centrale in molte aree della ricerca in biologia molecolare. Esamineremo prima la tecnica e poi esamineremo le sue applicazioni.

4.3.1. Esecuzione di una PCR

La PCR risulta nella copia ripetuta di una regione selezionata di una molecola di DNA (vedi Figura 4.3). A differenza della clonazione, la PCR è una reazione in provetta e non prevede l'utilizzo di cellule viventi: la copiatura non è effettuata da enzimi cellulari ma dalla DNA polimerasi purificata e termostabile di T. aquaticus (Sezione 4.1.1). Il motivo per cui è necessario un enzima termostabile diventerà chiaro quando esamineremo più in dettaglio gli eventi che si verificano durante la PCR.

Per eseguire un esperimento di PCR, il DNA bersaglio viene miscelato con Taq DNA polimerasi, una coppia di primer oligonucleotidici e una fornitura di nucleotidi. La quantità di DNA bersaglio può essere molto piccola perché la PCR è estremamente sensibile e funzionerà con una singola molecola di partenza. I primer sono necessari per avviare le reazioni di sintesi del DNA che saranno effettuate dal Taq polimerasi (vedi Figura 4.6). Devono attaccarsi al DNA bersaglio su entrambi i lati del segmento che deve essere copiato, le sequenze di questi siti di attacco devono quindi essere conosciute in modo da poter sintetizzare i primer delle sequenze appropriate.

La reazione viene avviata riscaldando la miscela a 94 ଌ. A questa temperatura i legami idrogeno che tengono insieme i due polinucleotidi della doppia elica si rompono, quindi il DNA bersaglio si denatura in molecole a singolo filamento (Figura 4.28). La temperatura viene quindi ridotta a 50� ଌ, il che si traduce in una certa ricongiunzione dei singoli filamenti del DNA bersaglio, ma consente anche ai primer di attaccarsi alle loro posizioni di ricottura. La sintesi del DNA può ora iniziare, quindi la temperatura viene aumentata a 72 ଌ, l'optimum per Taq polimerasi. In questa prima fase della PCR, viene sintetizzata una serie di ‘prodotti lunghi’ da ciascun filamento del DNA bersaglio. Questi polinucleotidi hanno estremità 5′ identiche ma estremità 3′ casuali, quest'ultima che rappresenta posizioni in cui la sintesi del DNA termina per caso. Quando il ciclo di denaturazione-ricottura-sintesi viene ripetuto, i prodotti lunghi fungono da modelli per la nuova sintesi del DNA, dando origine a ‘prodotti corti’ le cui estremità 5′ e 3′ sono entrambe fissate dalle posizioni di ricottura del primer ( Figura 4.29). Nei cicli successivi, il numero di prodotti corti si accumula in modo esponenziale (raddoppiando durante ogni ciclo) fino a quando uno dei componenti della reazione si esaurisce. Ciò significa che dopo 30 cicli, ci saranno oltre 250 milioni di prodotti corti derivati ​​da ciascuna molecola di partenza. In termini reali, ciò equivale a diversi microgrammi di prodotto PCR da pochi nanogrammi o meno di DNA bersaglio.

Figura 4.28

La prima fase di una PCR. Vedere il testo per i dettagli.

Figura 4.29

La sintesi dei prodotti ‘short’ in una PCR. I prodotti del primo ciclo della Figura 4.28 sono mostrati in alto. Il ciclo successivo di denaturazione-ricottura-sintesi porta a quattro prodotti, due dei quali identici ai prodotti del primo ciclo (altro.)

I risultati di una PCR possono essere determinati in vari modi.Di solito, i prodotti vengono analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio, che rivelerà una singola banda se la PCR ha funzionato come previsto e ha amplificato un singolo segmento del DNA bersaglio (Figura 4.30). In alternativa, è possibile determinare la sequenza del prodotto, utilizzando le tecniche descritte nella Sezione 6.1.1.

Figura 4.30

Analisi dei risultati di una PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. La PCR è stata eseguita in una provetta per microcentrifuga. Un campione viene caricato nella corsia 2 di un gel di agarosio. La corsia 1 contiene marcatori di dimensioni del DNA e la corsia 3 contiene un campione di una PCR eseguita da un collega. (Di più. )

4.3.2. Le applicazioni della PCR

La PCR è una procedura così semplice che a volte è difficile capire come possa essere diventata così importante nella ricerca moderna. Per prima cosa ci occuperemo dei suoi limiti. Per sintetizzare primer che si riassoceranno nelle posizioni corrette, è necessario conoscere le sequenze delle regioni di confine del DNA da amplificare. Ciò significa che la PCR non può essere utilizzata per purificare frammenti di geni o altre parti di un genoma che non sono mai state studiate prima. Un secondo vincolo è la lunghezza del DNA che può essere copiato. Le regioni fino a 5 kb possono essere amplificate senza troppe difficoltà e sono possibili amplificazioni più lunghe - fino a 40 kb - utilizzando modifiche della tecnica standard. Tuttavia, i frammenti di 𾄀 kb necessari per i progetti di sequenziamento del genoma non sono raggiungibili mediante PCR.

Quali sono i punti di forza della PCR? Primario tra questi è la facilità con cui i prodotti che rappresentano un singolo segmento del genoma possono essere ottenuti da un numero di campioni di DNA diversi. Incontreremo un importante esempio di ciò nel prossimo capitolo quando esamineremo come i marcatori del DNA sono tipizzati nei progetti di mappatura genetica (Sezione 5.2.2). La PCR viene utilizzata in modo simile per lo screening dei campioni di DNA umano per le mutazioni associate a malattie genetiche come la talassemia e la fibrosi cistica. Costituisce anche la base del profilo genetico, in cui vengono tipizzate le variazioni nella lunghezza dei microsatelliti (vedi Figura 2.25).

Una seconda importante caratteristica della PCR è la sua capacità di lavorare con minuscole quantità di DNA iniziale. Ciò significa che la PCR può essere utilizzata per ottenere sequenze dalle tracce di DNA presenti in capelli, macchie di sangue e altri campioni forensi, e da ossa e altri resti conservati nei siti archeologici. Nella diagnosi clinica, la PCR è in grado di rilevare la presenza di DNA virale molto prima che il virus abbia raggiunto i livelli necessari per avviare una risposta alla malattia. Ciò è particolarmente importante nell'identificazione precoce dei tumori indotti da virus perché significa che i programmi di trattamento possono essere avviati prima che il cancro si stabilisca.

Quanto sopra sono solo alcune delle applicazioni della PCR. La tecnica è ora una componente importante del kit di strumenti del biologo molecolare e scopriremo molti altri esempi del suo utilizzo nello studio dei genomi man mano che avanziamo nei restanti capitoli di questo libro.


Strategie per la terapia genica

In questa recensione, la terapia genica è utilizzata come sinonimo di terapia genica delle cellule somatiche rispetto alla terapia genica della linea germinale. La distinzione sta nel fatto che la terapia genica delle cellule somatiche prende di mira le cellule somatiche. Il trasferimento genico ei suoi effetti terapeutici (o deleteri) terminano quando l'organismo muore. Tutti i protocolli di terapia genica clinica approvati fino ad oggi comportano la terapia genica delle cellule somatiche. Nella terapia genica della linea germinale, la manipolazione genetica passa alla progenie. Creazione di animali privi di un certo gene (cioè. , gene knockout animali) viene sempre più utilizzato nel lavoro sperimentale per studiare il significato funzionale di un determinato prodotto genico. Il potere di un tale approccio genetico per decifrare i meccanismi alla base del dolore patologico a fini sperimentali è chiaro, tuttavia, l'applicazione della terapia genica della linea germinale per la creazione di organismi che non svilupperanno mai dolore patologico non è né desiderabile dal punto di vista terapeutico né eticamente accettabile. La terapia genica tenta di regolare l'espressione di una proteina bersaglio basandosi sulla nostra comprensione di come le cellule regolano l'espressione genica. Ci sono sei livelli generali di regolazione genica negli eucarioti, 11 molti dei quali sono potenzialmente suscettibili di controllo artificiale e quindi potenzialmente utili per la terapia genica. Questi livelli includono il controllo trascrizionale, il controllo dell'elaborazione dell'RNA, il controllo del trasporto dell'RNA, il controllo della degradazione dell'mRNA, il controllo della traduzione e il controllo dell'attività proteica. In teoria, ognuno di questi punti di regolazione genica, da solo o in combinazione, può essere preso di mira dalla terapia genica. Finora, l'applicazione pratica della terapia genica è stata limitata principalmente all'espressione di una proteina carente o difettosa da parte di una cassetta di espressione genica autonoma (cioè. , una terapia sostitutiva con prodotti genici). Questo approccio è più spesso visto nella terapia genica per una malattia monogenica (per esempio. , deficit di adenosina adeaminasi e fibrosi cistica). La strategia di sovraespressione per la gestione del dolore potrebbe potenzialmente mirare a bersagli antinocicettivi come i recettori dell'acetilcolina, dei cannabinoidi, degli oppioidi e della serotonina. L'espressione efficace del prodotto proteico funzionale richiede il trasferimento e l'espressione di un gene che codifica l'intera proteina bersaglio funzionale, il che si ottiene meglio con la tecnologia del vettore virale. Le tecnologie alternative in grado di trasferire un DNA di grandi dimensioni includono la pistola genica per l'iniezione diretta di costrutti plasmidici nei tessuti bersaglio 17 e una trasfezione mediata dal vettore lipidico di costrutti plasmidici e un assorbimento del complesso proteina-plasmide virale. 18 Una recente revisione discute questi e altri sistemi di consegna del DNA sintetico. 19

Una seconda strategia già in studi clinici attivi è un abbattimento mediato da oligonucleotidi antisenso dei livelli di proteine ​​bersaglio presumibilmente attraverso una maggiore degradazione dell'mRNA.cioè. , una terapia di delezione del prodotto genico). Questa strategia di abbattimento mira a bersagli che causano malattie o potenziali pronocicettivi, come ad esempio n Recettori -metil-d-aspartato, protein chinasi C e recettori neurochinina 1. La somministrazione di un breve oligonucleotide di 18-20 mer con una sequenza complementare al gene che codifica per la proteina bersaglio determina una diminuzione dei livelli proteici. Sebbene i meccanismi precisi responsabili del knockdown antisenso rimangano sconosciuti, sono stati proposti l'arresto traslazionale causato dall'attività di uno specifico enzima cellulare (RNAse H)-mediata dalla degradazione dell'mRNA ibrido a doppio filamento e l'arresto trascrizionale attraverso l'interferenza con lo svolgimento del gene a doppio filamento. Questo approccio è limitato in quanto la terapia mediata da oligonucleotidi antisenso tenta la downregulation delle proteine. Pertanto, solo gli obiettivi pronocicettivi sono suscettibili di intervento terapeutico. Oltre all'approccio oligonucleotidico antisenso, il knockdown del bersaglio proteico può essere ottenuto utilizzando un vettore virale progettato per trascrivere l'mRNA anche nell'orientamento antisenso.

Un approccio parallelo per l'espressione di molecole antinocicettive diffuse attraverso il trapianto di ex vivo le cellule trasdotte di nuovo nell'organismo intatto è un approccio interessante alla terapia con prodotti genici, ma non viene discusso in questa recensione. In teoria, le cellule del paziente potrebbero essere raccolte, ingegnerizzate per produrre molecole antinocicettive e successivamente trapiantate nel sistema nervoso centrale (SNC), eliminando i problemi immunologici associati agli xenotrapianti. Ulteriori dettagli su questo approccio possono essere trovati in un'eccellente recensione di Czech e Sagen. 20

Strumenti per la terapia genica

La terapia genica, in contrasto con la terapia farmacologica convenzionale, mira al DNA o all'RNA per raggiungere il suo obiettivo terapeutico. Che si tratti del trasferimento di un breve segmento di DNA (metodo dell'oligonucleotide antisenso) o di cDNA a lunghezza intera che codifica l'intera proteina funzionale, la fase iniziale della terapia genica dipende dal trasferimento riuscito del "farmaco mirato al gene". In questa sezione vengono discusse due specifiche tecniche di trasferimento genico delle cellule somatiche, il vettore virale e il metodo degli oligonucleotidi antisenso, poiché questi approcci rappresentano, a nostro avviso, tecnologie più vicine alle applicazioni cliniche umane. I vantaggi e gli svantaggi dei due metodi principali sono riassunti nella tabella 1. La limitazione dello spazio preclude la discussione di altri approcci al trasferimento di geni (prodotto), inclusi ribozimi, pistola del gene 21, 17 e trapianto di cellule mirate al gene. 20Concentriamo la nostra discussione sui metodi che influiscono sugli obiettivi del SNC. La stessa metodologia potrebbe essere applicata a nuovi bersagli periferici coinvolti nel dolore, come gli assoni e i corpi cellulari del sistema nervoso autonomo e periferico, e bersagli del sistema non nervoso come le cellule epiteliali responsabili della meccano-trasduzione alle terminazioni nervose libere . Il nostro intento non è quello di minimizzare la potenziale utilità dei bersagli periferici, ma di concentrarci sui bersagli del SNC, in particolare nel midollo spinale, perché tali bersagli dovrebbero essere suscettibili di terapia focale attraverso un intervento intratecale diretto. La terapia focale è altamente auspicabile perché il rischio di effetti collaterali indesiderati può avere gravi conseguenze quando si manipolano bersagli genetici.

Vettori virali

Sviluppo di vettori ricombinanti.

I metodi tradizionali di trasferimento genico, come la precipitazione del fosfato di calcio, l'elettroporazione o varie tecniche mediate da vettori lipidici, non funzionano con alta efficienza nelle cellule postmitotiche e sono per lo più poco pratici per le applicazioni del SNC. I vettori virali recentemente sviluppati forniscono un potente veicolo per un efficace trasferimento genico del SNC. 22,23 Attraverso l'evoluzione, i virus hanno acquisito la capacità di infettare e trasdurre il loro genoma nelle cellule ospiti. Il termine trasduzione si riferisce al processo mediante il quale un virus infetta una cellula ospite e ne introduce il contenuto genetico. La terapia genica basata su vettori virali sfrutta la biologia naturale del virus per trasdurre i geni esogeni nelle cellule ospiti. Il principio generale per la creazione di un vettore virale è quello di eliminare i geni non essenziali dal virus, inabilitandone la replicazione e rendendolo quindi non patogeno, pur conservando la capacità di attaccare e trasdurre il suo genoma nell'ospite. Tuttavia, rendere carente la replicazione di un virus non assicura l'eliminazione della citotossicità diretta o l'abolizione della risposta immunitaria dell'ospite causata dall'espressione di altre proteine ​​virali non critiche per la replicazione. 24Un vettore ideale per la terapia genica dovrebbe ottenere un'espressione genica stabile e regolata specificatamente per il tessuto senza suscitare la risposta immunitaria dell'ospite. 25La scelta del vettore virale da utilizzare si basa anche sulle seguenti considerazioni pratiche transgene-specifiche: (1) Qual è la dimensione del gene esogeno che si vuole trasferire? (2) La cellula bersaglio è mitoticamente attiva (per esempio. , cellule gliali) o postmitotica (per esempio. , cellule nervose)? (3) Qual è il percorso di consegna desiderato? e (4) Qual è la durata desiderata dell'intervento terapeutico?

La dimensione del gene da trasferire determina la capacità di "carico utile" richiesta del vettore virale. In generale, un virus con un genoma nativo più grande è in grado di trasportare un gene esogeno più grande. Un meccanismo di replicazione del DNA, come il sistema di replicazione a rotazione utilizzato dai concatemeri amplificati (amplicon) del virus dell'herpes simplex (HSV), consente l'amplificazione intrinseca del gene esogeno, aumentando di fatto la dose del gene. 26 Il target desiderato del trasferimento genico definisce se il vettore virale deve trasdurre cellule non in divisione. Per la terapia genica del SNC, dove il bersaglio desiderato sono più spesso le cellule nervose postmitotiche, è precluso l'uso di vettori come il virus della leucemia murina di Maloney (MMLV) e il virus adeno-associato (AAV), che hanno una capacità limitata di infettare le cellule mitoticamente silenziose. . Infine, la durata desiderata dell'espressione genica esogena specifica se è necessario un vettore virale integratore o non integratore. Trasduzione con virus integratore (per esempio. , virus dell'immunodeficienza umana [HIV]) determina l'integrazione del gene esogeno nel genoma dell'ospite, assicurando così la presenza perpetua del gene esogeno nelle generazioni future di cellule risultanti dalla mitosi. Virus non integratore (per esempio. , adenovirus e HSV) consente solo un'esistenza extracromosomica del gene esogeno, con conseguente eventuale perdita del transgene con divisione cellulare anche in circostanze ideali.

Virus a DNA, virus a RNA e retrovirus sono stati tutti utilizzati come vettori sperimentali di trasduzione genica (tabella 2). I quattro vettori virali più comunemente usati sono basati su MMLV, AAV, adenovirus e HSV. 22,27,28 L'MMLV, un retrovirus, è stato il primo ad entrare in una sperimentazione clinica umana, tuttavia, a causa della sua scarsa efficienza di trasduzione e dell'incapacità di infettare le cellule postmitotiche, l'utilità dell'MMLV per la terapia genica del SNC è limitata ad eccezione del suo uso nella trasduzione di cellule mitoticamente attive ex vivo per il successivo trapianto nel SNC. 22,29 Il retrovirus introdotto in un organismo come vettore di terapia genica comporta anche il rischio teorico di mutagenesi inserzionale. È anche possibile la ricombinazione con sequenze retrovirali stabilmente integrate presenti nel genoma umano, con conseguente creazione di un retrovirus competente per la replicazione. Nonostante questi limiti teorici, la terapia genica basata su MMLV ha dimostrato l'efficacia clinica per i pazienti con una malattia monogenica. 30 L'avvento di un vettore basato sull'HIV con la capacità di trasdurre i neuroni potrebbe aprire la strada a un ulteriore uso del retrovirus (lentivirus) anche nella terapia genica del SNC. 31

Tabella 2. Vettori virali per la terapia genica del sistema nervoso centrale *

* I vettori virali sono potenzialmente pericolosi e richiedono l'approvazione istituzionale per la biosicurezza prima dell'inizio del lavoro. I vettori incompetenti per la replicazione possono essere creati in sicurezza con precauzioni di livello di biosicurezza II non diverse dal lavoro di routine su cellule di origine umana. Informazioni generali sul livello di biosicurezza raccomandato per il lavoro sul DNA ricombinante possono essere trovate su http://www4.od.nih.gov/oba/ (National Institutes of Health, accesso 12 aprile 2001).

Il DNA inserito nel vettore amplicone del virus herpes simplex (HSV) viene replicato come un concatemero testa-coda di circa 150 kb, che si avvicina alle dimensioni del genoma dell'HSV wild-type. In teoria, un transgene grande quanto l'intero 150 kb dovrebbe essere trasducibile. In pratica, la limitazione della stabilità dell'amplicone a base di plasmide limita il carico utile a 15 kb. L'uso di veicoli di clonazione di grande capacità, come i cosmidi oi cromosomi artificiali di lievito, dovrebbe migliorare notevolmente la capacità di carico utile.

‡ I vettori adenovirali deleti E1, E3 (shuttle e plasmidi genitori) sono disponibili da Microbix Inc. (http://www.microbix.com, accesso 12 aprile 2001) e Quantum Biotechnologies Inc. (http://www. quantumbiotech.com, consultato il 12 aprile 2001). La creazione di un adenovirus ricombinante utilizzando i reagenti commerciali richiede il subclonaggio seguito dalla ricombinazione omologa nelle cellule HEK293. Per ottenere un adenovirus pulito è necessaria un'ulteriore centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio seguita da dialisi. Sebbene commercializzato come un "kit", la creazione di un gene di interesse per il vettore adenovirale è tecnicamente impegnativa e richiede una notevole esperienza in biologia molecolare e coltura cellulare. I servizi personalizzati per la creazione di uno specifico adenovirus ricombinante E1-, E3-deleted sono disponibili in commercio ma piuttosto costosi. Un eccellente manuale di laboratorio per la creazione di adenovirus di prima generazione può essere trovato in Ehrenbruber et al. 124 o in Graham e Prevec. 125Ulteriori riferimenti tecnici per la creazione di adenovirus ricombinanti sono disponibili sul sito Web di Microbix Inc..

§ Per adenovirus senza viscere, DNA totale (cioè. , dimensione del genoma) deve essere compreso tra 28 e 36 kb per un efficiente confezionamento in particelle virali. Per i piccoli transgeni, inclusi il promotore e i segnali di poliadenilazione, il resto dello spazio è riempito con DNA non correlato (spesso DNA -fagico) per soddisfare il requisito di dimensione minima. In teoria, cassette a più espressioni che utilizzano promotori individuali o sono concatenate dalla sequenza del sito di ingresso ribosomiale interno possono essere utilizzate al posto del DNA fagico per creare un vettore che esprime più geni terapeutici contemporaneamente. Pertanto, la capacità teorica dell'inserto può avvicinarsi a 36 kb.

∥ I reagenti per la creazione di virus adeno-associati non sono disponibili come kit. Tuttavia, i plasmidi che ospitano il virus adeno-associato (catalogo n. 37216, 68065) ​​necessari per creare costrutti di virus adeno-associati ricombinanti sono disponibili da American Type Culture Collection Inc. (http://atcc.org, accesso 12 aprile 2001) . Un buon protocollo si trova in Skulimowski e Simulski. 126

# Una serie di vettori e linee cellulari di confezionamento derivati ​​dal virus della leucemia Moleny murino è disponibile come kit da Clontech Inc. (http://www.clontech.com, accesso 12 aprile 2001). La creazione di un retrovirus murino basato sul virus della leucemia Moleny richiede la subclonazione del gene di interesse nel vettore disponibile in commercio e la trasfezione transitoria in una linea cellulare di confezionamento. Il retrovirus infettivo ma incapace di replicazione può essere raccolto dal surnatante della coltura cellulare. Il protocollo è ben documentato e tecnicamente semplice. Non siamo stati in grado di individuare un riferimento specifico che indichi il limite superiore della dimensione dell'inserto. Tuttavia, poiché i vettori del virus della leucemia di Moleny murino essenzialmente mancano dell'intero genoma virale, l'inserto che si avvicina alla dimensione del genoma virale di tipo selvatico dovrebbe essere impacchettabile. Il limite di carico utile di 5 kb elencato nella tabella è stato ottenuto dal supporto tecnico di Clontech.

** Un vettore derivato dal virus Sindbis e un DNA del virus helper possono essere acquistati da Invitrogen Inc. (http://www.invitrogen.com, accesso 12 aprile 2001). La creazione di un virus sindbis richiede il subclonaggio del gene di interesse nei vettori pSIN e in vitro trascrizione dell'RNA da entrambi i vettori pSIN e helper, seguita dalla trasfezione in una linea cellulare permissiva del rene di criceto. In vitro la trascrizione è difficile per chi non è abituato a lavorare con l'RNA. In caso contrario, la procedura descritta nel foglietto illustrativo è semplice. Abbiamo notato che la dialisi del surnatante della coltura cellulare prima dell'uso riduce la citotossicità diretta del virus Sindbis. Il virus può confezionare inserti esogeni di 3 kb, tuttavia, il carico utile è limitato dall'instabilità dell'inserto, con inserti di meno di 2 kb che mostrano la massima stabilità (vedi Huang 127). Una fonte indispensabile di informazioni per i vettori del virus α può essere trovata all'indirizzo http://www.microbiology.wustl.edu/sindbis/sinVectors (Washington University School of Medicine, Dipartimento di Microbiologia, accesso 12 aprile 2001).

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I recenti progressi nei metodi di produzione di AAV consentono la creazione di vettori ad alto titolo sostanzialmente privi di contaminazione da helper-adenovirus. 32 Diversi laboratori hanno ora confermato con successo l'espressione transgenica mediata da AAV persistente nel cervello e nel midollo spinale senza effetti citopatici, confutando l'idea tradizionale che gli AAV non siano in grado di trasdurre le cellule postmitotiche, tuttavia, la limitata capacità di inserimento di questo virus ne limita l'uso al trasferimento di piccoli transgeni .22Un ibrido adenovirus-MMLV o un costrutto adenovirus-AAV che ricopre il retrovirus o la sequenza AAV all'interno dell'adenovirus, risultando in un virus che si integra stabilmente con un'ampia gamma di ospiti, 33può essere un vettore particolarmente attraente per l'intervento genetico a lungo termine richiesto per la gestione di dolore cronico.

L'HSV è stato il primo ad offrire una grande capacità di clonazione che consente l'espressione di grandi transgeni. La sua proprietà neurotropica naturale rende questo vettore particolarmente attraente per la consegna del gene del SNC. Lo svantaggio principale è la mancanza di comprensione della complessa biologia virale che regola l'ingresso nella fase latente in cui cessa l'espressione genica virale (e presumibilmente il transgene che si vuole esprimere). Come per l'AAV, anche l'attuale requisito di un virus helper per la propagazione e la preparazione su larga scala dell'HSV ricombinante impone alcune limitazioni. Un recente imballaggio esente da virus helper basato su libreria cosmid di HSV difettoso può aggirare questa limitazione. 26L'utilizzo del cosmide, uno speciale costrutto di DNA che permette la propagazione di grossi pezzi di DNA nei batteri, permette di rappresentare l'intero genoma dell'HSV in frammenti sovrapposti, fornendo così tutta la necessaria funzione di virus helper ma senza il rischio di “ricrearsi” un virus aiutante contaminante.

Il primo gene 1 (mi1 )-deleted adenovirus, un altro virus a DNA con una capacità di clonazione rispettabile (8 kilobase [kb]), è stato un primo vettore virale sviluppato per la terapia genica. Eliminazione del virale mi1 gene ha reso la replicazione del virus carente e ha creato spazio per l'incorporazione di un transgene. Il virus non si integra, la sua biologia naturale è ben compresa e gli strumenti per costruire un virus ricombinante sono prontamente disponibili. 34, La Figura 1 descrive il processo coinvolto nella creazione di un adenovirus ricombinante di prima generazione e la sua azione su una cellula bersaglio. La terapia genica per la fibrosi cistica utilizzando l'adenovirus che esprime la proteina regolatrice del trasporto della fibrosi cistica è stata una delle prime sperimentazioni cliniche di terapia genica umana tentate. 35,36 I vettori di adenovirus continuano ad essere utilizzati in diversi protocolli clinici umani per il cancro, 37 fibrosi cistica, 38 e malattie epatiche monogeniche. 39Inizio in vivo l'esperienza con i vettori di adenovirus negli animali e nell'uomo ha rivelato una limitazione fondamentale del vettore di adenovirus di prima generazione per applicazioni a lungo termine: l'infezione virale provoca la cellula ospite e l'immunità umorale, con conseguente eliminazione delle cellule trasdotte. Nel SNC immunoprivilegiato, l'espressione del transgene mediata da adenovirus può essere rilevata fino a 2 mesi dopo l'infezione, 40 una durata rispettabile ma ancora limitante per la terapia genica a lungo termine. È stato dimostrato che successivi adenovirus che incorporano una mutazione sensibile alla temperatura nella proteina virale legante il DNA a filamento singolo 41 o che esprimono costitutivamente la proteina virale gp19K 42 provocano una sopravvivenza più lunga della cellula ospite dopo la trasduzione virale. Queste limitazioni dei vettori di adenovirus, in particolare i vettori di prima generazione, sebbene gravi per in vivo applicazioni di terapia genica, non sono di grande preoccupazione in fase sperimentale in vitro applicazioni, dove non esistono mediatori immunitari. Eliminazione successiva del virus E3 e E4 geni hanno portato a vettori di adenovirus di terza e quarta generazione con un'immunogenicità significativamente inferiore e una maggiore capacità di carico utile. 43Cancellazione di quale dei multipli E3 e E4 i prodotti genetici portano a un virus che si comporta meglio rimane sconosciuto, ma la domanda è in gran parte soppiantata dal virus "senza viscere" di nuova generazione.

Fig. 1. Creazione di adenovirus ricombinante e sua azione su un neurone bersaglio. (UN ) La ricombinazione omologa tra il plasmide genitore e il plasmide navetta (scambio di filamenti di DNA tra pezzi separati di DNA, regione ombreggiata) si traduce in un adenovirus ricombinante infettivo ma difettoso nella replicazione (esagono con proteine ​​in fibra simili ad antanae all'apice). Le linee ondulate indicano il DNA non virale del plasmide. ITR = ripetizioni terminali invertite ψ= sequenza di confezionamento ΔE1 e ΔE3 = delezione del gene precoce 1 o 3. (B ) La particella virale si attacca al recettore CAR sulla superficie della membrana ed è interiorizzata nella cellula bersaglio. Il rivestimento virale proteico viene eliminato e il transgene trasportato nel nucleo. L'RNA messaggero di senso transgene (mRNA) viene trascritto e una nuova proteina antinocicettiva sintetizzata, o l'mRNA antisenso può essere trascritto per indurre il knockdown di una proteina pronocicettiva endogena. Entrambe le strategie determinano una diminuzione del dolore.

Fig. 1. Creazione di adenovirus ricombinante e sua azione su un neurone bersaglio. (UN ) La ricombinazione omologa tra il plasmide genitore e il plasmide navetta (scambio di filamenti di DNA tra pezzi separati di DNA, regione ombreggiata) si traduce in un adenovirus ricombinante infettivo ma difettoso nella replicazione (esagono con proteine ​​in fibra simili ad antanae all'apice). Le linee ondulate indicano il DNA non virale del plasmide. ITR = ripetizioni terminali invertite ψ= sequenza di confezionamento ΔE1 e ΔE3 = delezione del gene precoce 1 o 3. (B ) La particella virale si attacca al recettore CAR sulla superficie della membrana ed è interiorizzata nella cellula bersaglio. Il rivestimento virale proteico viene eliminato e il transgene trasportato nel nucleo. L'RNA messaggero di senso transgene (mRNA) viene trascritto e una nuova proteina antinocicettiva sintetizzata, o l'mRNA antisenso può essere trascritto per indurre il knockdown di una proteina pronocicettiva endogena. Entrambe le strategie si traducono in una diminuzione del dolore.

Un adenovirus senza viscere helper-dipendente descritto di recente essenzialmente privo di tutto il genoma virale indesiderabile ci pone un passo più vicino al vettore virale ideale. L'adenovirus gutless viene creato dalla delezione di tutto il genoma virale ad eccezione della ripetizione terminale invertita e della sequenza essenziale per il confezionamento virale. 44,45 La sequenza di DNA virale rimanente nel vettore gutless è minima e simile al retrovirus o all'AAV. Lo spazio creato da questa eliminazione espande anche la capacità di carico utile del virus, in teoria, a più di 30 kilobasi di DNA. La creazione di una replicazione difettosa ma infettiva del virus gutless con contaminazione minima da virus helper dipende dall'uso della linea cellulare helper che esprime Cre-ricombinasi. 45,46 La tecnologia dipende dalla proprietà dell'enzima Cre-ricombinasi di asportare selettivamente un segmento di DNA fiancheggiato da un nucleotide specifico di 30 coppie di basi chiamato sequenza lox P. Quando un virus helper appositamente progettato con la sua sequenza affiancata da lox P viene utilizzato per creare l'adenovirus gutless helper-dipendente in una linea cellulare che esprime costitutivamente Cre-ricombinasi, l'escissione della sequenza ψ conferisce uno svantaggio selettivo. Il risultato è la creazione dell'adenovirus gutless helper-dipendente con una contaminazione minima da helper virus.

Uno studio su topi e babbuini dimostra la superiorità in vivo longevità del virus gutless rispetto all'adenovirus di prima generazione. 47,48 Non è stata osservata alcuna risposta immunitaria dimostrabile indotta da vettori. Sebbene sia ancora un passo rimosso da un sistema di consegna genica ideale a causa della creazione di una piccola quantità di contaminazione da adenovirus aiutante durante la preparazione su larga scala (< 0,1%), questo significativo progresso nella progettazione del vettore di adenovirus porta chiaramente all'applicazione clinica del vettore virale basata sulla terapia genica più vicina alla realtà.

Ostacoli negli approcci virali.

L'intervento terapeutico per il dolore richiede la consegna del gene al SNC. Sebbene i vettori virali offrano un approccio promettente per raggiungere questo obiettivo, ci sono numerosi ostacoli pratici per realizzarlo. La consegna della maggior parte dei farmaci al SNC è ostacolata dalla barriera emato-encefalica (BBB). Limitazioni farmacocinetiche simili riguardano la terapia genica. La BBB è formata da giunzioni strette tra le cellule endoteliali dei capillari ed esclude molecole maggiori di circa 600 Da. 49 Chiaramente, i vettori virali iniettati per via sistemica e l'oligonucleotide nudo sono esclusi dall'ingresso efficace nel SNC. 49,50 Sono disponibili tre metodi per aggirare questa limitazione: (1) iniezione diretta intraparenchimale o subaracnoidea di composti, (2) interruzione transitoria della BBB per consentire la permeazione dopo l'iniezione sistemica, o (3) ingresso nel SNC attraverso il trasporto che bypassa la BBB.

Il deposito diretto di particelle virali nello spazio subaracnoideo aggira le limitazioni anatomiche imposte dalla giunzione stretta endoteliale BBB. Tuttavia, un recente studio di imaging a risonanza magnetica del cervello di ratto, in cui la BBB è stata interrotta per via osmotica, indica una barriera all'accesso cellulare imposta dalla membrana basale 51 anche in assenza di BBB. Una barriera simile può impedire alle particelle virali che sono state depositate direttamente nello spazio subaracnoideo di raggiungere il midollo spinale propriamente detto e quindi limitare l'utilità dell'adenovirus con un diametro di circa 90 nm. 52 Al contrario, l'iniezione intratecale di adenovirus ha determinato un aumento significativo dell'espressione del reporter della -galattosidasi nelle cellule che circondano lo spazio subaracnoideo. 53 Non è noto se virus più piccoli come l'AAV con un diametro di 20 nm possano attraversare questa barriera della membrana basale. L'iniezione intraparenchimale diretta di adenovirus determina un'espressione robusta e affidabile del transgene nel midollo spinale propriamente detto. 52,54

L'interruzione transitoria della BBB consente agli agenti iniettati per via sistemica, compresi i vettori virali della terapia genica, di entrare nel parenchima cerebrale. È stato dimostrato che la distruzione iperosmotica del mannitolo della BBB, che è stata utilizzata clinicamente per migliorare l'ingresso di agenti chemioterapici nel cervello, migliora anche l'ingresso nel SNC di vettori virali. 55-57 In alternativa, le particelle virali possono essere trasportate nel SNC dopo il rilascio periferico dal sistema di trasporto assonale endogeno, bypassando così la BEE. Ingresso naturale di HSV nel SNC attraverso fibre nervose sensoriali dopo l'infezione periferica è noto. È stato dimostrato il trasporto sperimentale di HSV ricombinante iniettato periferico e adenovirus 58,59 e uno studio recente ha dimostrato un effetto analgesico di lunga durata dell'HSV iniettato perifericamente e trasportato centralmente progettato per esprimere proencefalina. 58In effetti, il trasporto selettivo e la trasduzione dell'HSV nei gangli sensoriali periferici e nei neuroni del midollo spinale utilizzando meccanismi di trasporto assonale possono essere ideali per una terapia genica mirata e anatomicamente ristretta per il dolore.

È stato dimostrato che l'iniezione virale diretta nello spazio subaracnoideo e l'espressione del peptide oppioide diffusibile forniscono analgesia. 60 Sebbene la produzione di virus e peptidi sia limitata allo spazio subaracnoideo ed esclusa dal midollo spinale propriamente detto, i peptidi -endorfinici si sono diffusi facilmente senza impedimenti dalla barriera anatomica delle cellule gliali marginali e hanno mostrato una prevista diminuzione reversibile al naloxone della sensibilità al dolore. Lo stesso concetto può essere esteso ad altri bersagli recettoriali non oppioidi in cui esistono agonisti o antagonisti peptidici ed espandere la possibilità della terapia genica mediata da vettori virali per il dolore attraverso l'espressione subaracnoidea diretta di peptidi diffusibili. La Figura 2 riassume diverse vie per la somministrazione del virus terapeutico.

Fig. 2. Potenziali vie di somministrazione del virus ricombinante. (1) Iniezione diretta del virus (esagoni) nello spazio subaracnoideo, tuttavia, l'ingresso nel midollo spinale vero e proprio è limitato a causa della barriera di diffusione delle cellule gliali marginali. (2) Iniezione nella periferia e trasporto di nuovo nel sistema nervoso centrale (SNC particolarmente efficace per il virus dell'herpes simplex). (3) Iniezione nel cervello con trasporto retrogrado (lungo la via ascendente) o anterogrado (lungo la via discendente) al midollo spinale. (4) Iniezione diretta nel midollo spinale. (5) Somministrazione intravascolare con successiva interruzione transitoria della barriera ematoencefalica. (6) Trasduzione di cellule subaracnoidee con successiva diffusione di piccole proteine ​​(cerchi solidi) nel midollo spinale vero e proprio.

Fig. 2. Potenziali vie di somministrazione del virus ricombinante. (1) Iniezione diretta del virus (esagoni) nello spazio subaracnoideo, tuttavia, l'ingresso nel midollo spinale vero e proprio è limitato a causa della barriera di diffusione delle cellule gliali marginali. (2) Iniezione nella periferia e trasporto di nuovo nel sistema nervoso centrale (SNC particolarmente efficace per il virus dell'herpes simplex). (3) Iniezione nel cervello con trasporto retrogrado (lungo la via ascendente) o anterogrado (lungo la via discendente) al midollo spinale. (4) Iniezione diretta nel midollo spinale. (5) Somministrazione intravascolare con successiva interruzione transitoria della barriera ematoencefalica. (6) Trasduzione di cellule subaracnoidee con successiva diffusione di piccole proteine ​​(cerchi solidi) nel midollo spinale vero e proprio.

Altri due problemi limitano l'utilità pratica di tutti i vettori virali attualmente disponibili. Il primo è l'incapacità di indirizzare il virus a un sottoinsieme specifico di cellule e il secondo è la risposta immunitaria dell'ospite. Attualmente, la trasduzione di un numero limitato di cellule bersaglio può essere ottenuta solo attraverso la consegna anatomicamente definita di vettori virali. Tutti i vettori virali disponibili sono promiscui e tutte le cellule che esprimono i recettori virali che entrano in contatto con il virus vengono trasdotte. Un livello di specificità può essere raggiunto mediante l'incorporazione di un promotore specifico del tipo di cellula nella cassetta di espressione. I promotori limitano la trascrizione del transgene solo nelle cellule selezionate che attivano il promotore. Pertanto, nonostante la prevalente trasduzione virale di molte cellule, l'espressione del transgene può essere limitata. Esempi di promotori specifici per neuroni usati frequentemente includono un promotore di enolasi specifico per neuroni da 1,8 kb che dirige l'espressione in tutti i neuroni. 61A 1,1 kb 5′-regione non tradotta della dopamina β-idrossilasi dirige l'espressione del gene a valle nei neuroni adrenergici e noradrenergici. 62Questo promotore può essere utile per l'espressione anatomicamente definita dei recettori α2-adrenergici per una maggiore inibizione del rilascio di neurotrasmettitori sinaptici. È stata anche descritta l'espressione ectopica ma specifica del neurone da parte di una coppia di 500 basi, recettore dell'acido γ-aminobutirrico di tipo A, promotore della subunità α6. 63 L'espressione di un transgene potrebbe essere limitata ai neuroni inibitori mediante l'uso di un tale promotore. In generale, sembra che 0,5-1 kb di sequenza 5' non tradotta di molti promotori sia sufficiente per conferire l'espressione del transgene, ma è necessaria una sequenza regolatoria più lunga di 3-4 kb per conferire un'espressione neurone specifica in regioni anatomicamente definite del cervello. Una tabella completa dei promotori di neuroni e geni gliali può essere trovata nel rapporto di Henson. 64Tuttavia, in vitro la specificità dei promotori non garantisce simili in vivo specificità e cautela. 25 La dimensione richiesta del promotore preclude l'incorporazione nella maggior parte dei vettori virali, ma la restrizione della dimensione del carico utile non è una limitazione per gli ampliconi HSV a base di adenovirus gutless o cosmidi. La scelta corretta del promotore è essenziale non solo per l'espressione tessuto-specifica del transgene, ma anche per l'espressione a lungo termine del prodotto genico. I promotori virali costitutivi frequentemente utilizzati sono downregolati in vivo , con conseguente durata limitata dell'espressione del transgene. 65-67 Ulteriore regolazione dell'espressione da parte di un ligando esogeno (per esempio. , steroidi, tetraciclina e rapamicina), in combinazione con un promotore tessuto-specifico consentirà la regolazione temporale dell'espressione del transgene oltre alla specificità tissutale. 48,68 Tale regolazione temporale dell'espressione del prodotto genico antinocicettivo è particolarmente desiderabile a causa della natura episodica del dolore.

Un metodo alternativo per raggiungere la specificità del bersaglio è accoppiare la particella virale a un peptide specifico del bersaglio. 69Un peptide corto ottimale con elevata affinità per il tessuto bersaglio (epitelio delle vie aeree in questo studio) è stato identificato mediante un epitelio differenziato delle vie aeree mediante panning biologico contro una libreria di visualizzazione dei fagi. Il peptide ad alta affinità biologicamente selezionato è stato accoppiato alla particella virale utilizzando una molecola di polietilenglicole bifunzionale. Il risultante adenovirus accoppiato a peptidi con capside virale modificato ha dimostrato un'efficiente trasduzione delle cellule bersaglio desiderate in vitro . La specificità target di un virus così modificato dal capside in vivo non è noto in questo momento, ma l'approccio di accoppiamento con glicole polietilenico è interessante in quanto un virus intelligente può essere mirato a qualsiasi tessuto identificando il peptide bersaglio specifico.

All'inizio dello sviluppo dei vettori virali, la risposta immunitaria dell'ospite alla somministrazione del vettore è stata identificata come una limitazione fondamentale all'ulteriore esplorazione dei vettori virali per in vivo terapia genetica. 70 La somministrazione di vettori virali suscita una risposta immunitaria dell'ospite, che include sia l'immunità cellulare che umorale. 24,70 La risposta immunitaria dell'ospite limita la vitalità delle cellule bersaglio trasdotte viralmente e preclude anche la somministrazione ripetuta dello stesso vettore. Sebbene la risposta immunitaria dell'ospite si sviluppi verso la maggior parte dei vettori virali, è particolarmente problematica e quindi studiata più a fondo per l'adenovirus. 43,71 La rimozione dei geni virali nel processo di creazione dei vettori virali può inabilitare i meccanismi di immunoevasione endogeni accentuando il problema dell'immunogenicità virale. 72La reazione infiammatoria iniziale è innescata dall'ingresso del virus nella cellula. 71,73 Sebbene non sia chiaro il passaggio specifico nella sequenza di eventi che innesca la risposta dell'ospite, che inizia con l'attaccamento della particella virale all'adenorecettore coxachie della superficie cellulare e termina con la degradazione proteolitica della particella virale interiorizzata, sembra essere mediato dall'attivazione di la via RafM-APK, che determina il rilascio di inlterleuchina 8 proinfiammatoria. Anche l'interleuchina 1 è stata implicata nella risposta infiammatoria precoce dopo l'iniezione di adenovirus nel cervello. 75

La seconda fase della risposta immunitaria è causata dall'espressione di proteine ​​virali. Sebbene carente di replica mi1 -l'adenovirus deleto è stato progettato per limitare l'espressione delle proteine ​​virali, l'espressione a basso livello dell'esone e del pentone virali (proteine ​​che formano il capside virale), proteine ​​delle fibre (proteine ​​che formano le proiezioni simili ad antenne fuori dal capside) e altri geni tardivi attivano i linfociti T citotossici dell'ospite. 76 La risposta immunitaria cellulo-mediata limita ampiamente la vitalità delle cellule trasdotte dal virus durante la somministrazione iniziale del virus. La progettazione fondamentale dei vettori MMLV e AAV e, più recentemente, dell'adenovirus gutless, essenzialmente privo di tutti i geni virali, aggira i problemi associati all'espressione basale delle proteine ​​virali. Una risposta umorale di terza fase alle particelle virali eliminate provoca la produzione di anticorpi antiadenovirus. La risposta umorale limita l'efficacia della successiva somministrazione di adenovirus. Entrambe le risposte citotossiche e umorali all'adenovirus sono convenzionali nel richiedere interazioni con molecole del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I e II. 77,78 È stato dimostrato che l'immunosoppressione transitoria dell'ospite con la somministrazione concomitante di anticorpo anti-CD4, ciclofasfamide o FK506 prolunga la durata dell'espressione del transgene.79-81 La somministrazione sequenziale di adenovirus di diversi sierotipi elude l'inattivazione immuno-mediata, suggerendo la reale possibilità di ottenere l'espressione a lungo termine del transgene. 48

Sebbene in una certa misura siano inabili, i vettori virali attualmente disponibili non possono essere considerati privi di rischi. Man mano che acquisiamo ulteriori informazioni sulla natura della risposta immunitaria dell'ospite ai vettori virali e man mano che vengono sviluppati vettori migliori, la somministrazione ripetuta e a lungo termine di vettori virali terapeutici dovrebbe diventare una realtà. I vettori virali attualmente disponibili non sono pronti per l'uso nell'intervento terapeutico, ma la tecnologia è pronta per studi sperimentali e limitati studi clinici sull'uomo. L'adenovirus gutless e i vettori ampliconi HSV basati su cosmidi offrono la più grande promessa verso il raggiungimento di un vettore virale ideale per la terapia genica umana.

Oligonucleotidi antisenso

Vantaggi della terapia con oligonucleotidi.

La promessa della terapia antisenso è la capacità di inibire l'espressione di un gene specifico. Gli agenti farmacologici convenzionali realizzano le loro azioni attraverso le proteine, non sono del tutto selettivi e possono mostrare molti effetti collaterali, inclusa la sovraregolazione del recettore. 82Gli attuali farmaci convenzionali non possono agire su specifiche proteine ​​intracellulari. A causa della specificità della terapia antisenso, la sintesi e la progettazione razionali di farmaci oligonucleotidici antisenso possono essere molto più semplici degli agenti attuali. La Figura 3 riassume il modo in cui l'oligonucleotide può interferire con la normale attività genica, determinando una diminuzione dell'espressione della proteina bersaglio, denominata knockdown della proteina. Inoltre, i farmaci antisenso possono essere utilizzati per una varietà di disturbi. 83Il più grande vantaggio, tuttavia, è la quantità significativa di esperienza clinica con farmaci a base di oligonucleotidi.

Fig. 3. Oligonucleotide antisenso e potenziali siti d'azione. (UN ) La normale attività genica (dal DNA all'RNA messaggero [mRNA] alla proteina) determina la produzione di una proteina pronocicettiva che media il dolore (sinistra ). L'oligonucleotide entra nella cellula e si ibrida al bersaglio dell'mRNA complementare. Ciò impedisce la produzione della proteina, determinando un knockdown proteico selettivo (Giusto ). (B ) L'oligonucleotide (barre tratteggiate corte o piene) può agire in più siti tra la trascrizione genica e il targeting finale della proteina.

Fig. 3. Oligonucleotide antisenso e potenziali siti d'azione. (UN ) La normale attività genica (dal DNA all'RNA messaggero [mRNA] alla proteina) determina la produzione di una proteina pronocicettiva che media il dolore (sinistra ). L'oligonucleotide entra nella cellula e si ibrida al bersaglio dell'mRNA complementare. Ciò impedisce la produzione della proteina, determinando un knockdown proteico selettivo (Giusto ). (B ) L'oligonucleotide (barre tratteggiate corte o piene) può agire in più siti tra la trascrizione genica e il targeting finale della proteina.

Esperienza cumulativa con in vivo Gli studi sugli oligonucleotidi nell'ultimo decennio hanno definito la biodisponibilità fondamentale e le proprietà farmacocinetiche degli oligonucleotidi, nonché problemi imprevisti di tossicità non mascherati. Gli oligonucleotidi vengono efficacemente rimossi dal sistema reticoloendoteliale quando iniettati per via endovenosa, sottocutanea o intraperitoneale. 84 Dopo somministrazione endovenosa, gli oligonucleotidi corti marcati con radioattività mostrano una tipica emivita di distribuzione (T 1/2α ) dell'ordine di 1 h e un'emivita di eliminazione (T 1/2β) di 40-50 h indipendentemente dalla sequenza effettiva . La principale via di eliminazione è attraverso l'urina, sebbene alcuni oligonucleotidi siano escreti con le feci. Dati recenti indicano che l'oligonucleotide viene assorbito a livello sistemico dopo somministrazione orale, portando alla possibilità di un regime orale per i farmaci oligonucleotidici. 85 La tossicità a lungo termine degli oligonucleotidi, in particolare con la modifica del fosforotioato, include iperplasia linfoide dose-dipendente ma reversibile, splenomegalia e infiltrazione monocellulare multiorgano. 86 Oltre a queste tossicità derivanti da una presunta stimolazione del sistema immunitario, è stato riportato un prolungamento del profilo della coagulazione probabilmente causato da interazioni specifiche tra oligonucleotide e trombina. 87 Nel complesso, le segnalazioni di tossicità sistemica anche dopo somministrazione prolungata di oligonucleotidi sono poche e sono in corso numerosi percorsi clinici umani con oligonucleotidi antisenso. 88-90 Almeno un oligonucleotide antisenso progettato per trattare la retinite indotta da citomegalovirus (ISIS 2922) ha completato con successo uno studio clinico di fase III ed è appena stato rilasciato per la commercializzazione. Un altro oligonucleotide antisenso mirato al gene del bavaglio dell'HIV (GEM 91) è stato sottoposto ad ampi studi clinici di fase I-II sull'uomo e si sta avvicinando a uno studio di fase III su vasta scala (http://www.hybridon.com). Questo oligonucleotide antisenso riduce la produzione della proteina p24 nei linfociti infetti da HIV in misura paragonabile al farmaco antivirale zidovdina, che è lo standard attualmente accettato del trattamento farmacologico antivirale. 91Non c'è dubbio che la somministrazione sistemica di oligonucleotide sia ben tollerata nell'uomo quando somministrata alla dose appropriata, e questa classe di farmaci mirati al gene entrerà presto nell'armamentario clinico.

In contrasto con i numerosi studi clinici sull'uomo sulla somministrazione sistemica di oligonucleotidi, non ci sono ancora segnalazioni di somministrazione diretta di oligonucleotidi nel SNC nell'uomo. È stato riconosciuto da tempo che a causa della BBB, il SNC è relativamente inaccessibile agli oligonucleotidi dopo le vie di somministrazione sistemica. Questo problema farmacocinetico può essere aggirato mediante iniezione diretta di oligonucleotide all'interno del SNC. Negli animali sono state segnalate vie intraparenchimale, intracerebrale ventricolare e intratecale mediante una singola iniezione o mediante impianto di un catetere intratecale per la somministrazione a lungo termine. A differenza delle particelle virali, le cellule gliali marginali non limitano la diffusione dell'oligonucleotide dallo spazio intratecale al midollo spinale vero e proprio. I geni mirati con successo con evidenza biochimica e funzionale di atterramento proteico dopo iniezioni ventricolari intraparenchimali o intracerebrali includono i recettori del neuropeptide Y, 92 calcineurina cerebrale, 93,n subunità NR1 del recettore metil-d-aspartato, 94-97 del cervello c-fos, 98,99 e ossido nitrico sintasi endoteliale cerebrale. 100Molti di questi bersagli del sistema nervoso centrale già dimostrato di essere sensibili alla terapia antisenso svolgono anche un ruolo significativo nel dolore. Non sono state osservate anomalie comportamentali suggestive di tossicità sistemica o aspecifica della somministrazione di oligonucleotidi. La via intratecale di somministrazione dell'oligonucleotide è stata utilizzata per colpire c-fos, recettore 101μ-oppioide, recettore 102δ-oppioide, recettore 103neurochinina-1, 104e gene 2/IP-10 in un modello sperimentale di encefalomielite allergica. 105In questo studio, Wojcik et al. hanno riportato paralisi degli arti posteriori e necrosi tissutale del midollo spinale dopo infusione intratecale di fosforotioato ma non di oligonucleotidi fosfodiestere, aumentando la possibilità di effetti tossici dei nucleotidi modificati nella colonna vertebrale. Tuttavia, non può essere esclusa una specifica interazione tra la somministrazione sistemica della proteina basica della mielina che porta all'encefalomielite allergica sperimentale e l'oligonucleotide fosforotioato somministrato per via intratecale. Il lavoro nel nostro laboratorio non ha dimostrato alcuna tossicità manifesta nei ratti trattati con oligonucleotide antisenso tiolato mirato al n subunità NR1 del recettore metil-d-aspartato. 97

Una recente indagine farmacocinetica sull'infusione intraparenchimale cerebrale di oligonucleotide 18-mer marcato con [35 S] indica un'ampia diffusione dell'oligonucleotide in tutto il cervello e nel liquido cerebrospinale. 106La radioattività postinfusione è decaduta nelle successive 12 h con un andamento temporale monoesponenziale, con una costante di tempo di 3 h (approssimato dalla fig. 5 nel rapporto di Broaddus et al. 106). Non esistono dati comparabili per la somministrazione intratecale, ma ci si possono aspettare proprietà farmacocinetiche simili o una distribuzione più rapida e diffusa dopo un deposito diretto di oligonucleotidi all'interno del liquido cerebrospinale. Le osservazioni che documentano l'alterazione funzionale riuscita di molti prodotti genici differenti e le proprietà farmacocinetiche desiderabili nel SNC sono particolarmente incoraggianti quando si considera l'oligonucleotide antisenso come un potenziale farmaco terapeutico nell'uomo. La via di somministrazione intratecale come una singola iniezione o attraverso un catetere per infusione è oggi nella pratica clinica attiva per la somministrazione nel SNC di una varietà di farmaci. La natura relativa non invasiva, la capacità di depositare oligonucleotidi direttamente vicino al sito di elaborazione nocicettiva nel midollo spinale e la vasta esperienza clinica con la via di somministrazione intratecale rendono questo metodo molto interessante per la somministrazione di oligonucleotidi antisenso.

A differenza dei vettori virali, gli oligonucleotidi antisenso hanno proprietà immunogeniche minime, non producono proteine ​​virali potenzialmente tossiche e sono efficaci nelle cellule non in divisione. 82Inoltre, gli oligonucleotidi antisenso non sono integrati nel DNA genomico, eliminando virtualmente la possibilità di alterazioni genomiche. La titolazione a un effetto biologico acuto, come la nocicezione, può essere più facile con l'oligonucleotide antisenso a causa della sua durata d'azione più breve.

Ostacoli nella terapia antisenso.

Sebbene il concetto di inibizione dell'oligonucleotide antisenso di un RNA bersaglio sembri semplice, la realtà dell'isolamento e dell'applicazione dell'oligonucleotide antisenso è stata molto più difficile di quanto originariamente previsto. I ricercatori hanno incontrato molte difficoltà, tra cui la generazione di oligomeri attivi, la specificità degli oligonucleotidi antisenso, l'accesso degli oligonucleotidi antisenso agli RNA bersaglio e il verificarsi di effetti non antisenso imprevisti. Nonostante la promessa che gli oligonucleotidi antisenso possano colpire esclusivamente un gene specifico per prevenire l'espressione della proteina rilevante, nessuno ha effettivamente dimostrato che gli oligonucleotidi antisenso possano eliminare l'espressione di un singolo gene. 107

Isolamento di un oligomero appropriato.

Al momento, non ci sono progetti per guidare un ricercatore nella generazione di oligomeri attivi. L'attuale processo è essenzialmente una selezione casuale di oligomeri complementari (ciascuno corrispondente a siti diversi) al cDNA o mRNA di interesse. Per ogni oligomero attivo ottenuto, devono essere selezionati circa sette o otto oligomeri. 108Il test individuale di ciascun oligomero attivo deve essere effettuato per determinare l'oligomero con la massima specificità e la più bassa concentrazione inibitoria. 109 Sebbene il numero di oligomeri attivi che dovrebbero essere sottoposti a screening per trovarne uno che sia massimamente attivo non è noto, un esperto ha suggerito che sarebbe ottimale (sebbene costoso) esaminare circa 30-40 oligomeri attivi. 108Solo il 3% degli oligonucleotidi antisenso può essere altamente efficace. 110 Pertanto, i metodi attuali per la selezione di un oligomero che è attivo al massimo da un ampio pool di candidati è un processo estremamente dispendioso in termini di tempo. La progettazione razionale di un oligonucleotide antisenso efficace può ridurre il numero di oligomeri che devono essere testati in vitro e in vivo . I potenziali metodi includono la mappatura dell'RNAsi H dell'mRNA bersaglio (per identificare i siti accessibili per gli oligonucleotidi antisenso) e la scansione dell'array oligonucleotidico combinatorio (per identificare tutti i possibili oligonucleotidi antisenso sovrapposti di ogni lunghezza fino a una data lunghezza). 111

Specificità e discriminazione dell'oligonucleotide.

La lunghezza dell'oligomero è un fattore importante nel determinare il riconoscimento del sito bersaglio per l'oligonucleotide antisenso. 108Sebbene sembrerebbe che la scelta di un oligomero con una sequenza più lunga di nucleotidi conferisca maggiore specificità per colpire l'mRNA e discriminazione da altri siti con sequenze nucleotidiche simili, l'aumento della lunghezza dell'oligomero oltre circa 10 nucleotidi può effettivamente avere l'effetto opposto di stabilizzare il legame oligonucleotidico antisenso a sequenze non corrispondenti. 107 Ad esempio, un oligomero con una sequenza di 13-17 nucleotidi, che molto probabilmente sarebbe unico, può legarsi non solo all'RNA bersaglio ma anche agli RNA astanti che possiedono uno o due disallineamenti nucleotidici. 107,112 In altre parole, ci sono potenzialmente 209 e 12 corrispondenze alternative per un oligonucleotide antisenso a 13 nucleotidi se 2 e 1, rispettivamente, si verificano disallineamenti di base. 112 Inoltre, l'aumento della lunghezza dell'oligonucleotide antisenso potrebbe non aumentare la specificità poiché molto probabilmente l'RNAsi richiede solo una breve sequenza (7-10 nucleotidi) per scindere il filamento di RNA di un complesso mRNA-oligonucleotide antisenso. 112Sfortunatamente, l'uso di una sequenza nucleotidica più corta aumenterà la probabilità che altri RNA non mirati abbiano una sequenza di basi simile e siano legati da oligonucleotidi antisenso con successiva scissione da parte dell'RNAsi. Nonostante i limiti teorici della specificità e della discriminazione antisenso, sembra esserci un consenso generale sul fatto che la lunghezza ottimale per un oligomero antisenso sia compresa tra 18 e 20 basi. 108

Accesso intracellulare e legame dell'oligonucleotide.

Effetti prodotti dall'oligonucleotide antisenso in vitro potrebbe non tradursi in effetti simili in vivo , in parte derivante dalle barriere all'accesso intracellulare e dal legame dell'RNA. A differenza della situazione artificiale all'interno delle cellule in cui gli oligonucleotidi antisenso si legano agli RNA nudi, gli oligonucleotidi antisenso utilizzati in situazioni cliniche devono procedere intatti verso la cellula bersaglio, ottenere l'accesso intracellulare nel citoplasma e nel nucleo e conformarsi e legarsi saldamente all'RNA bersaglio per consentire la scissione mediante RNAsi. Gli oligonucleotidi sono rapidamente assorbiti e ampiamente distribuiti dopo la somministrazione parenterale (per esempio. , endovenosa, intradermica) tuttavia, non vi sono dati che suggeriscano che si verifichi una penetrazione significativa della BBB dopo la somministrazione sistemica di oligonucleotidi. 80 Quando somministrati per via intraventricolare o intratecale, gli oligonucleotidi antisenso, a differenza dei vettori virali, non sembrano avere difficoltà ad attraversare le membrane piali ea diffondersi nei neuroni. 113,114 L'iniezione intraventricolare di oligonucleotidi antisenso ha dimostrato di ridurre l'espressione dell'mRNA bersaglio intraneuronale e della proteina. 94,115

I fattori che determinano l'assorbimento cellulare degli oligonucleotidi non sono chiari, tuttavia, gli oligonucleotidi sono ampiamente distribuiti a livello intracellulare una volta che si verifica l'assorbimento cellulare. 83Se gli oligonucleotidi non si legano a proteine ​​non mirate o rimangono intrappolati negli endosomi intracellulari o nei lisosomi, hanno la possibilità di legarsi all'RNA bersaglio, una proposta potenzialmente difficile in sé. 116,In vivo L'RNA è una struttura tridimensionale complessa e le aree mirate potrebbero non essere accessibili o protette da proteine ​​cellulari o complessi ribonucleoproteici che impediscono il legame degli oligonucleotidi antisenso o la scissione mediata dai ribozimi. 107,117 Pertanto, la struttura dell'RNA è un importante determinante dell'accesso agli oligonucleotidi antisenso e dell'eventuale legame in vivo . 118,119

Effetti non antisenso.

Uno dei problemi più significativi nell'uso degli oligonucleotidi antisenso è l'ampia varietà di effetti non antisenso imprevisti che possono verificarsi. 107 A causa della natura della specificità degli oligonucleotidi (vedi Specificità e discriminazione degli oligonucleotidi), gli oligonucleotidi antisenso molto probabilmente si legano anche a RNA non mirati, causando così potenzialmente molti effetti collaterali imprevedibili clinicamente, alcuni dei quali in realtà potrebbero essere potenzialmente molto utili. 120 Inoltre, alcune combinazioni di nucleotidi (per esempio. , quattro residui di guanosina continui) sono noti per inibire l'espressione della proteina in modo indipendente dalla sequenza. 121 Lo sperimentatore potrebbe non essere certo se l'effetto desiderato (se si verifica) sia il risultato di una reazione oligonucleotidica antisenso con il bersaglio previsto o una proteina non mirata. Gli effetti non antisenso possono verificarsi attraverso meccanismi totalmente inaspettati con delucidazione degli esatti meccanismi d'azione, che potrebbero richiedere anni per essere determinati. 103

Tossicità.

Gli oligonucleotidi possono mostrare tossicità sequenza-indipendente e -dipendente. Effetti indipendenti dalla sequenza, tra cui stimolazione immunitaria, trombocitopenia, aumento delle transaminasi epatiche, attivazione del complemento e prolungamento dei tempi di coagulazione, possono essere causati dal carattere polianionico degli oligonucleotidi fosforotioati. 122Le molecole di fosforotioato possono interagire in modo non specifico con bersagli cellulari, determinando un'ampia tossicità cellulare.

Si dice che la tossicità sequenza-dipendente si verifica quando la somministrazione di oligonucleotide fosforotioato di varie lunghezze determina profili di tossicità comparabili di gravità variabile. 122 La tossicità degli oligonucleotidi può essere un fattore limitante nell'uso terapeutico degli oligonucleotidi antisenso poiché possono essere presenti curve dose-risposta ripide e finestre terapeutiche ristrette (solo un fattore 10 può differenziare la concentrazione che non produce alcun effetto da quella che genera un effetto completo) in vivo . 107

Interpretazione dei dati dagli studi sugli oligonucleotidi antisenso.

Uno dei problemi più difficili nell'interpretazione dei dati dagli studi sugli oligonucleotidi antisenso è determinare se l'effetto osservato è prodotto dall'interazione antisenso bersaglio o da altri meccanismi non mirati. Come descritto in precedenza, possono verificarsi molti effetti non antisenso che interferiscono con i dati ottenuti in vivo . Prova di un meccanismo antisenso in vitro e in vivo richiederà un numero adeguato di controlli, misurazione diretta della proteina bersaglio o RNA, curve dose-risposta complete con potenze di ordine di rango di analoghi e discrepanze, mancanza di effetto su prodotti genici strettamente correlati e geni domestici e spiegazione degli effetti imprevisti prodotti dal controllo oligonucleotidi. 121,123 Il campo dello sviluppo di farmaci antisenso è ancora agli inizi e le linee guida sperimentali proposte aumenteranno le conoscenze farmacocinetiche, farmacologiche e tossicologiche per utilizzare gli oligonucleotidi antisenso per scopi terapeutici. 108,121,123


Applicare la convalida

Un laboratorio che applica un dosaggio specifico dovrebbe avere prove documentate che il metodo è stato convalidato in modo appropriato. L'utente ha la responsabilità di garantire che la convalida sia documentata per soddisfare i requisiti per il metodo specifico. Se vengono utilizzati metodi standard (American Society for Testing and Materials, International Organization for Standardization, European and US Pharmacopoeias), è necessario verificare che l'ambito del metodo e i dati di convalida, ad esempio matrice del campione, linearità, range e limiti di rilevamento, soddisfare i requisiti delle analisi di laboratorio. In caso contrario, la convalida del metodo standard dovrebbe essere ripetuta utilizzando i criteri propri del laboratorio. Il laboratorio deve dimostrare la validità del metodo nell'ambiente del laboratorio. Si raccomanda la convalida completa di un metodo standard laddove non sia possibile trovare informazioni sul tipo e sui risultati della convalida nella documentazione del metodo standard. Non esistono linee guida ufficiali sulla sequenza degli esperimenti di validazione e la sequenza ottimale può dipendere dal metodo stesso.

All'interno di questo capitolo, forniamo una panoramica dei parametri critici raccomandati per essere inclusi come parte di un pacchetto di validazione per i saggi PCR, ELISPOT, Microarray e LAL, che sono stati selezionati come esempi rappresentativi di saggi biologici molecolari, immunologici e microbiologici utilizzati in l'analisi e lo sviluppo di prodotti di terapia genica e vaccini.

Saggi PCR

I tessuti bersaglio, la persistenza e la clearance (biodistribuzione) del prodotto in sperimentazione devono essere studiati come parte degli studi preclinici di sicurezza. Per i prodotti di terapia genica, la biodistribuzione può essere studiata esaminando i tessuti per la sequenza di DNA terapeutica utilizzando una metodologia PCR.

La tecnica PCR 7, 8 consente una specifica in vitro amplificazione di segmenti di DNA e RNA (RT-PCR). Il DNA stampo a doppio filamento viene denaturato in DNA a filamento singolo, dopo di che due primer oligonucleotidici sintetici di diverso orientamento si legano alle sequenze complementari sul DNA stampo. Le brevi regioni a doppio filamento, limitate dai primer, sono amplificate dalla DNA polimerasi termostabile. Ripetendo questi passaggi di denaturazione-ricottura-allungamento fino a 30-40 volte, milioni di copie della sequenza selezionata possono essere amplificate appena da una copia della sequenza target.

A causa della sua elevata sensibilità, il test PCR è soggetto a contaminazione incrociata e risultati falsi positivi a meno che non vengano prese in considerazione le dovute precauzioni come la suddivisione del lavoro in aree separate a seconda della fase di analisi, l'uso di indumenti protettivi, pipette separate e puntali con filtro, nonché l'uso di uracilen-ampliconi sensibili alla glicosilasi per prevenire la contaminazione da carryover. 9 I controlli negativi e cosiddetti sentinella, che imitano il campione, dovrebbero essere usati per controllare la contaminazione. Le procedure standardizzate stabilite per prevenire la contaminazione possono aiutare a dimostrare la specificità e l'affidabilità del test.

Il campionamento è la prima criticità per l'analisi PCR. Ad esempio, l'ambiente per la raccolta dei campioni e l'ordine in cui vengono raccolti i campioni possono essere critici, ad esempio negli studi di biodistribuzione, in cui agli animali viene iniettato il prodotto di DNA plasmidico, il rischio di contaminazione incrociata è elevato. Anche alcuni anticoagulanti, come l'eparina, utilizzati per la raccolta del sangue possono inibire le reazioni della PCR. I campioni biologici, inclusi in un'analisi PCR, richiedono che il modello per la PCR debba essere estratto e purificato prima dell'analisi. L'efficienza e la riproducibilità delle procedure di estrazione e purificazione devono essere dimostrate negli studi di additivazione in cui i campioni vengono addizionati sia prima che dopo l'estrazione.

Poiché la specificità di un metodo PCR dipende dalla scelta e dalla qualità dei primer e delle sonde, nonché dalle condizioni di reazione e dal rilevamento, il razionale per la selezione delle sequenze dei primer e delle sonde dovrebbe essere attentamente giustificato. È importante essere consapevoli di possibili sostanze interferenti e inibitori della PCR, come quelli presenti nella matrice del campione o altri prodotti del DNA plasmidico, che vengono gestiti nello stesso laboratorio e potrebbero causare un rischio di contaminazione incrociata. Il metodo di quantificazione e la chimica (es. SYBR Green contro sonde fluorescenti) e gli standard di quantificazione devono essere selezionati con attenzione per ottenere una quantificazione specifica e accurata. Questi standard dovrebbero avere la stessa efficienza di amplificazione dei campioni di studio. I controlli positivi devono essere eseguiti in ogni corsa PCR per seguire l'esecuzione del test.

La specificità di un test PCR può essere dimostrata valutando il prodotto PCR risultante mediante elettroforesi su gel, confermando così che l'amplicone è delle dimensioni previste o mediante analisi della curva di fusione, nonché analizzando diversi modelli, che potrebbero essere presenti nella reazione PCR come contaminazione o come matrice del campione, come il DNA cromosomico. La linearità del dosaggio deve essere dimostrata in tutto l'intervallo previsto e un punto di incrocio (o concentrazione del campione) deve essere rappresentato in funzione del rapporto fluorescenza/fluorescenza ottenuto. L'accuratezza può essere dedotta una volta dimostrate la linearità e la precisione da un'analisi all'altra e tra più operatori.

Il LOD (o cutoff positivo) e il LOQ di un test PCR sono generalmente testati empiricamente analizzando diverse diluizioni replicate del modello target e sono rappresentati come un numero di sequenze target per quantità di campione. Il LOD può essere determinato come la concentrazione, che può essere rilevata nel 95% delle corse, e il LOQ, rispettivamente, il numero minimo di sequenze target che possono essere rilevate e quantificate in tutte le corse. I parametri, che influenzano il LOD e il LOQ di un test PCR, includono la distribuzione della sequenza target nel campione e le prestazioni del test, ad esempio ripetibilità, errori di pipettaggio, qualità dei reagenti, omogeneità delle condizioni di reazione e distribuzione della miscela di reazione in una provetta per PCR (spruzzi).

Saggio ELISPOT

I test ELISPOT 10, 11 sono spesso utilizzati per misurare le risposte dei linfociti T in diversi studi di immunogenicità ed efficacia dei vaccini. I linfociti T isolati dal sangue vengono stimolati con diversi antigeni per indurre la sintesi e/o la secrezione di citochine, come l'IFN-γ, che viene utilizzato soprattutto nel monitoraggio di CTL CD8-specifici o CD4-specifici Th1 risposte. 12, 13, 14 L'IFN-γ prodotto viene quindi legato su una membrana solida, che viene rivestita con uno specifico anticorpo monoclonale. L'IFN-γ legato viene quindi rilevato utilizzando la tecnica del saggio immunoassorbente legato all'enzima sandwich (ELISA). 15 Le cellule che secernono IFN-γ sono rilevate come macchie colorate sulla membrana, ciascuna macchia rappresenta una singola cellula che produce IFN-γ, il numero delle macchie è proporzionale alla forza della risposta immunitaria. Altri saggi ELISPOT per IL-2 (Th1 risposta), IL-4 (Th2 risposta) o Perforin (risposta citotossica diretta) sono anche disponibili e in uso.

Anche se il metodo ELISPOT fornisce una misurazione quantitativa delle macchie e della risposta immunitaria, la quantificazione differisce completamente dalla tradizionale curva standard utilizzando i saggi. ELISPOT è un tipico test biologico che misura le risposte delle cellule viventi in vitro. Pertanto, già il campione stabilisce requisiti specifici, che devono essere ottimizzati di conseguenza.

Vengono analizzati campioni di individui diversi, che hanno diversi punti di forza della risposta immunitaria. In momenti diversi del prelievo di sangue anche lo stesso individuo può rispondere in modo diverso. Occorre prestare particolare attenzione nella valutazione dei risultati di individui con diversi disturbi immunologici come i pazienti con infezione da HIV la cui composizione delle cellule T può variare a causa del trattamento e del progresso dell'infezione. Ad esempio, Smith et al 13 hanno mostrato che un esaurimento delle cellule CD4 ha provocato una perdita di segnale con alcuni mitogeni nel saggio IFN-γ ELISPOT. La manipolazione di campioni di sangue e cellule viventi richiede un'attenzione particolare per quanto riguarda il tempo e le condizioni di conservazione, che sono cruciali per le prestazioni del test. L'intervallo di tempo dal prelievo di sangue fino alla separazione delle PBMC ha una grande influenza sulla vitalità cellulare e sulle prestazioni del test. Le procedure di coltura cellulare devono essere standardizzate e ottimizzate rispetto alla quantità iniziale di cellule vitali, ai reagenti e ai tempi di incubazione, nonché alla titolazione e alla composizione degli antigeni e dei peptidi utilizzati per stimolare le cellule. Per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore, le fasi di cattura e rilevamento dell'anticorpo devono essere ottimizzate, comprese tutte le fasi di lavaggio (efficienza del lavaggio manuale contro lavatrice automatica), la quantità di anticorpi di rivestimento e di rilevamento, nonché i tempi e le condizioni di incubazione. Ciascun test deve contenere controlli negativi e positivi (ad es. PHA, tossoide tetanico, FEC) per dimostrare la validità del test. Dovrebbero esistere controlli positivi per la stimolazione e per la cattura/rilevazione di anticorpi (ELISA).

La robustezza della manipolazione e della conservazione del campione dovrebbe essere dimostrata, in quanto è il primo e più critico parametro che influenza le prestazioni del test e l'affidabilità dei risultati. Dovrebbe essere valutata l'influenza delle condizioni di conservazione (compreso il contenitore del campione), del ciclo di congelamento-scongelamento e dei diversi tempi di conservazione. La linearità del saggio dovrebbe essere dimostrata studiando la risposta in funzione delle cellule vitali utilizzate per la stimolazione. La variazione all'interno di ciascuna fase della procedura analitica, separazione PBMC, coltura cellulare, ELISA e fasi di conteggio spot (anche umane contro computer quando vengono utilizzati) dovrebbero essere valutati separatamente. Una valutazione della variazione della risposta ottenuta da campioni di sangue prelevati dallo stesso individuo in momenti diversi potrebbe fornire preziose informazioni sulla possibile variabilità causata dal campione. Il limite di quantificazione viene stabilito determinando la risposta più bassa, che può essere quantificata in modo affidabile come cellule formanti macchie (SPC). Si dovrebbero anche fissare dei limiti per la risposta, che viene interpretata come un risultato "positivo" o significativo quando si valuta la potenza o l'efficienza di un "prodotto farmaceutico".

Analisi dell'espressione genica

La funzionalità dei prodotti di terapia genica dipende dall'espressione e dal targeting del gene terapeutico. Esistono diversi metodi per analizzare l'espressione genica in vivo e in vitro come ELISA, 15 Northern 16 e Western blot, 17 RT-PCR 8 e DNA Microarrays. 18 L'efficienza dell'espressione e dei tessuti bersaglio sono spesso studiati o con vettori contenenti un gene codificante una proteina fluorescente, come la luciferasi 19 e/o la proteina fluorescente verde (GFP), 20, 21 combinati con il gene terapeutico o che lo sostituiscono.

Nei saggi ELISA e Western blot, la proteina espressa viene solitamente analizzata direttamente da campioni di siero o tessuto, mentre in Northern blot, RT-PCR e Microarray l'analisi è preceduta dall'estrazione di mRNA (o RNA totale) da tessuti animali. Nei saggi di proteine ​​fluorescenti, il segnale viene rilevato solitamente da tessuti fissati in formalina, inclusi in paraffina o estratti di tessuto. Dovrebbero essere presi in considerazione i principi relativi alla manipolazione e alla conservazione dei campioni biologici. I Microarray, come potente metodo per lo screening dell'espressione dei geni, sono diventati recentemente uno strumento molto popolare tra i ricercatori.

Un Microarray può essere pensato come un raffinato saggio Southern blot, che include una fase di PCR la sonda cDNA è ottenuta clonando la sequenza desiderata in cellule batteriche dopo di che il gene di interesse viene amplificato e purificato in PCR o generando da un cDNA commerciale libreria e accoppiato sulla fase solida. L'mRNA del campione estratto viene anche amplificato con RT-PCR per il gene di interesse e marcato con un'etichetta fluorescente, che viene quindi ibridata con la sonda cDNA immobilizzata e rilevata con un lettore laser. Confrontando l'intensità dei segnali del campione sperimentale e del campione di controllo o utilizzando etichette diverse per il campione e il controllo, si può vedere se il gene di interesse è sovraregolato, sottoregolato, invariato o assente. Invece di utilizzare sonde cDNA come catcher, le piattaforme che applicano sonde oligonucleotidiche sintetizzate corte ( 25 bp) o lunghe ( ∼ 40-80 bp) sono più comode da usare. 22

Indipendentemente dal fatto che la piattaforma sia selezionata, la variazione biologica tra individui e diverse popolazioni di geni mirati può causare variazioni nei risultati dell'array e quindi può ostacolare la loro interpretazione, specialmente nei casi in cui è difficile identificare la causa della variazione come dovuta al ragioni tecniche, variazioni biologiche naturali o un risultato reale. Pertanto, la ripetibilità da array a array dovrebbe essere dimostrata rispettivamente in relazione alla variazione sia biologica che tecnica e l'accuratezza dei risultati dovrebbe essere confermata confrontandola con altre metodologie come il Northern blot o la RT-PCR. Come nei tradizionali saggi di ibridazione, i passaggi critici che causano la variazione tecnica sono l'ibridazione (es. rapporto delle sonde e rapporto campione/controllo e la purezza del campione di RNA), l'efficienza dell'amplificazione e dell'etichettatura del cDNA, il lavaggio e la lettura. I controlli positivi e negativi devono essere utilizzati per controllare la qualità del campione e le prestazioni tecniche dell'array. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla selezione dei geni o del software utilizzato per la normalizzazione dei dati grezzi, nonché al metodo statistico utilizzato per valutare i dati. È stata istituita una società internazionale, Microarray Gene Expression Data (MGED), per aiutare tutti gli scienziati di microarray a ottenere e confrontare dati affidabili con l'obiettivo di stabilire standard per l'annotazione dei dati e un database comune, che consenta la condivisione dei dati in campo della genomica funzionale e della proteomica. Di conseguenza, i requisiti per le informazioni minime su un esperimento di microarray (MIAME) sono stati fissati per facilitare l'interpretazione dei risultati del microarray 23 e si raccomanda di seguirli durante la progettazione di un nuovo array.

LAL testa il metodo Gel-Clot

Come esempio di test microbiologico, discutiamo il test Limulus Amebocyte Lysate (LAL), che viene utilizzato per la determinazione dell'endotossina batterica. Tra gli altri test microbiologici, ad esempio test di sterilità, micoplasma, virus avventizi e test relativi a virus competenti per la replicazione, la determinazione del livello di endotossine batteriche all'interno di un prodotto fa parte delle analisi di sicurezza critiche richieste dalle autorità di regolamentazione da includere come parte della batteria di test utilizzati per il rilascio del prodotto finale. Rispetto al test pirogeno convenzionale, che utilizza conigli come modello animale, 24, 25 il LAL è molto più conveniente da eseguire anche dal punto di vista etico.

Il test utilizza un LAL che rappresenta il sangue, che viene estratto da un granchio a ferro di cavallo (Limulus polyphemusor, Tachypleus tridentatus). Quando incubata con il lisato, l'endotossina presente nel campione innesca un percorso di reazione enzimatica, con conseguente attivazione della coagulasi del lisato e infine formazione di un gel bianco solido. Se il gel non si forma, il campione contiene meno endotossine come è stato specificato per la sensibilità al lisato. Quando si ottengono risultati positivi, la quantità effettiva di endotossina presente nel campione viene determinata analizzando diluizioni seriali del campione. 26, 27

Il LAL è stato approvato nelle Farmacopee Europea 27 e US 26 come metodo standard, che descrivono anche la parte di validazione. Le parti più critiche da convalidare per un'analisi LAL sono i fattori di interferenza, che si consiglia di valutare per ogni nuovo tipo di materiale campione utilizzato all'interno dell'analisi e la diluizione massima valida (MVD) che dovrebbe essere utilizzata per ogni particolare campione . I fattori interferenti dovrebbero essere rimossi ad esempio mediante diluizione, filtrazione, neutralizzazione o riscaldamento. Ad esempio, è noto che il DNA ad alte concentrazioni migliora la reazione in un metodo Gel-Clot e quindi causa risultati falsi positivi. Pertanto, la concentrazione alla quale non si verifica l'aumento dovrebbe essere testata empiricamente testando diverse diluizioni del campione.


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Polimeri in Biologia e Medicina

9.02.1 Introduzione

Gli acidi nucleici sono una delle quattro principali classi di macromolecole presenti negli organismi, le altre sono proteine, glicosidi e lipidi. Mentre l'acido desossiribonucleico (DNA) codifica per le informazioni genetiche (ed epigenetiche) che alla fine forniscono le caratteristiche fisiche di un organismo, l'RNA, che inizialmente si pensava fungesse semplicemente da intermediario nel trasferimento delle informazioni genetiche contenute nel DNA al ribosoma per la sintesi proteica, sembra svolgere ruoli più dinamici che coinvolgono aspetti di catalisi e regolazione. Mentre la natura sembra aver riservato l'archiviazione e il trasferimento di informazioni come ruolo primario per gli acidi nucleici in una cellula, al di fuori di una cellula, giocano ruoli sempre più diversi e multifunzionali. Queste funzioni sono l'affioramento di diverse scoperte seminali legate alle proprietà polimeriche uniche degli acidi nucleici e l'avvento di metodi di biologia molecolare e chimica che hanno permesso agli investigatori di sintetizzare, derivatizzare e infine creare entità completamente nuove con insolite e innaturali proprietà chimiche.

Queste nuove entità di acido nucleico soddisfano esigenze pratiche e sfide intellettuali che non sono prontamente soddisfatte né dagli acidi nucleici né dalle proteine ​​naturali e come tali possono essere catalizzatori, sensori o persino farmaci. Sebbene globalmente mantengano la struttura polimerica dell'acido nucleico e quindi assomiglino ancora agli acidi nucleici, sono stati dotati di funzionalità aggiuntive caratteristiche di altre composizioni trovate in proteine, organocatalizzatori e/o lipidi. Questi polimeri sintetici e antropogenici resistono alla definizione perché, sebbene siano innaturali sotto molti aspetti, le loro attività catturano l'efficienza, la complessità e persino la bellezza dei sistemi biochimici. È quindi l'emozionante fusione degli attributi polimerici unici degli acidi nucleici, insieme agli sviluppi nella selezione della chimica combinatoria e nelle chimiche degli acidi nucleici sintetici che costituiscono la base di questo capitolo.


Introduzione

Un virus è un piccolo parassita microscopico elettronico, incapace di riprodursi da solo, sopravvive dirigendo il macchinario della cellula ospite per la produzione di più virus, che emerge dalla rispettiva cellula ospite attraverso la lisi. La maggior parte di questi organismi virali contiene DNA a doppio filamento oa filamento singolo e RNA nei loro genomi, che possono essere a filamento singolo o doppio filamento. Dopo la purificazione e la parziale cristallizzazione del Tobacco Mosiac Virus nel 1935 da Wendell Stanley, lo studio dei virus ha ispirato molti scienziati, che hanno portato all'identificazione e alla caratterizzazione di virus di piante, batteri, archaea e animali. Poiché i virus sono in grado di infettare un gran numero di diversi tipi di cellule, per la terapia genica si stanno prendendo in considerazione virus geneticamente modificati. Tutti questi fattori e applicazioni rendono il virus un organismo importante per la sua capacità di infettare qualsiasi organismo vivente su questo pianeta.

I virus sono piccoli parassiti intracellulari obbligati, submicroscopici, che contengono DNA o RNA come genoma protetto da un rivestimento proteico codificato dal virus chiamato capside. I virus sono elementi genetici mobili, dipendono dai macchinari metabolici e biosintetici delle cellule ospiti per la loro propagazione. I virus non possono svolgere le loro funzioni vitali al di fuori della cellula ospite. Non possono sintetizzare le proteine ​​poiché mancano di ribosomi e utilizzano il macchinario ribosomiale della cellula ospite per tradurre il loro mRNA in proteine. I virus non possono né generare né immagazzinare ATP, ma ricavare l'energia necessaria e altre funzioni metaboliche parassitando la cellula ospite per i materiali di base come amminoacidi, nucleotidi e lipidi. Anche se i virus sono ipotizzati come una forma di protovita, la loro incapacità di sopravvivere al di fuori degli organismi viventi non li rende organismi viventi in senso stretto ed è altamente improbabile che abbiano preceduto la vita cellulare durante l'evoluzione della terra. Alcuni scienziati ipotizzano persino che i virus siano nati come segmenti canaglia del codice genetico che si sono adattati a una forma di esistenza parassitaria. I virioni sono le particelle virali complete che vengono prodotte dall'assemblaggio dei componenti virali preformati, la cui funzione principale è quella di consegnare il proprio genoma nella cellula ospite per la sua espressione (trascrizione e traduzione). Il virione icosaedrico appartenente alla icosaedrica o classe strutturale di virus è composta da 20 facce triangolari identiche, ciascuna faccia è costruita con tre unità proteiche del capside identiche che formano 60 subunità per capside, con cinque subunità che contattano simmetricamente ciascuno dei 12 vertici, rendendo così tutte le proteine ​​in interazione equivalente tra loro . Il genoma virale è impacchettato all'interno di un capside proteico simmetrico, composto da una o più proteine, ognuna delle quali codifica un singolo gene virale. A causa di questa struttura simmetrica, i virus potrebbero codificare tutte le informazioni necessarie per costruire un grande capside utilizzando un piccolo set di geni. Un capside insieme all'acido nucleico racchiuso è chiamato nucleocapside. Nei virus con involucro, il nucleocapside è circondato da un doppio strato lipidico ed è costellato da uno strato di glicoproteine. Spesso, l'acido nucleico è associato a una proteina chiamata nucleoproteina. I virus possiedono una grande diversità rispetto alle loro dimensioni. è il virus più grande segnalato con un diametro di 400 nm, più grande dei batteri, che è

200 a 300 nm di lunghezza. Presentano anche un'ampia diversità di forme e forme, come sferiche, a bastoncino, ecc.

Ci sono poche entità subvirali che sono molto simili, patogene e possiedono proprietà simili a quelle dei virus. Queste entità sono viroidi, virusidi e prioni. I viroidi sono un breve tratto di molecole di RNA circolare altamente complementari, a singolo filamento (200� nucleotidi), che possiedono una struttura secondaria simile a un bastoncino senza capside o involucro. Questi viroidi sono associati a malattie delle piante e dell'uomo come l'epatite D. Sono parassiti intracellulari obbligati, con strategie di replicazione simili ai virus. I virusoidi sono RNA satellite, circolari a filamento singolo (1000 nucleotidi) dipendenti dai virus delle piante per la replicazione e l'incapsidazione. Sono confezionati in capsidi virali come passeggeri. Il loro genoma codifica solo proteine ​​strutturali. I prioni sono agenti infettivi anomali che causano malattie neurodegenerative fatali mediate da meccanismi contemporanei. I prioni sono costituiti da un singolo tipo di molecola proteica senza alcun componente di acido nucleico. La proteina è un'isoforma modificata della proteina prionica (PrP) denominata PrPSc. La normale PrPC cellulare viene convertita in PrPSc mediante una transizione strutturale della sua struttura α-elicoidale e la struttura a spirale viene ripiegata in β-foglio. La proteina prionica e il suo gene codificante si trovano spesso nelle cellule normali non infette e sono associati a malattie virali come la malattia di Creutzfeldt–Jakob nell'uomo, la scrapie negli ovini e l'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini.


CONCLUSIONE

Questo articolo descriveva un curriculum, Designer Bacteria, che ha applicato con successo la DBL all'espressione genica. L'espressione genica è adatta per DBL perché è centrale nel campo della biologia, difficile da imparare, un elemento costitutivo del più ampio curriculum di biologia e significativo per il curriculum obbligatorio delle scuole superiori a livello nazionale e statale. L'unità Designer Bacteria ha utilizzato attività di progettazione strategicamente strutturate in cui gli studenti hanno modificato geneticamente i batteri per esprimere nuovi tratti utilizzando pratiche scientifiche autentiche. L'unità includeva funzionalità aggiuntive per aumentare l'implementazione diffusa. Queste caratteristiche includevano la pertinenza degli studenti, costi controllati, materiali per studenti selezionati strategicamente e migliori risultati scientifici.

Questo lavoro fornisce la prova che DBL può essere uno strumento efficace per l'apprendimento di concetti fondamentali difficili in biologia. Questa unità e le sue acquisizioni di apprendimento saranno utili per insegnanti e ricercatori che cercano di sviluppare modi più efficaci per insegnare informazioni complesse nei corsi di biologia. Ulteriori lavori con questa unità saranno sviluppati per esplorare le modalità di pensiero degli studenti in tutta l'unità e per indagare sui componenti di questa unità che migliorano in modo più efficace l'apprendimento. DBL ha il potenziale per essere un approccio di successo alla riforma dell'istruzione in biologia, in particolare per una migliore comprensione di argomenti complessi come l'espressione genica.


Guarda il video: Tecniche di DNA Ricombinante (Febbraio 2023).