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Quali sono le ragioni che rendono incerta la rivelazione degli introni?

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Il rilevamento della sequenza introne/esone sembra implicare una previsione statistica che può al massimo fornire un'ipotesi (fino a conferma sperimentale) su dove si trova il sito di giunzione.

Quali sono le ragioni per cui non ci sono sequenze deterministiche (piuttosto che di consenso) che segnalano i siti di giunzione della posizione?

Cercando di rispondere da solo, immagino che quella più ovvia che riesco a vedere sia la struttura della cromatina, che interagisce con il modo in cui l'RNA polimerasi legge il filamento di DNA. Se questo è il caso, tuttavia, l'attuale modo di descrivere il DNA come una sequenza di coppie di basi AGCT non è fondamentalmente errato? Se la struttura della cromatina è in realtà parte della descrizione funzionale del DNA, allora ci sono sforzi per descriverla?


Topi con una delezione nel primo introne del Col1a1 Il gene sviluppa la dissezione e la rottura dell'aorta dipendenti dall'età

Dal Dipartimento di Biochimica Medica e Biologia Molecolare (OR, IK, EV, RP), Centro di Ricerca di Medicina Cardiovascolare Applicata e Preventiva (OR) e Dipartimento di Chirurgia (HH), Università di Turku, Finlandia, il Gruppo CIHR in Matrix Dynamics (MS), University of Toronto, Canada, and the Departments of Biochemistry and Medicine (SH, PB), University of Washington, Seattle, Wash. Indirizzo attuale per SGH è l'Ospedale Universitario di Neurologia, Heidelberg, Germania.

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Due ipotesi rivali: Intron Early contro Introne tardivo

La diversità proteica è sorta in analogia al rimescolamento dell'esone nella generazione della diversità anticorpale (vedi il tuo libro di testo di biochimica o genetica sulla maturazione del sistema immunitario).

  • Gli introni separano i domini strutturali. Esempio di un Go-plot è qui (da qui, questi autori descrivono un significativo eccesso di introni nelle regioni linker definite attraverso la sovrapposizione nel Go-plot).
  • In Triose Phosphate Isomerase è stato trovato un introne in una posizione suggerita da un Go-plot (qui). , . Sebbene significativo, l'eccesso è piuttosto contenuto: 216 su 570, 36 in più del previsto con una distribuzione casuale). Tuttavia, l'eccesso è maggiore, se si considerano solo le proteine ​​multidominio, suggerendo che queste si siano effettivamente evolute attraverso il rimescolamento dell'esone (vedi qui per un'analisi recente).

Intron A - Farmacologia clinica

Generale

Gli interferoni sono una famiglia di piccole proteine ​​e glicoproteine ​​presenti in natura con pesi molecolari da circa 15.000 a 27.600 dalton prodotti e secreti dalle cellule in risposta a infezioni virali e ad induttori sintetici o biologici.

Farmacologia preclinica

Gli interferoni esercitano le loro attività cellulari legandosi a specifici recettori di membrana sulla superficie cellulare. Una volta legati alla membrana cellulare, gli interferoni avviano una complessa sequenza di eventi intracellulari. Studi in vitro hanno dimostrato che questi includono l'induzione di alcuni enzimi, la soppressione della proliferazione cellulare, attività immunomodulanti come il potenziamento dell'attività fagocitaria dei macrofagi e l'aumento della citotossicità specifica dei linfociti per le cellule bersaglio e l'inibizione della replicazione del virus nelle cellule infettate da virus. cellule.

In uno studio che utilizzava la linea cellulare di epatoblastoma umano HB 611, l'attività antivirale in vitro dell'interferone alfa è stata dimostrata dalla sua inibizione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV).

La correlazione tra questi dati in vitro ei risultati clinici non è nota. Ognuna di queste attività potrebbe contribuire agli effetti terapeutici dell'interferone.

La farmacocinetica di INTRON ® A è stata studiata in 12 volontari maschi sani dopo dosi singole di 5 milioni UI/m 2 somministrate per via intramuscolare, sottocutanea e come infusione endovenosa di 30 minuti in un disegno crossover.

Le concentrazioni sieriche medie di Intron A dopo le iniezioni intramuscolari e sottocutanee erano comparabili. Le concentrazioni sieriche massime ottenute attraverso queste vie erano di circa 18-116 UI/mL e si sono verificate da 3 a 12 ore dopo la somministrazione. L'emivita di eliminazione di Intron A dopo le iniezioni sia intramuscolari che sottocutanee è stata di circa 2-3 ore. Le concentrazioni sieriche non erano rilevabili entro 16 ore dalle iniezioni.

Dopo somministrazione endovenosa, le concentrazioni sieriche di Intron A hanno raggiunto il picco (135-273 UI/mL) entro la fine dell'infusione di 30 minuti, quindi sono diminuite a una velocità leggermente più rapida rispetto alla somministrazione intramuscolare o sottocutanea del farmaco, diventando non rilevabile 4 ore dopo l'infusione . L'emivita di eliminazione è stata di circa 2 ore.

Le concentrazioni di Intron A nelle urine dopo una singola dose (5 milioni UI/m2) non erano rilevabili dopo nessuna delle vie di somministrazione parenterale. Questo risultato era atteso poiché studi preliminari con reni di coniglio isolati e perfusi hanno dimostrato che il rene può essere il sito principale del catabolismo dell'interferone.

Non sono disponibili dati di farmacocinetica per la via di somministrazione intralesionale.

Anticorpi neutralizzanti del siero

Nei pazienti trattati con Intron A testati per l'attività anticorpale negli studi clinici, sono stati rilevati anticorpi neutralizzanti anti-interferone sierico nello 0% (0/90) dei pazienti con leucemia a cellule capellute, nello 0,8% (2/260) dei pazienti trattati intralesionalmente per condilomi acuminata e il 4% (1/24) dei pazienti con sarcoma di Kaposi correlato all'AIDS. Anticorpi sierici neutralizzanti sono stati rilevati in meno del 3% dei pazienti trattati con dosi più elevate di Intron A in tumori maligni diversi dalla leucemia a cellule capellute o dal sarcoma di Kaposi correlato all'AIDS. Il significato clinico della comparsa dell'attività sierica anti-interferone neutralizzante in queste indicazioni non è noto.

Anticorpi sierici neutralizzanti l'interferone sono stati rilevati nel 7% (12/168) dei pazienti durante il trattamento o dopo aver completato da 12 a 48 settimane di trattamento con 3 milioni UI TIW di terapia con Intron A per l'epatite cronica C e nel 13% (6/ 48) dei pazienti che hanno ricevuto la terapia Intron A per l'epatite cronica B a 5 milioni UI QD per 4 mesi e nel 3% (1/33) dei pazienti trattati a 10 milioni UI TIW. Anticorpi sierici neutralizzanti l'interferone sono stati rilevati nel 9% (5/53) dei pazienti pediatrici che hanno ricevuto la terapia con Intron A per l'epatite B cronica a 6 milioni UI/m 2 TIW. Tra tutti i pazienti con epatite cronica B o C, pediatrici e adulti con anticorpi neutralizzanti sierici rilevabili, i titoli rilevati erano bassi (22/24 con titoli inferiori o uguali a 1:40 e 2/24 con titoli inferiori o uguali a 1: 160). La comparsa di attività sierica neutralizzante anti-interferone non sembra influenzare la sicurezza o l'efficacia.

Leucemia a cellule capellute

Negli studi clinici in pazienti con leucemia a cellule capellute, si è verificata una depressione dell'emopoiesi durante i primi 1 o 2 mesi di trattamento con Intron A, con conseguente riduzione del numero di globuli rossi e bianchi circolanti e di piastrine. Successivamente, sia i pazienti splenectomizzati che quelli non splenectomizzati hanno ottenuto miglioramenti sostanziali e prolungati dei granulociti, delle piastrine e dei livelli di emoglobina nel 75% dei pazienti trattati e almeno qualche miglioramento (risposte minori) si è verificato nel 90%. Il trattamento con Intron A ha determinato una diminuzione dell'ipercellularità del midollo osseo e degli infiltrati di cellule capellute. L'indice delle cellule capellute (HCI), che rappresenta la percentuale di cellularità del midollo osseo per la percentuale di infiltrato di cellule capellute, era maggiore o uguale al 50% all'inizio dello studio nell'87% dei pazienti. La percentuale di pazienti con tale HCI è scesa al 25% dopo 6 mesi e al 14% dopo 1 anno. Questi risultati indicano che, anche se il miglioramento ematologico si è verificato in precedenza, può essere necessario un trattamento prolungato con Intron A per ottenere la massima riduzione degli infiltrati di cellule tumorali nel midollo osseo.

La percentuale di pazienti con leucemia a cellule capellute che hanno richiesto trasfusioni di globuli rossi o piastrine è diminuita significativamente durante il trattamento e la percentuale di pazienti con infezioni confermate e gravi è diminuita con il miglioramento della conta dei granulociti. In alcuni pazienti è stata dimostrata l'inversione della splenomegalia e dell'ipersplenismo clinicamente significativo.

È stato condotto uno studio per valutare gli effetti del trattamento prolungato con Intron A sulla durata della risposta per i pazienti che hanno risposto alla terapia iniziale. In questo studio, 126 pazienti che hanno risposto sono stati randomizzati a ricevere un trattamento aggiuntivo con Intron A per 6 mesi o l'osservazione per un periodo comparabile, dopo 12 mesi di terapia iniziale con Intron A. Durante questo periodo di 6 mesi, il 3% (2/66) dei pazienti trattati con Intron A ha avuto una recidiva rispetto al 18% (11/60) che non era stato trattato. Ciò rappresenta una differenza significativa nel tempo di recidiva a favore del trattamento continuato con Intron A ( P = 0.006/0.01, Log Rank/Wilcoxon). Poiché una piccola percentuale della popolazione totale aveva avuto una ricaduta, non è stato possibile stimare il tempo mediano alla ricaduta in nessuno dei due gruppi. Un modello simile nelle recidive è stato osservato quando sono stati valutati tutti i trattamenti randomizzati, compresi quelli oltre i 6 mesi, e i dati di follow-up disponibili. Le recidive del 15% (10/66) tra i pazienti con Intron A si sono verificate in un periodo di tempo significativamente più lungo rispetto al 40% (24/60) con osservazione (P = 0,0002/0,0001, Log Rank/Wilcoxon). Il tempo mediano alla recidiva è stato stimato, utilizzando il metodo di Kaplan-Meier, in 6,8 mesi nel gruppo di osservazione, ma non è stato possibile stimarlo nel gruppo Intron A.

Il successivo follow-up con un tempo mediano di circa 40 mesi ha dimostrato una sopravvivenza globale dell'87,8%. In un gruppo di controllo storico comparabile seguito per 24 mesi, la sopravvivenza mediana complessiva è stata di circa il 40%.

Melanoma maligno

La sicurezza e l'efficacia di Intron A sono state valutate come adiuvante al trattamento chirurgico in pazienti con melanoma che erano liberi da malattia (post intervento chirurgico) ma ad alto rischio di recidiva sistemica. Questi includevano pazienti con lesioni di spessore di Breslow maggiori di 4 mm o pazienti con lesioni di qualsiasi spessore di Breslow con coinvolgimento linfonodale primario o ricorrente. In uno studio randomizzato e controllato su 280 pazienti, 143 pazienti hanno ricevuto la terapia Intron A a 20 milioni UI/m 2 per via endovenosa cinque volte a settimana per 4 settimane (fase di induzione) seguita da 10 milioni UI/m 2 per via sottocutanea tre volte a settimana per 48 settimane (fase di manutenzione). Nello studio clinico, la dose media giornaliera di Intron A somministrata ai pazienti è stata di 19,1 milioni UI/m 2 durante la fase di induzione e di 9,1 milioni UI/m 2 durante la fase di mantenimento. La terapia con Intron A è stata iniziata meno o uguale a 56 giorni dopo la resezione chirurgica. I restanti 137 pazienti sono stati osservati.

La terapia con Intron A ha prodotto un aumento significativo della sopravvivenza libera da ricadute e globale. Il tempo mediano alla recidiva per i pazienti trattati con Intron A rispetto ai pazienti in osservazione è stato di 1,72 anni rispetto a 0,98 anni ( P <0,01, log rango stratificato). Il tasso stimato di sopravvivenza libera da recidiva a 5 anni, utilizzando il metodo Kaplan-Meier, è stato del 37% per i pazienti trattati con Intron A rispetto al 26% per i pazienti in osservazione. Il tempo di sopravvivenza globale mediano per i pazienti trattati con Intron A rispetto ai pazienti in osservazione è stato di 3,82 anni contro 2,78 anni ( P = 0,047, Log Rank stratificato). Il tasso di sopravvivenza globale stimato a 5 anni, utilizzando il metodo Kaplan-Meier, è stato del 46% per i pazienti trattati con Intron A rispetto al 37% per i pazienti in osservazione.

In un secondo studio su 642 pazienti con melanoma ad alto rischio resecato, i soggetti sono stati randomizzati equamente a uno dei tre gruppi: terapia con Intron A ad alte dosi per 1 anno (stesso programma come sopra), terapia con Intron A a basse dosi per 2 anni (3 MU/d TIW SC), e osservazione. Coerentemente con lo studio precedente, la terapia con Intron A ad alte dosi ha dimostrato un miglioramento della sopravvivenza libera da recidiva (RFS stimata a 3 anni 48% contro 41% RFS mediana 2,4 rispetto a 1,6 anni, P = non significativo). La sopravvivenza libera da ricadute nel braccio Intron A a basso dosaggio era simile a quella osservata nel braccio di osservazione. Né la terapia con Intron A ad alte dosi né a basse dosi ha mostrato un beneficio nella sopravvivenza globale rispetto all'osservazione in questo studio.

Linfoma follicolare

La sicurezza e l'efficacia di Intron A in combinazione con CHVP, un regime chemioterapico di combinazione, sono state valutate come trattamento iniziale in pazienti con linfoma non Hodgkin follicolare di stadio III/IV, clinicamente aggressivo e di grandi dimensioni. Un grande carico tumorale è stato definito dalla presenza di uno qualsiasi dei seguenti: una massa tumorale nodale o extranodale con un diametro superiore a 7 cm coinvolgimento di almeno tre siti nodali (ciascuno con un diametro superiore a 3 cm) sintomi sistemici splenomegalia versamento sieroso, coinvolgimento orbitario o epidurale, compressione ureterale o leucemia.

In uno studio randomizzato e controllato, 130 pazienti hanno ricevuto la terapia CHVP e 135 pazienti hanno ricevuto la terapia CHVP più la terapia Intron A a 5 milioni UI per via sottocutanea tre volte alla settimana per la durata di 18 mesi. La chemioterapia CHVP consisteva in ciclofosfamide 600 mg/m 2 , doxorubicina 25 mg/m 2 e teniposide (VM-26) 60 mg/m 2 , somministrati per via endovenosa il giorno 1 e prednisone alla dose giornaliera di 40 mg/m 2 somministrati per via orale nei giorni da 1 a 5. Il trattamento consisteva in sei cicli di CHVP somministrati mensilmente, seguiti da altri sei cicli somministrati ogni 2 mesi per 1 anno. I pazienti di entrambi i gruppi di trattamento hanno ricevuto un totale di 12 cicli di CHVP in 18 mesi.

Il gruppo che ha ricevuto la combinazione di terapia Intron A più CHVP ha avuto una sopravvivenza libera da progressione significativamente più lunga (2,9 anni contro 1,5 anni, P = 0,0001, Log Rank test). Dopo un follow-up mediano di 6,1 anni, la sopravvivenza mediana per i pazienti trattati con solo CHVP era di 5,5 anni mentre la sopravvivenza mediana per i pazienti trattati con CHVP più terapia con Intron A non era stata raggiunta (P = 0.004, Log Rank test). In tre ulteriori studi pubblicati, randomizzati e controllati sull'aggiunta di interferone alfa a regimi chemioterapici di combinazione contenenti antracicline, 1-3 l'aggiunta di interferone alfa è stata associata a una sopravvivenza libera da progressione significativamente prolungata. Le differenze nella sopravvivenza globale non sono state osservate in modo coerente.

Condilomi acuminati

I condilomi acuminati (verruche veneree o genitali) sono associati alle infezioni del virus del papilloma umano (HPV). La sicurezza e l'efficacia di Intron A nel trattamento dei condilomi acuminati sono state valutate in tre studi clinici controllati in doppio cieco. In questi studi, dosi di Intron A di 1 milione UI per lesione sono state somministrate per via intralesionale tre volte alla settimana (TIW), in meno o uguali a 5 lesioni per paziente per 3 settimane. I pazienti sono stati osservati fino a 16 settimane dopo il completamento dell'intero ciclo di trattamento.

Il trattamento dei condilomi con Intron A è risultato significativamente più efficace del placebo, come misurato dalla scomparsa delle lesioni, dalla diminuzione delle dimensioni della lesione e da un cambiamento generale dello stato della malattia. Dei 192 pazienti trattati con Intron A e 206 pazienti trattati con placebo valutabili per l'efficacia al momento della migliore risposta nel corso dello studio, il 42% dei pazienti con Intron A rispetto al 17% dei pazienti trattati con placebo ha manifestato la scomparsa di tutte le lesioni trattate. Allo stesso modo, il 24% dei pazienti con Intron A rispetto all'8% dei pazienti trattati con placebo ha registrato una riduzione marcata (dal 75% a meno del 100%) delle dimensioni della lesione, il 18% rispetto al 9% ha sperimentato una riduzione moderata (dal 50% al 75%) delle dimensioni della lesione, 10 Il % contro il 42% ha avuto una leggera riduzione (meno del 50%) delle dimensioni della lesione, il 5% contro il 24% non ha avuto alcun cambiamento nelle dimensioni della lesione e lo 0% contro l'1% ha avuto esacerbazioni ( P <0.001).

In uno di questi studi, il 43% (54/125) dei pazienti in cui sono state trattate lesioni multiple (inferiori o uguali a 3) ha manifestato la completa eliminazione di tutte le lesioni trattate nel corso dello studio. Di questi pazienti, l'81% è rimasto eliminato 16 settimane dopo l'inizio del trattamento.

I pazienti che non hanno ottenuto la cancellazione totale di tutte le lesioni trattate hanno avuto queste stesse lesioni trattate con un secondo ciclo di terapia. Durante questo secondo ciclo di trattamento, dal 38% al 67% dei pazienti ha avuto la cancellazione di tutte le lesioni trattate. La percentuale complessiva di pazienti che avevano eliminato tutte le lesioni trattate dopo due cicli di trattamento variava dal 57% all'85%.

Le lesioni trattate con Intron A hanno mostrato un miglioramento entro 2-4 settimane dall'inizio del trattamento nello studio di cui sopra. La risposta massima alla terapia con Intron A è stata osservata da 4 a 8 settimane dopo l'inizio del trattamento.

La risposta alla terapia con Intron A è stata migliore nei pazienti con condilomi di durata inferiore rispetto ai pazienti con lesioni di durata maggiore.

Un altro studio ha coinvolto 97 pazienti in cui tre lesioni sono state trattate con un'iniezione intralesionale di 1,5 milioni UI di Intron A per lesione seguita da un'applicazione topica di 25% di podofillina, o un'applicazione topica di 25% di sola podofillina. Il trattamento è stato somministrato una volta alla settimana per 3 settimane. Il trattamento combinato di Intron A e podofillina si è dimostrato significativamente più efficace della sola podofillina, come determinato dal numero di pazienti le cui lesioni sono scomparse. Questa differenza significativa nella risposta era evidente dopo il secondo trattamento (settimana 3) e continuò per 8 settimane dopo il trattamento. Al momento della migliore risposta del paziente, il 67% (33/49) dei pazienti trattati con Intron A e con podofillina aveva tutte e tre le lesioni trattate chiare mentre il 42% (20/48) dei pazienti trattati con podofillina aveva tutte e tre chiare (P=0,003).

Sarcoma di Kaposi correlato all'AIDS

La sicurezza e l'efficacia di Intron A nel trattamento del sarcoma di Kaposi (KS), una manifestazione comune della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), sono state valutate in studi clinici su 144 pazienti.

In uno studio, dosi di Intron A di 30 milioni UI/m 2 sono state somministrate per via sottocutanea tre volte alla settimana (TIW) a pazienti con KS correlato all'AIDS. Le dosi sono state aggiustate per la tolleranza del paziente. La dose settimanale media erogata nelle prime 4 settimane era di 150 milioni di UI alla fine delle 12 settimane, in media di 110 milioni di UI/settimana e di 24 settimane in media di 75 milioni di UI/settimana.

Il 44% dei pazienti asintomatici ha risposto contro il 7% dei pazienti sintomatici. Il tempo mediano alla risposta è stato di circa 2 mesi e 1 mese, rispettivamente, per i pazienti asintomatici e sintomatici. La durata mediana della risposta è stata di circa 3 mesi e 1 mese, rispettivamente, per i pazienti asintomatici e sintomatici. I rapporti T4/T8 al basale erano 0,46 per i responder rispetto a 0,33 per i non responder.

In un altro studio, dosi di Intron A di 35 milioni di UI sono state somministrate per via sottocutanea, giornalmente (QD), per 12 settimane. Il trattamento di mantenimento, con somministrazione a giorni alterni (QOD), è stato continuato fino a 1 anno nei pazienti che hanno ottenuto risposte antitumorali e antivirali. Il tempo mediano alla risposta è stato di 2 mesi e la durata mediana della risposta è stata di 5 mesi nei pazienti asintomatici.

In tutti gli studi, la probabilità di risposta era maggiore nei pazienti con sistema immunitario relativamente intatto, valutata dalla conta CD4 al basale (intercambiabile con la conta T4). I risultati a dosi di 30 milioni UI/m 2 TIW e 35 milioni UI/QD erano simili per via sottocutanea e sono forniti insieme nella TABELLA 1. Questa tabella dimostra la relazione della risposta alla conta CD4 al basale in pazienti sia asintomatici che sintomatici nei 30 milioni di UI /m 2 TIW e i gruppi di trattamento da 35 milioni di UI/QD.

Nel gruppo di studio di 30 milioni di UI, il 7% (5/72) dei pazienti ha risposto completamente e il 22% (16/72) dei pazienti ha risposto parzialmente. Lo studio da 35 milioni di UI ha avuto il 13% (3/23 pazienti) di responder completi e il 17% (4/23) di responder parziali.

Per i pazienti che hanno ricevuto 30 milioni di UI TIW, il tempo di sopravvivenza mediano era più lungo nei pazienti con CD4 superiore a 200 (30,7 mesi) rispetto ai pazienti con CD4 inferiore o uguale a 200 (8,9 mesi). Tra i responder, il tempo di sopravvivenza mediano è stato di 22,6 mesi contro 9,7 mesi nei non responder.

Epatite cronica C

La sicurezza e l'efficacia di Intron A nel trattamento dell'epatite cronica C sono state valutate in 5 studi clinici randomizzati in cui è stata valutata una dose di Intron A di 3 milioni UI tre volte alla settimana (TIW). I primi tre studi erano studi controllati con placebo che valutavano un ciclo di terapia di 6 mesi (24 settimane). In ciascuno dei tre studi, la terapia con Intron A ha determinato una riduzione dell'alanina aminotransferasi (ALT) sierica in una proporzione maggiore di pazienti rispetto ai pazienti di controllo alla fine dei 6 mesi di somministrazione. Durante i 6 mesi di follow-up, circa il 50% dei pazienti che hanno risposto ha mantenuto la risposta all'ALT. Un'analisi combinata che confrontava le biopsie epatiche pretrattamento e post-trattamento ha rivelato un miglioramento istologico in una proporzione statisticamente significativamente maggiore di pazienti trattati con Intron A rispetto ai controlli.

Altri due studi hanno studiato durate di trattamento più lunghe (fino a 24 mesi). 5,6 I pazienti nei due studi per valutare la durata del trattamento più lunga avevano epatite con o senza cirrosi in assenza di malattia epatica scompensata. La risposta completa al trattamento è stata definita come la normalizzazione degli ultimi due livelli sierici di ALT durante il periodo di trattamento. Una risposta sostenuta è stata definita come una risposta completa alla fine del periodo di trattamento, con valori di ALT normali sostenuti della durata di almeno 6 mesi dopo l'interruzione della terapia.

Nello Studio 1, tutti i pazienti sono stati inizialmente trattati con Intron A 3 milioni UI TIW per via sottocutanea per 24 settimane (periodo run-in). I pazienti che hanno completato il periodo di trattamento iniziale di 24 settimane sono stati quindi assegnati in modo casuale a non ricevere ulteriori trattamenti o a ricevere 3 milioni di UI TIW per altre 48 settimane. Nello Studio 2, i pazienti che soddisfacevano i criteri di ingresso sono stati assegnati in modo casuale a ricevere Intron A 3 milioni UI TIW per via sottocutanea per 24 settimane o a ricevere Intron A 3 milioni UI TIW per via sottocutanea per 96 settimane. In entrambi gli studi, il follow-up dei pazienti è stato variabile e alcuni dati raccolti sono stati retrospettivi.

I risultati mostrano che durate più lunghe della terapia con Intron A hanno migliorato il tasso di risposta sostenuta (vedere TABELLA 2). Nei pazienti con risposte complete (CR) alla terapia con Intron A dopo 6 mesi di trattamento (149/352 [42%]), le risposte sono state meno spesso sostenute se il farmaco è stato interrotto (21/70 [30%]) rispetto a se è stato continuato da 18 a 24 mesi (44/79 [56%]). Di tutti i pazienti randomizzati, il tasso di risposta sostenuta nei pazienti che hanno ricevuto 18 o 24 mesi di terapia è stato rispettivamente del 22% e del 26% nei due studi. Nei pazienti che non hanno avuto una CR entro 6 mesi, la terapia aggiuntiva non ha prodotto risposte significativamente maggiori, poiché quasi tutti i pazienti che hanno risposto alla terapia lo hanno fatto entro le prime 16 settimane di trattamento.

Un sottogruppo (meno del 50%) di pazienti degli studi combinati sul dosaggio esteso ha eseguito biopsie epatiche sia prima che dopo il trattamento con Intron A. In entrambi gli studi è stato osservato un miglioramento dell'attività necroinfiammatoria valutata retrospettivamente dagli indici di attività istologica di Knodell (Studio 1) e Scheuer (Studio 2). Un numero maggiore di pazienti (58%, 45/78) è migliorato con la terapia estesa rispetto a una terapia più breve (6 mesi) (38%, 34/89) in questo sottogruppo.

Il trattamento di combinazione con Intron A e REBETOL ® (ribavirina USP) ha fornito una significativa riduzione della carica virologica e una migliore risposta istologica in pazienti adulti con malattia epatica compensata che erano na&ulve al trattamento o avevano avuto una recidiva dopo la terapia con solo interferone alfa pazienti pediatrici precedentemente non trattati con alfa l'interferone ha avuto una risposta virologica sostenuta. Vedere le informazioni sulla prescrizione di REBETOL per ulteriori informazioni.

Epatite cronica B

La sicurezza e l'efficacia di Intron A nel trattamento dell'epatite cronica B sono state valutate in tre studi clinici in cui dosi di Intron A da 30 a 35 milioni UI a settimana sono state somministrate per via sottocutanea (SC), come 5 milioni UI al giorno (QD), o 10 milioni UI tre volte a settimana (TIW) per 16 settimane rispetto a nessun trattamento. Tutti i pazienti avevano 18 anni o più con malattia epatica compensata e presentavano infezione cronica da virus dell'epatite B (HBV) (siero HBsAg positivo per almeno 6 mesi) e replicazione dell'HBV (siero HBeAg positivo). I pazienti erano anche positivi all'HBV-DNA sierico, un indicatore aggiuntivo della replicazione dell'HBV, come misurato da un test di ricerca. 7,8 Tutti i pazienti presentavano valori elevati di alanina aminotransferasi (ALT) e biopsia epatica compatibili con la diagnosi di epatite cronica. I pazienti con la presenza di anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana (anti-HIV) o anticorpi contro il virus dell'epatite delta (anti-HDV) nel siero sono stati esclusi dagli studi.

La risposta virologica al trattamento è stata definita in questi studi come una perdita dei marcatori sierici della replicazione dell'HBV (HBeAg e HBV DNA). I parametri secondari di risposta includevano la perdita di HBsAg sierico, la diminuzione dell'ALT sierica e il miglioramento dell'istologia epatica.

In ciascuno dei due studi randomizzati controllati, una proporzione significativamente maggiore di pazienti trattati con Intron A ha mostrato una risposta virologica rispetto ai pazienti di controllo non trattati (vedere TABELLA 3). In un terzo studio senza un gruppo di controllo simultaneo, è stato osservato un tasso di risposta simile alla terapia con Intron A. Il pretrattamento con prednisone, valutato in due degli studi, non ha migliorato il tasso di risposta e non ha fornito ulteriori benefici.

La risposta alla terapia Intron A è stata durevole. Nessun paziente che ha risposto alla terapia con Intron A alla dose di 5 milioni UI QD o 10 milioni UI TIW ha avuto recidive durante il periodo di follow-up, che variava da 2 a 6 mesi dopo la fine del trattamento. La perdita di HBeAg e HBV DNA sierici è stata mantenuta nel 100% dei 19 pazienti responsivi seguiti per 3,5-36 mesi dopo la fine della terapia.

In una percentuale di pazienti responsivi, la perdita di HBeAg è stata seguita dalla perdita di HBsAg. L'HBsAg è stato perso nel 27% (4/15) dei pazienti che hanno risposto alla terapia con Intron A alla dose di 5 milioni UI QD e nel 35% (8/23) dei pazienti che hanno risposto a 10 milioni UI TIW. Nessun paziente di controllo non trattato ha perso HBsAg in questi studi.

In uno studio in corso per valutare la durata a lungo termine della risposta virologica, 64 pazienti che hanno risposto alla terapia con Intron A sono stati seguiti per 1,1-6,6 anni dopo il trattamento il 95% (61/64) rimane HBeAg sierico negativo e il 49% (30/ 61) perso HBsAg sierico.

La terapia con Intron A ha determinato la normalizzazione dell'ALT sierica in una proporzione significativamente maggiore di pazienti trattati rispetto ai pazienti non trattati in ciascuno dei due studi controllati (vedere TABELLA 4). In un terzo studio senza un gruppo di controllo simultaneo, è stata osservata la normalizzazione delle ALT sieriche nel 50% (12/24) dei pazienti che ricevevano la terapia con Intron A.

La risposta virologica è stata associata a una riduzione delle ALT sieriche a valori normali o quasi normali (inferiori o uguali a 1,5 volte il limite superiore della norma) nell'87% (13/15) dei pazienti che hanno risposto alla terapia con Intron A a 5 milioni UI QD, e il 100% (23/23) dei pazienti che rispondono a 10 milioni di UI TIW.

Il miglioramento dell'istologia epatica è stato valutato negli studi 1 e 3 confrontando biopsie epatiche pretrattamento e post-trattamento a 6 mesi utilizzando l'indice di attività istologica Knodell semiquantitativo. 9 Non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa nell'istologia epatica nei pazienti trattati rispetto ai pazienti di controllo nello Studio 1. Sebbene sia stato osservato un miglioramento istologico statisticamente significativo rispetto al basale nei pazienti trattati nello Studio 3 ( P &le0.01), non vi era alcun gruppo di controllo per il confronto . Di quei pazienti che mostravano una risposta virologica dopo il trattamento con 5 milioni di UI QD o 10 milioni di UI TIW, è stato osservato un miglioramento istologico nell'85% (17/20) rispetto al 36% (9/25) dei pazienti che non erano responder virologi. Il miglioramento istologico era dovuto principalmente alla diminuzione della gravità della necrosi, della degenerazione e dell'infiammazione nelle regioni periportale, lobulare e portale del fegato (categorie di Knodell I + II + III). È stato osservato un miglioramento istologico continuo in quattro pazienti responsivi che hanno perso HBsAg sierico e sono stati seguiti da 2 a 4 anni dopo la fine della terapia con Intron A. 10

La sicurezza e l'efficacia di Intron A nel trattamento dell'epatite cronica B sono state valutate in uno studio randomizzato controllato su 149 pazienti di età compresa tra 1 anno e 17 anni. Settantadue pazienti sono stati trattati con 3 milioni UI/m 2 di terapia Intron A somministrata per via sottocutanea tre volte alla settimana (TIW) per 1 settimana, la dose è stata poi aumentata a 6 milioni UI/m 2 TIW per un minimo di 16 settimane fino a 24 settimane. Il dosaggio settimanale massimo era di 10 milioni di UI TIW. Settantasette pazienti erano controlli non trattati. I criteri di accesso allo studio e di risposta erano identici a quelli descritti nella popolazione di pazienti adulti.

I pazienti trattati con la terapia Intron A hanno avuto una risposta migliore (perdita di HBV DNA e HBeAg a 24 settimane di follow-up) rispetto ai controlli non trattati (24% [17/72] rispetto al 10% [8/77] P = 0,05) . Sedici dei 17 responder trattati con la terapia con Intron A sono rimasti HBV DNA e HBeAg negativi e avevano un'ALT sierica normale da 12 a 24 mesi dopo il completamento del trattamento. L'HBsAg sierico è diventato negativo in 7 pazienti su 17 che hanno risposto alla terapia con Intron A. Nessuno dei pazienti di controllo che avevano una risposta HBV DNA e HBeAg è diventato HBsAg negativo. A 24 settimane di follow-up, la normalizzazione delle ALT sieriche era simile nei pazienti trattati con la terapia con Intron A (17%, 12/72) e nei pazienti di controllo non trattati (16%, 12/77). I pazienti con un HBV DNA al basale inferiore a 100 pg/mL avevano una maggiore probabilità di rispondere alla terapia con Intron A rispetto ai pazienti con un HBV DNA al basale superiore a 100 pg/mL (rispettivamente 35% contro 9%). I pazienti che hanno contratto l'epatite B attraverso la trasmissione verticale materna hanno avuto tassi di risposta inferiori rispetto a quelli che hanno contratto la malattia con altri mezzi (rispettivamente 5% contro 31%). Non c'erano prove che gli effetti su HBV DNA e HBeAg fossero limitati a specifiche sottopopolazioni basate su età, sesso o razza.

TABELLA 1 RISPOSTA PER CONTEGGIO CD4 DI BASELINE* IN PAZIENTI CON KS CORRELATI ALL'AIDS
30 milioni UI/m 2 TIW, SC e 35 milioni UI QD, SC
Asintomatico Sintomatico
* I dati per CD4 e la classificazione asintomatica e sintomatica non erano disponibili per tutti i pazienti.
CD4<200 4/14 (29%) 0/19 (0%)
200&leCD4&le400 6/12 (50%) 0/5 (0%)
> 58%
CD4>400 5/7 (71%) 0/0 (0%)
TABELLA 2 TASSO DI RISPOSTA SOSTENUTO ALLE ALT RISPETTO ALLA DURATA DELLA TERAPIA IN PAZIENTI CON EPATITE C CRONICA Intron A 3 milioni UI TIW
Gruppo di trattamento* - Numero di pazienti (%)
Numero di studio Intron A 3 milioni UI 24 settimane di trattamento Intron A 3 milioni UI 72 o 96 settimane di trattamento e pugnale Differenza (esteso &mdash 24 settimane)
(95% CI) e Pugnale
* Gruppi intent-to-treat. &pugnale Studio 1: 72 settimane di trattamento Studio 2: 96 settimane di trattamento. &Dagger Intervalli di confidenza aggiustati per confronti multipli a causa di 3 bracci di trattamento nello studio.
Risposta ALT alla fine del follow-up
1 12/101 (12%) 23/104 (22%) 10% (-3, 24)
2 9/67 (13%) 21/80 (26%) 13% (-4, 30)
Studi combinati 21/168 (12.5%) 44/184 (24%) 11.4% (2, 21)
Risposta ALT alla fine del trattamento
1 40/101 (40%) 51/104 (49%) --
2 32/67 (48%) 35/80 (44%) --
TABELLA 3 RISPOSTA VIROLOGICA* IN PAZIENTI CON EPATITE B CRONICA
Gruppo di trattamento&pugnale - Numero di pazienti (%)
Numero di studio Intron A 5 milioni UI QD Intron A 10 milioni UI TIW Controlli non trattati Valore P&Dagger
* Perdita di HBeAg e HBV DNA entro 6 mesi dopo la terapia. &pugnale Pazienti pretrattati con prednisone non mostrati. &Dagger Intron Un gruppo di trattamento rispetto al controllo non trattato. § Pazienti di controllo non trattati valutati dopo un periodo di osservazione di 24 settimane. Un sottogruppo ha successivamente ricevuto la terapia con Intron A. Non è applicabile un confronto diretto (NA).
1 7 15/38 (39%) -- -- 3/42 (7%) 0.0009
2 -- -- 10/24 (42%) 1/22 (5%) 0.005
3 8 -- -- 13/24&sec (54%) 2/27 (7%)&sec NA&sezione
Tutti gli studi 15/38 (39%) 23/48 (48%) 6/91 (7%) --
TABELLA 4 RISPOSTE ALT* IN PAZIENTI CON EPATITE B CRONICA
Gruppo di trattamento - Numero di pazienti (%)
Numero di studio Intron A 5 milioni UI QD Intron A 10 milioni UI TIW Controlli non trattati Valore P&dagger
* Riduzione dell'ALT sierica alla normalità entro 6 mesi dopo la terapia. &pugnale Intron A gruppo di trattamento contro controllo non trattato. &Dagger Pazienti di controllo non trattati valutati dopo un periodo di osservazione di 24 settimane. Un sottogruppo ha successivamente ricevuto la terapia con Intron A. Non è applicabile un confronto diretto (NA).
1 16/38 (42%) -- -- 8/42 (19%) 0.03
2 -- -- 10/24 (42%) 1/22 (5%) 0.0034
3 -- -- 12/24&Pugnale (50%) 2/27 (7%) e pugnale NA&Pugnale
Tutti gli studi 16/38 (42%) 22/48 (46%) 11/91 (12%) --

L'antico enzima potrebbe aumentare la potenza delle biopsie liquide per rilevare e profilare i tumori

Gli scienziati stanno sviluppando una serie di test medici chiamati biopsie liquide in grado di rilevare rapidamente la presenza di tumori, malattie infettive e altre condizioni solo da un piccolo campione di sangue. I ricercatori dell'Università del Texas ad Austin stanno sviluppando un nuovo strumento per la biopsia liquida che potrebbe presto fornire ai medici un quadro più completo della malattia di un individuo, migliorando le loro possibilità di trovare il miglior trattamento, risparmiando anche ai pazienti il ​​dolore, il disagio e il lungo tempi di attesa associati alle biopsie chirurgiche.

Alan Lambowitz, professore presso l'Istituto di biologia cellulare e molecolare e il Dipartimento di bioscienze molecolari, e il suo team stanno studiando un antico enzima nei batteri che può essere utilizzato per rilevare frammenti di materiale genetico versati dal cancro o da altre cellule malate nell'organismo di un paziente. flusso sanguigno.

Molte biopsie liquide attuali possono rilevare il DNA nel sangue, altre possono rilevare l'RNA, sebbene tendano a perdere molti biomarcatori chiave dell'RNA e ad interpretare erroneamente gli altri. Ma questo antico enzima, descritto in un articolo pubblicato oggi sulla rivista Cellula molecolare, rileva l'intera gamma di RNA con una precisione molto maggiore, utile per comprendere sia il profilo generale di una malattia come il cancro sia informazioni specifiche sulla sua attività in un particolare paziente. Questo metodo migliorato potrebbe fornire uno strumento chiave per i medici che perseguono il sogno della medicina di precisione, o trattamenti su misura per gli individui in base alla loro genetica e alle storie di vita, nonché agli aspetti unici delle loro malattie.

In questo nuovo studio, la ricercatrice post-dottorato Jennifer Stamos ha scoperto per la prima volta la struttura molecolare di questo enzima che rileva l'RNA in azione, offrendo indizi su come funziona e su come può essere migliorato per l'uso nei test medici.

Sia il DNA che l'RNA portano informazioni genetiche utili per comprendere uno stato patologico come il cancro. DNA è come un menu in un ristorante, contenente tutte le informazioni sui pasti che un cliente può scegliere in un dato giorno, mentre RNA è come l'ordine del cliente: i numeri e i tipi specifici di pasti effettivamente richiesti.

"I biomarcatori del DNA sono statici. Forniscono informazioni sulle mutazioni che causano una malattia, ma non forniscono informazioni sull'effetto di queste mutazioni sui processi cellulari, che possono differire in individui diversi", ha affermato Lambowitz. Questo è uno dei motivi per cui una mutazione che causa il cancro può avere effetti diversi e rispondere in modo diverso al trattamento, a seconda dell'individuo, una considerazione chiave per la medicina personalizzata.

Al contrario, "il monitoraggio degli RNA cellulari fornisce un'istantanea di ciò che sta accadendo esattamente in un tessuto malato, come un tumore, in un momento particolare", ha detto Lambowitz."Il metodo può essere utilizzato per monitorare la progressione quotidiana della malattia e la risposta al trattamento e per prevedere come diversi individui con lo stesso cancro risponderanno a trattamenti diversi".

Lambowitz prevede una biopsia liquida che, in combinazione con altri strumenti, fornirebbe agli operatori sanitari tutte queste informazioni. Il gruppo di enzimi che studia e che crede possa aiutare sono chiamati TGIRT (pronunciato TIE-girts), abbreviazione di trascrittasi inversa introne del gruppo II termostabile. I TGIRT trovano filamenti di RNA e creano filamenti complementari di DNA che codificano le stesse informazioni e possono essere rapidamente sequenziati per fornire informazioni diagnostiche. Poiché sono in grado di creare con precisione copie del DNA di quasi tutti i tipi di RNA da quantità molto piccole di materiale di partenza, farebbero un lavoro migliore nel catturare i biomarcatori per la malattia rispetto a qualsiasi cosa attualmente disponibile in una biopsia liquida a base di RNA, secondo Lambowitz.

Lambowitz e il suo team stanno collaborando con i medici per testare biopsie liquide basate su questo enzima TGIRT. Uno, presso l'MD Anderson Cancer Center dell'Università del Texas a Houston, si concentra sul cancro al seno infiammatorio. Un altro, al City of Hope National Medical Center vicino a Los Angeles, si concentra sul mieloma multiplo, una forma di cancro che colpisce le cellule del midollo osseo. In caso di successo, queste nuove biopsie liquide si unirebbero ad altre tecniche di biopsia liquida già in uso, come quella che rileva nel sangue delle madri in gravidanza anomalie cromosomiche in un feto in via di sviluppo.

I TGIRT sono antichi enzimi che risalgono a un'epoca in cui le informazioni genetiche erano immagazzinate principalmente nell'RNA ma la vita stava passando al DNA. Un'altra importante scoperta dello studio è stata che gli enzimi TGIRT sono notevolmente simili agli enzimi dei virus a RNA, che copiano l'RNA. Ciò evidenzia il potenziale ruolo evolutivo dei TGIRT e di altri enzimi strettamente correlati nell'evoluzione degli organismi odierni, che utilizzano il DNA per il materiale genetico.

L'altro coautore dello studio è Alfred Lentzsch, uno studente laureato in bioscienze molecolari.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health e dalla Welch Foundation.

Gli enzimi TGIRT e i metodi per il loro utilizzo sono oggetto di brevetti e domande di brevetto che sono stati concessi in licenza dall'Università del Texas e dalla East Tennessee State University a una società spin-off dell'Università del Texas, InGex LLC. Lambowitz e l'università sono azionisti di minoranza di InGex e l'università, Lambowitz e alcuni dei suoi membri attuali ed ex di laboratorio ricevono pagamenti di royalty dalla vendita di enzimi e kit TGIRT e dalla licenza di proprietà intellettuale.


Query vs trascrizioni di riferimento

Lo scopo originale di GffCompare era valutare quanto accuratamente una serie di trascrizioni di "romanzi" ("query") corrisponda a un'annotazione di riferimento. Per valutare correttamente la precisione e la sensibilità quando si confrontano due serie di trascrizioni, è necessario prestare particolare attenzione alle voci "duplicate" o "ridondanti" all'interno di ciascuna serie.

GffCompare cerca di rilevare e rimuovere tali trascrizioni duplicate e utilizza ipotesi leggermente diverse per il set *riferimento* (quello fornito con l'opzione -r) rispetto al set "query". GffCompare è per impostazione predefinita più rigoroso quando valuta la ridondanza nel set di riferimento rispetto al set di query. Questa "rigorosità" colpisce anche in modo diverso le trascrizioni a esone singolo (SET) e le trascrizioni a esone multiple (MET):

  • Quando si caricano le trascrizioni di riferimento:
    • I SET (trascrizioni di un singolo esone) sono considerati "duplicati" (cioè corrispondenti e ridondanti) se quello più corto è completamente contenuto entro i limiti di quello più grande E se quello più corto è almeno l'80% della lunghezza di quello più grande
    • I MET sono considerati ridondanti se hanno una catena di introni completamente corrispondente E se i confini della trascrizione più breve sono completamente contenuto entro i confini di quello più grande (quindi gli esoni terminali di una trascrizione sono entrambi sempre più lunghi o uguali agli esoni terminali sovrapposti dell'altro).
    • I SET sono considerati ridondanti utilizzando una valutazione di "corrispondenza" fuzzy come questa:
      • la regione sovrapposta è >= 80% della lunghezza della trascrizione più grande OR ( >= 70% della lunghezza della trascrizione più grande AND >= 80% della lunghezza della trascrizione più corta) Quest'ultima clausola sembra un po' ridondante ma quella particolare check è usato anche da qualche altra parte in gffcompare, vale a dire per i casi di "contenimento inverso" quando volevamo rilassare il modo in cui valutiamo una "corrispondenza" con un riferimento quando il riferimento è più corto della query e possibilmente "quasi contenuto" all'interno della query .

      A causa di questi diversi modi di valutare la "ridondanza" all'interno del set di trascrizioni di query rispetto alle trascrizioni di riferimento, si potrebbe scoprire che l'esecuzione di GffCompare di un insieme di trascrizioni rispetto a se stesso può in alcuni casi portare a numeri di accuratezza che NON sono tutti al 100% in il file di output delle statistiche, se quel set ha trascrizioni che potrebbero essere trovate "ridondanti" in modo diverso quando il file viene caricato come set "query" rispetto a quando lo stesso file viene caricato come riferimento set.

      GffCompare può essere forzato a utilizzare gli stessi criteri di "ridondanza" sia per le query che per i set di dati di riferimento utilizzando il pulsante -S opzione che impone lo stesso "controllo rigoroso" del contenimento dei confini ecc. per il set di dati "query" come per il set di dati di riferimento.


      Generazione di incertezza basata sul quartiere nei social network

      Imprecisione, incompletezza e dinamica sono presenti in un'ampia gamma di applicazioni di rete. È difficile decidere la relazione di incertezza tra i nodi poiché i modelli tradizionali non sono significativi nelle reti incerte e la complessità computazionale intrinseca dei problemi con incertezza è sempre intrattabile. In questo articolo, studiamo come catturare l'incertezza nelle reti trasformando una serie di istantanee di una rete in un grafico incerto. Viene inoltre proposto un nuovo schema di campionamento che consente lo sviluppo di algoritmi efficienti per misurare l'incertezza nelle reti. Considerando gli aspetti pratici della relazione di vicinato nelle reti reali, viene introdotto un framework per trasformare una rete incerta in una rete ponderata deterministica in cui i pesi sui bordi possono essere misurati dall'indice di tipo Jaccard. I risultati completi della valutazione sperimentale su dati reali dimostrano l'efficacia e l'efficienza dei nostri algoritmi.

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      Sfondo

      Il complesso della sclerosi tuberosa (TSC) è una malattia autosomica dominante caratterizzata dallo sviluppo di amartomi in una varietà di organi e tessuti, inclusi cervello, pelle e reni [1]. La penetranza è elevata ma le manifestazioni fenotipiche della malattia sono variabili. Alcuni individui mostrano solo lievi segni di malattia, a volte senza sintomi chiari. Altri sono gravemente colpiti fin dalla tenera età e in più siti in tutto il corpo. Circa i due terzi dei casi sono sporadici.

      Nel 75-90% degli individui testati classificati come TSC definita secondo i criteri diagnostici clinici della Consensus Conference del 1998 [2], una mutazione in TSC1 sul cromosoma 9q34 o TSC2 sul cromosoma 16p13.3 è identificato [3]. TSC1 e TSC2 sono geni oncosoppressori che codificano rispettivamente per hamartin (TSC1 130 kDa) e tuberina (TSC2 200 kDa). TSC1 e TSC2 formano un complesso proteico stabile che in risposta a diversi segnali cellulari, in particolare fattori di crescita e disponibilità di energia, regola l'attività del bersaglio meccanicistico del complesso 1 della rapamicina (mTOR) (TORC1) [4]. TORC1 è un regolatore centrale del metabolismo cellulare, controllando la sintesi di proteine, lipidi e pirimidine e l'autofagia [5]. La delucidazione del ruolo del complesso TSC1-TSC2 nella segnalazione di TORC1 ha fornito nuove informazioni sulla biologia cellulare di base e, soprattutto per i pazienti con TSC, ha portato allo sviluppo di nuove terapie promettenti basate sull'uso di specifici inibitori di TORC1 come la rapamicina e la sua derivati ​​[6].

      La diagnosi precoce di TSC facilita la consulenza genetica, l'intervento terapeutico e il monitoraggio della malattia [1]. Tuttavia, l'ampia variazione nel fenotipo di TSC significa che stabilire una diagnosi clinica definita di TSC può essere difficile, in particolare per i pazienti giovani. La raccomandazione dell'International TSC Consensus Conference 2013 era che l'identificazione di un chiaramente patogeno TSC1 o TSC2 mutazione dovrebbe essere sufficiente per fare una diagnosi di TSC, anche in assenza di chiari segni clinici [1]. Sfortunatamente, nonostante i notevoli progressi nella ricerca sulla TSC nell'ultimo decennio, i test molecolari convenzionali non riescono a identificare un patogeno TSC1 o TSC2 mutazione nel 10 - 25% degli individui con TSC. Questi pazienti sono solitamente indicati come TSC nessuna mutazione identificata (NMI) [7].

      Oltre ai guasti tecnici, ci sono diverse possibili ragioni per l'incapacità di rilevare le mutazioni negli individui TSC NMI. In primo luogo, le mutazioni in altri geni non ancora identificati possono causare la TSC. In secondo luogo, possono verificarsi cambiamenti epigenetici costituzionali, come la metilazione del promotore che causa il silenziamento trascrizionale [8]. In terzo luogo, classi specifiche di mutazione, come mutazioni a mosaico e mutazioni nelle regioni introniche e regolatorie, potrebbero non essere rilevabili utilizzando i test convenzionali. Lo sviluppo di metodi di sequenziamento massicciamente paralleli, la cosiddetta tecnologia Next Generation Sequencing (NGS), ha reso possibile applicare nuovi approcci al rilevamento delle mutazioni [9] e ha il potenziale per aumentare la resa delle mutazioni identificate negli individui con TSC. I metodi di rilevamento delle mutazioni ad alto rendimento aiuterebbero a ridurre l'incertezza e l'ansia nella percentuale significativa di individui e famiglie per i quali i metodi diagnostici esistenti non sono informativi. Le strategie NGS sono state applicate agli individui NMI TSC. Ad esempio, in una serie di 38 individui TSC NMI, 2 (6%) mutazioni a mosaico e 5 (13%) mutazioni eterozigoti che erano state perse da altri metodi di rilevamento delle mutazioni sono state identificate utilizzando il sequenziamento ultra-profondo specifico dell'esone [10]. Una limitazione di questo approccio era che era limitato agli esoni e alle sequenze introniche adiacenti di TSC1 e TSC2. Non è stato possibile rilevare mutazioni profonde all'interno degli introni o nel promotore e in altre sequenze regolatorie.

      Qui presentiamo i risultati di uno studio pilota che utilizza NGS mirato per indagare sul DNA di 7 individui con TSC definita e clinicamente confermata in cui un'ampia analisi convenzionale delle mutazioni non è riuscita a identificare una mutazione patogena. Oltre a fornire a questi individui una maggiore certezza sul loro stato di mutazione, l'esclusione dell'esistenza di patogeni TSC1 o TSC2 mutazioni in questi individui aiuterebbero a identificare una coorte per l'identificazione del putativo TSC3 luogo. Abbiamo impiegato il metodo di cattura mirata HaloPlex [11]. Questa tecnica si basa sulla cattura specifica dei frammenti di restrizione dal locus di interesse seguita dall'amplificazione e dal sequenziamento dei frammenti catturati. Haloplex ha il vantaggio di lavorare con un insieme definito di frammenti, che semplifica l'analisi dei dati [12]. In 3 individui abbiamo identificato e confermato a TSC2 mutazione che era stata persa, o non era rilevabile, utilizzando approcci di screening convenzionali basati sull'esone. Nei restanti individui abbiamo identificato nuove varianti da entrambi i TSC1 e TSC2 loci. Tuttavia, il significato clinico di queste varianti non è ancora certo. Il nostro studio pilota indica che l'NGS mirato aumenterà la resa di TSC1 e TSC2 mutazioni identificate nella popolazione di pazienti TSC.


      Informazioni di supporto

      Tabella S1. Un elenco di tutti gli strumenti utilizzati nei flussi di lavoro strutturale (S), funzionale (F) e genomica comparativa (C).

      Le attuali versioni funzionanti degli strumenti presentati qui sono disponibili su https://github.com/TAMU-CPT/galaxy-tools.

      Tabella S2. Il consenso e le possibili sequenze Shine-Dalgarno derivate che sono l'impostazione predefinita in ShineFind.

      Per impostazione predefinita, lo strumento ShineFind ricerca entro 3-24 nucleotidi a monte di un dato codone di inizio i siti Shine-Dalgarno più lunghi, o i primi, che corrispondono ai seguenti, a partire dal E. coli consenso.

      Tabella S3. Elenco di nomi comuni e identificatori utilizzati in BLAST.

      Ogni categoria può essere utilizzata separatamente o insieme per limitare un'analisi BLAST per TaxID. I nomi comuni dei fagi e i numeri di accesso NCBI sono inclusi nel database dei fagi canonico personalizzato, anch'esso precompilato come database BLAST. Le righe in grassetto contengono i rappresentanti ben studiati di ciascun morfotipo.

      Tabella S4. Utili collegamenti al flusso di lavoro di CPT Galaxy.

      È possibile accedere alle versioni correnti di tutti i flussi di lavoro pubblicati su https://cpt.tamu.edu/galaxy-pub/workflows/list_published.

      Tabella S5. Confronto delle annotazioni del genoma dei fagi eseguite utilizzando metodi diversi.

      Cinque fagi, il fago canonico T1 e quattro precedentemente annotati al CPT, sono stati valutati con RASTtk e ​​le caratteristiche sono state confrontate. Il numero di caratteristiche genetiche elencate è strettamente un conteggio, non riflettendo la possibilità che siano stati chiamati geni completamente diversi o geni con inizi alternati. L'ipotetico conteggio delle proteine ​​è pensato per essere un proxy per l'annotazione funzionale. Poiché RASTtk utilizza anche il nome non specifico "proteina fagica", questo termine è stato conteggiato separatamente. Nella riga delle caratteristiche aggiuntive sono elencati i geni e altri aspetti dei genomi dei fagi che in genere vengono identificati solo mediante ispezione manuale e che solo la nostra pipeline identifica qui. tmp = proteina del metro a nastro, e i terminatori si riferiscono ai terminatori rho-indipendenti previsti da TransTermHP. I dati di annotazione compilati possono essere consultati dal pubblico all'indirizzo https://cpt.tamu.edu/apollo/jbrowse/.


      AdR ha progettato tutti gli esperimenti, analizzato i dati e scritto il manoscritto.

      Relazione del revisore 1

      Scott Roy, Allan Wilson Center for Molecular Ecology and Evolution, Massey University, Palmerston North, Nuova Zelanda. Nominato da Anthony Poole.

      "Posizioni introniche conservate in antichi moduli proteici" di de Roos. L'articolo adotta un approccio ingegnoso al tentativo di distinguere tra le prospettive introni-tardivi e introni-precoci. Molte prove precedenti per la teoria degli introni si sono basate sulla relazione delle posizioni degli introni con il frame codificante della sequenza esonica fiancheggiante, o con la struttura tridimensionale della proteina corrispondente, scoperte la cui esistenza e rilevanza non sono sempre state accettate da sostenitori di introni-late. Evitando questi paesaggi disseminati di mine, de Roos indaga su un'altra previsione della presenza di introni in LUCA – se gli introni sono stati (principalmente) creati in tempi antichi, dovrebbero preferibilmente rientrare in sequenze antiche. Tuttavia, sono molto preoccupato per varie questioni metodologiche e quindi sospetto che i risultati non informino il dibattito.

      Risposta dell'autore

      In accordo con i commenti di altri revisori, mi sono concentrato meno su una discriminazione tra introni tardivi e introni precoci, ma più a sostegno della teoria dei geni Exon. Ho anche discusso del potenziale bias nei risultati e del modo in cui è stato studiato.

      L'autore presenta tre linee di evidenza correlate per gli introni pre-LUCA. In primo luogo, gli introni conservati tendono a trovarsi nei domini proteici conservati. In secondo luogo, tra le sequenze conservate, quelle che contengono introni sono più conservate (cioè la conservazione delle sequenze si estende ulteriormente lungo la sequenza proteica). Terzo, gli introni conservati si trovano preferenzialmente nei geni comuni a tutti e tre i domini della vita.

      Una spiegazione alternativa per la prima scoperta, che gli introni tendono a trovarsi nei domini proteici conservati, è che c'è una distorsione nella scoperta di introni "conservati". Qui, introni conservati si intendono quegli introni che condividono posizioni tra i gruppi eucarioti in sequenze molto altamente conservate (ad esempio 6 residui esattamente conservati). Allo stesso modo, i domini sono attualmente generalmente definiti dalla conservazione della sequenza su lunghe distanze evolutive. Pertanto, questa scoperta si riduce a: gli introni in brevi sequenze altamente conservate si trovano preferenzialmente in sequenze più lunghe altamente conservate. Questo non è particolarmente sorprendente. Senza un sottile controllo negativo, è difficile discernere un segnale di antichità al di sopra di questo potenziale pregiudizio.

      Risposta dell'autore

      Sono consapevole che il ritrovamento di introni conservati in domini conservati non prova un'origine antica, poiché il metodo di ricerca non poteva discriminare direttamente tra un'inserzione precoce nell'albero eucariotico. Tuttavia, la teoria dei geni Exon prevede introni conservati in moduli antichi e la prima parte dell'articolo si proponeva di trovare quei potenziali introni conservati. In questo modo è una conferma dell'ipotesi, anche se non può essere considerata una prova. Ho progettato gli esperimenti in Fichi ​ Fichi5 5 e ​ e6 6 per affrontare questo punto (vedi sotto). La natura del pregiudizio e il modo in cui questo è stato studiato è ora dichiarato esplicitamente.

      La seconda constatazione è curiosa, ma temo possa essere spiegata anche da limiti metodologici. Qui, la scoperta centrale è che le sequenze brevi altamente conservate contenenti introni conservati hanno maggiori probabilità di trovarsi in sequenze lunghe altamente conservate rispetto a quelle che non contengono introni. Data l'enormità del database di sequenze, è probabile che alcuni sixmer altamente conservati saranno falsi positivi, cioè non rifletteranno la vera omologia. La probabilità di un falso positivo è notevolmente ridotta dalla presenza di un introne conservato (la stragrande maggioranza delle sequenze conservate di sequenza conservata è probabilmente omologa). Pertanto, è probabile che il set contenente introne conservato contenga molti meno falsi positivi rispetto al set di controllo. Il più alto tasso di falsi positivi tra il set di controllo prevede una minore estensione della conservazione della sequenza, proprio come si vede. Così è di nuovo difficile scorgere un segnale di antichità.

      Risposta dell'autore

      Al fine di indagare un potenziale bias, gli esperimenti in Fig. ​ Fig.5 5 sono stati progettati, è stata creata una situazione di controllo che utilizzava esattamente la stessa metodologia, ma ora senza un introne. È stato dimostrato che le sequenze senza un introne si trovano meno spesso all'interno di un dominio o sequenza conservata. In altre parole, se un campione viene prelevato da un database genomico che seleziona sequenze brevi e molto simili, il gene in cui si trova è più antico se tra queste sequenze è condiviso anche un introne. Questo non ci si aspetterebbe quando le sequenze con un introne sono solo un sottoinsieme di un insieme più grande con sequenze conservate indipendentemente da un introne.

      L'ipotesi che la probabilità di un falso positivo sia notevolmente ridotta dalla presenza di un introne conservato è stata effettivamente testata negli esperimenti. Sebbene non sia prova delle antiche origini, ciò rafforza la scoperta che gli introni in posizioni simili nei geni conservati sono omologhi e sarebbero in linea con una teoria dei geni Exon.

      La scoperta finale, che le sequenze corrispondenti contenenti introni si trovano preferenzialmente attraverso i domini della vita, non è statisticamente significativa: la frazione di sequenze contenenti introni nei geni "antichi" (8/19) non è statisticamente diversa dalla frazione di sequenze senza introni (10/51 P = 0,07 con un test esatto di Fisher). Pertanto, mentre la differenza nelle frazioni di geni antichi è suggestiva, attualmente non possiamo concludere nulla da questa scoperta. Inoltre, sono preoccupato che anche questo test possa soffrire di problemi simili a quelli discussi sopra.

      Risposta dell'autore

      Questi set consistevano in sequenze in cui solo la sequenza del sito di splicing corrispondeva (2 × 3 residui), ma non mostrava alcuna ulteriore sostanziale somiglianza genica. È vero che questo valore non è statisticamente diverso, e questo è ora mostrato (ho trovato p = 0,053 usando il test T di Student). Tuttavia, c'erano più di un test che suggeriva l'antichità: a) somiglianza di sequenza complessiva, b) rappresentanti di antichi moduli proteici ec) rappresentanti di moduli proteici condivisi tra procarioti ed eucarioti. Sebbene questi test non possano essere considerati veramente indipendenti, l'insieme dei controlli suggerisce che gli introni si trovano preferibilmente nelle sequenze antiche.

      Inoltre, i metodi non ortodossi utilizzati (conservazione della sequenza completa su frammenti di sequenza breve) sono difficili da valutare data la mancanza di una storia per tali metodi. Non è chiaro perché questi metodi siano stati scelti rispetto a strumenti più tradizionali, che sono abbondanti. Questo rende difficile interpretare i dati.

      Risposta dell'autore

      Ho incluso un paragrafo che discute il metodo utilizzato e ho aggiunto il set di risultati di potenziali introni conservati.

      Assumendo uno scenario di "teoria esone dei geni" (de Roos, 2005), ho deciso di cercare introni conservati. Ho definito un potenziale introne conservato solo da un introne condiviso in una breve sequenza, senza alcuna preselezione del tipo di geni. Poiché SQL è un potente strumento per estrarre informazioni specifiche da grandi fonti di dati relazionali, ciò ha portato rapidamente a introni che potrebbero essere considerati conservati. Poiché la corrispondenza della sequenza è stata eseguita utilizzando un semplice algoritmo che confrontava la somiglianza della sequenza, era facile controllare le variabili ed eseguire gli esperimenti con sequenze di controllo come in Fig. ​ Fig.5. 5 . Credo che questo sia uno dei principali vantaggi: il modo semplice di interrogare rende possibile progettare esperimenti predittivi modificando un parametro alla volta e utilizzare una situazione di controllo.

      Un'ulteriore considerazione è l'uso della parola "antico". Questa parola è tradizionalmente riservata nel contesto del dibattito sugli introni per il periodo precedente alla divergenza degli eucarioti dai procarioti, e questa distinzione è diventata tanto più importante con l'evidenza crescente di una significativa presenza di introni nei primi eucarioti. Un modo per distinguere le due epoche è tra "antico" e "antico/primo eucariotico".

      Risposta dell'autore

      Questa è una distinzione importante ed è stata resa più chiara nell'articolo. Sebbene sia difficile fare una distinzione tra eucarioti antichi e antichi/precoci con gli esperimenti presentati, i dati sono in linea con l'origine antica (prima della divisione pro/eucariotica). Presumo, tuttavia, che gli eucarioti non siano derivati ​​da procarioti, ma che entrambi condividano un antenato il cui genoma era simile agli eucarioti..

      Seguendo una lunga serie di risultati precedenti, de Roos identifica le posizioni degli introni che sono condivise tra ampi gruppi eucarioti. Precedenti analisi statistiche dei numeri e delle distribuzioni di questi modelli hanno concluso che una sostanziale maggioranza di questi rappresentano posizioni ancestrali, indicando che esistevano già numeri di introni sostanziali al momento della divergenza. Mentre i gruppi eucariotici usati qui (e altrove) potrebbero non consentire di dedurre la presenza di un introne nell'ultimo antenato di tutti gli eucarioti esistenti, ora possiamo essere certi che c'era già un numero molto elevato di introni nell'ultimo antenato degli eucarioti, poiché lo spliceosoma è ampiamente condiviso tra gli eucarioti e un gran numero di posizioni introniche è condiviso tra eucarioti potenzialmente divergenti precoci e altri (Slamovits e Keeling quest'anno hanno consolidato l'ultimo legame, mostrando la conservazione di più di 0,5 introni per gene tra una specie scavata e 'più tardi specie "divergenti", confermando il lavoro di Archibald, O'Kelly e Doolittle del 2002).

      Riporto questo per sottolineare due cose. In primo luogo, il dibattito sulla tempistica degli introni è ora sul fatto che gli introni siano sorti in un antenato universale o tra l'antenato eucariotico-arcaico e l'ultimo antenato eucariotico. Sebbene i risultati della conservazione degli introni o delle caratteristiche associate allo splicing negli eucarioti sottolineino il fatto che gli introni sono molto antichi all'interno degli eucarioti, non ci aiuta a distinguere i tempi di origine degli introni spliceosomiali. In secondo luogo, è importante sottolineare che i risultati di un gran numero di introni nei primi eucarioti non sono fondamentalmente trasformativi per il dibattito sugli introni tra inizio e fine periodo. Sebbene la presenza sostanziale di introni sia chiaramente in risonanza con gli introni precoci (e forse quasi necessaria per il modello), non contraddice il modello degli introni tardivi. Il principio fondamentale degli introni tardivi è che gli introni sono sorti dopo l'ultimo antenato universale comune, quindi la presenza di introni nei primi eucarioti affina solo i tempi dell'origine su quel modello.

      Risposta dell'autore

      Ho riscritto frasi che implicavano una contraddizione di introni-late. Invece mi sono concentrato su risultati che sono in linea con una teoria dei geni Exon. D'altra parte, i modelli di introni conservati nei moduli proteici antichi, le distribuzioni di fase e la correlazione con l'antichità dei geni, come visto in questo articolo, possono anche rendere più difficile un modello meccanicistico per gli introni tardivi ed è quindi rilevante per il dibattito.

      Penso che la domanda più importante per svelare le origini degli introni sia se gli introni siano stati inseriti in geni preformati o se fossero alla base dei geni stessi. L'inserimento di introni a livello di DNA sembra estremamente difficile dato che un introne dovrebbe essere asportato perfettamente a livello di RNA per essere funzionale. Non ho visto un meccanismo per l'evoluzione graduale dello spliceosoma e l'inserimento di introni che possa affrontare gli effetti negativi di fitness di un tale scenario. Inoltre, i modelli di inserimento degli introni dovrebbero spiegare in primo luogo come sono sorti geni complessi senza l'aiuto degli esoni. Quindi, finché gli enigmi meccanicistici non saranno stati risolti, considero il dibattito ancora aperto.

      Alla luce di ciò, possiamo chiederci se è probabile che test come quelli intrapresi qui facciano luce sul dibattito sugli introni tra inizio e fine periodo. La presenza di introni condivisi nei geni eucariotici condivisi non fa luce sul fatto che questi introni risalgano a epoche precedenti. Un possibile approccio sarebbe quello di confrontare le densità di introni tra il gene antico (condiviso eucariotico-procariotico) e gli antichi geni eucarioti. Tuttavia, anche in questo caso una differenza non sarebbe un supporto conclusivo per gli introni antichi, poiché l'origine di molti geni eucariotici ancestrali potrebbe essere successiva all'origine degli introni. E questo sta lasciando da parte i tassi differenziali di perdita di introni tra i geni, il fatto che i geni che sorgono dalla duplicazione genica (e quindi divergono oltre il riconoscimento) possono mantenere gli introni ancestrali e le difficoltà nel distinguere i geni veramente specifici degli eucarioti dall'incapacità di programmi come BLAST per rilevare l'omologia.

      Risposta dell'autore

      Un altro approccio potrebbe essere quello di svelare prima i passaggi meccanicistici in una teoria esone dei geni per la costruzione di un genoma, quindi confrontare la costruzione dei geni eucariotici con quelli dei procarioti e vedere se sono assemblati in modo simile. A questo proposito, i proto siti di splicing proposti da Dibb e Newman[49]potrebbe anche rappresentare i resti delle antiche concatenazioni di esoni (vedi[18]).

      Relazione del revisore 2

      Sandro de Souza, Istituto Ludwig per la ricerca sul cancro, San Paolo, Brasile. Nominato da Manyuan Long

      Albert de Roos ha sviluppato un nuovo modo per identificare le posizioni introniche conservate tra i taxa di diversi regni della vita. Invece di cercare posizioni introniche conservate in geni correlati, de Roos cerca "siti di giunzione" conservati in un database di introni. Per "sito di giunzione" intende un segmento di sequenza proteica (10 residui aa) fiancheggiante una posizione di introne. Ha considerato una posizione introne conservata quando questo "sito di splicing" è stato conservato (6 su 10 residui in quella finestra) tra due sequenze proteiche lontanamente correlate. La strategia può essere interessante poiché può identificare i casi mancati da altri approcci. Sebbene riconosca gli sforzi dell'autore nel cercare di guardare a questo problema con una strategia creativa diversa, ho trovato il manoscritto difficile da seguire e altamente speculativo con molte ipotesi non supportate dai dati. Inoltre, poiché si tratta di una nuova strategia, l'autore dovrebbe fornire maggiori dettagli sulla metodologia e fornire più analisi per il suo set di dati. Elencherò alcuni problemi di seguito punto per punto per rendere più facile la risposta dell'autore.

      Risposta dell'autore

      Ho modificato l'articolo per concentrarmi maggiormente sui dati che supportano un'origine "molto precoce" degli introni, ma non dimostrano gli introni in anticipo e di per sé non possono confutare gli introni in ritardo. L'articolo era troppo forte sotto questo aspetto.

      Nel complesso, ho molti problemi con la sezione "Introduzione", in cui molti riferimenti importanti sono stati citati erroneamente o ignorati.

      • Ad esempio, la citazione originale per la teoria degli introni primitivi è data all'articolo 86 di Gilbert sul mondo dell'RNA e a una recensione di Gilbert e colleghi su Cell (anch'essa dell'86). Qui gli articoli citati dovrebbero essere l'articolo Nature del 1978 di Ford Doolittle e l'articolo "Exon Theory of Genes" di Gilbert nel 1987, che rappresentano al meglio le prime fasi della teoria degli introni.

      • Inoltre, la teoria sintetica dell'evoluzione degli introni, sviluppata da me, Scott Roy e Wally Gilbert, viene completamente ignorata.

      • In un punto particolare, i documenti citati come prova di una correlazione tra le posizioni degli introni e i confini dei moduli sono certamente obsoleti. Gli articoli di de Souza et al (1996), de Souza et al (1998) e Fedorov et al (2001) sono stati ignorati ma rappresentano al meglio l'aspetto concettuale esplorato dall'autore.

      Risposta dell'autore

      Ho cambiato i riferimenti e riscritto l'introduzione.

      1) Nell'ultimo paragrafo della sezione "Introduzione", l'autore afferma che la logica di questo manoscritto era basata sul presupposto che ". ci si aspetterebbe di trovare introni conservati specificamente nelle proteine ​​antiche". Nel modo in cui viene presentato, questo suona sbagliato. Un introne conservato tra vertebrati e invertebrati non è necessariamente localizzato in un gene antico. Penso che l'autore dovrebbe essere più esplicito dicendo che questa conservazione deve essere profonda tra i quattro regni che poi racconterà.

      Risposta dell'autore

      Ho riscritto l'introduzione e gli articoli si concentrano sull'identificazione di possibili introni antichi e le loro caratteristiche.

      2) Sarebbe bello avere una descrizione più dettagliata delle 251 (o 250?) posizioni degli introni conservati. L'intero elenco delle posizioni dovrebbe essere disponibile. Non era chiaro anche il livello di rigore utilizzato nell'analisi. Per quanto ho capito, una semplice corrispondenza che coinvolgeva proteine, ad esempio, umane e Arabidopsis era sufficiente per contrassegnarle come conservate.

      Risposta dell'autore

      Ho incluso l'intero set di risultati degli introni potenzialmente conservati, così come il set più grande con geni fortemente omologhi che è stato pulito per ottenere i 251 potenziali introni antichi. La bandiera "condivisa tra i principali regni eucarioti" era infatti basata sulla presenza nelle piante e negli animali. Al fine di qualificarsi ulteriormente per "conservato", la sequenza del sito di splicing e la posizione dell'introne dovrebbero essere conservate, oltre a mostrare più omologia più lontano dal sito di splicing. La severità è discussa anche nell'articolo.

      3) Poiché si tratta di un nuovo metodo, l'autore dovrebbe confrontare il suo set di dati con altri set di dati. Ad esempio, il dataset riportato da Rogozin et al (Curr. Biol 13:1512�, 2003) è stato analizzato da questi autori e da Roy e Gilbert (PNAS 102:1986�, 2005). I set di dati sono apparentemente significativamente diversi. Dovrebbero essere poiché la metodologia è diversa, ma l'autore ha bisogno di esplorare queste differenze. Ad esempio, sono sorpreso dal basso numero di posizioni introniche conservate identificate da de Roos. Nel set di dati sopra menzionato, c'erano quasi mille introni conservati tra animali e A. thaliana o P. falciparum.

      Risposta dell'autore

      Ho incluso un confronto tra il diverso metodo utilizzato e i risultati ottenuti in entrambi gli articoli citati. Il metodo utilizzato nel mio articolo è piuttosto rigoroso in quanto richiede un'elevata somiglianza di sequenza in una regione corta. È stato utilizzato il concetto di base di un antico introne, ovvero un introne nella stessa posizione all'interno di una sequenza simile, quindi non solo la posizione, ma anche la sequenza del sito di giunzione doveva corrispondere. Mi aspetto che una ricerca più BLAST con gap-alignment di amminoacidi omologhi produrrebbe introni più conservati. Lo scopo della prima parte dell'articolo non era quello di ottenere un insieme esaustivo, ma di confermarne l'esistenza e di studiarne alcune caratteristiche.

      4) Molte delle interpretazioni mi sembrano abbastanza speculative e non supportate dai dati. Ad esempio, osservando così tanti introni, ci si aspetta che alcune corrispondenze si verifichino solo per caso. Sarebbero ben accette alcune simulazioni volte a tracciare una soglia per questi numeri.

      Risposta dell'autore

      Come ora più esplicitamente menzionato nell'articolo, c'è un potenziale pregiudizio nel metodo di ricerca, che è stato studiato e mostrato in Fig. ​ Fig.5 5 e in Fig. ​ Fig.6 6 che è stato quantificato. I risultati hanno supportato l'ipotesi della teoria degli esoni e sono stato attento a non suggerire che si dimostrassero introni-precocemente. Vedi anche la discussione del dott. La recensione di Roy.

      5) L'analisi sulla presenza di posizioni introniche conservate nei geni antichi è presentata in modo confuso. Consiglio vivamente all'autore di riscriverlo. Tuttavia, nutro serie preoccupazioni sull'analisi. In primo luogo, sembra che de Roos chiami antico un gene quando c'è una certa conservazione in una finestra di 10 residui. Questa dimensione della finestra dovrebbe essere aumentata almeno alla dimensione media di un dominio proteico. Inoltre, non sembra che qui sia stato utilizzato il database CDD.

      Risposta dell'autore

      Ho riscritto l'analisi. Chiamo antico un introne quando si trova in una sequenza conservata, cioè c'è una somiglianza del sito di splicing (6/10) e una somiglianza complessiva del gene misurata su altri 20 (2 × 10) amminoacidi, nel complesso una somiglianza di almeno 12/30. Nel mio approccio questo ha prodotto una forte selezione di geni conservati e le sequenze più abbinate erano un membro di un dominio proteico conservato e condividevano una fase simile.

      Risposta dell'autore

      Non c'era alcuna ipotesi a priori sulla parentela dei geni e il database CDD non è stato effettivamente utilizzato per trovare l'insieme conservato, ma è stato utilizzato per confermare l'antichità dell'insieme. Come Fig. ​ Fig.6 6 mostra, quando è stata utilizzata solo una somiglianza del sito di giunzione di 8/10, la maggior parte delle sequenze è stata conservata come mostrato dalla somiglianza della sequenza più a monte ea valle. Abbassandolo a 6/10 ma richiedendo un ulteriore 6/20 (totale 12/30) selezionati solo geni conservati. Anche con solo un sito di giunzione simile (2 × 3 identico) e nessuna ulteriore somiglianza, le sequenze erano nel 42,1% di geni condivisi con i procarioti e il 52,6% era membro di un dominio conservato (vedi testo).

      6) L'interpretazione derivata dalle analisi sull'antichità dei geni individuati è di tipo circolare. Naturalmente, se nelle prime fasi della pipeline fosse stata stabilita una condizione per cui una corrispondenza sarebbe stata considerata una corrispondenza solo se coinvolgesse regni che si sono divisi molto tempo fa, mi aspetterei di avere il mio set di dati arricchito con proteine ​​antiche.

      Risposta dell'autore

      L'articolo si compone di due parti. Nella prima, ho cercato di ottenere una serie di introni conservati cercandoli in modo specifico. Poiché interrogo posizioni di introni simili tra sequenze che divergono nell'albero eucariotico, il set di dati sarà arricchito per proteine ​​antiche. Ho quindi verificato se questo arricchimento è dovuto alla presenza di un introne, o unicamente intrinseco al metodo utilizzato. Come si può vedere nei controlli di Fichi ​ Figs5, 5 , ​ ,6, 6 , ​ ,7, 7 , la presenza di un introne fa la differenza sia nella conservazione della fase che nella sequenza complessiva. Concludo che l'arricchimento di queste sequenze è dovuto alla presenza degli introni, e non un risultato del metodo. Nella sezione Risultati così come nella sezione Discussione, l'ho reso più chiaro.

      Relazione del revisore 3

      Gáspár Jékely, Laboratorio europeo di biologia molecolare, Heidelberg, Germania

      Questo articolo descrive un nuovo metodo per identificare le posizioni conservate degli introni in taxa eucarioti lontanamente imparentati. Si basa sull'osservazione di brevi tratti di sequenza proteica attorno a un sito di giunzione e sulla ricerca di sequenze simili aventi un introne nella posizione corrispondente, piuttosto che definire e allineare gli ortologhi e quindi mappare le posizioni degli introni sull'allineamento. Usando questo metodo l'autore identifica 218 introni con la stessa fase in siti omologhi che probabilmente risalgono alla prima evoluzione degli eucarioti. Il metodo è nuovo e interessante. Ho alcuni commenti su come migliorare la presentazione e l'analisi dei risultati.

      1) Un problema è che il contesto filogenetico non è definito esplicitamente. Non basta fare riferimento ai regni, soprattutto nel caso dei protisti. Se un introne è condiviso da animali, funghi (e in aggiunta, ad esempio, da protisti coanoflagellati), ciò non significa che fosse presente nell'antenato comune eucariotico. La distribuzione filetica di ciascun introne identificato condiviso da due o più regni dovrebbe essere confrontata con un albero eucariote semplificato ma radicato che includa le specie in studio (la cosa migliore sarebbe prendere un albero radicato tra Unikonts e Bikonts). Solo in questo modo l'autore può ricostruire in modo affidabile posizioni introniche conservate che molto probabilmente erano già presenti nell'ultimo antenato comune eucariotico.

      Risposta dell'autore

      In linea con i commenti degli altri revisori, ho indebolito le conclusioni sulla tempistica dell'origine degli introni sulla base dei risultati presentati qui. Invece, l'articolo si pone più come supporto aggiuntivo per la teoria dei geni Exon, dalla dimostrazione di introni conservati in geni antichi come le fosfatasi.

      2) Tutti gli introni conservati identificati dovrebbero essere riportati in un foglio word o excel come informazione supplementare.

      Risposta dell'autore

      Ora ho reso disponibile l'intero set per il download, incluso un set che include ancora geni omologhi (ad esempio Arac10 e Arac13, o gpc2 e GapC rappresentano sequenze fortemente omologhe.

      3) "Introni condivisi in domini proteici antichi"

      Quando vengono presentati i risultati delle ricerche CDD, dovrebbero essere presentati insieme a un controllo, preferibilmente sotto forma di tabella o grafico. È necessario prestare molta attenzione durante la progettazione di un set (o set) di controllo. Dovrebbe essere selezionato in base agli stessi criteri, inclusa la distribuzione filetica. È piuttosto complicato, dato che il "set di risultati" è eterogeneo in questo senso.Anche il controllo dovrebbe avere una dimensione del campione simile e, data l'eterogeneità e il piccolo campione, la cosa migliore sarebbe campionare un controllo molte volte indipendentemente (ad es.

      200 sequenze che mostrano lo stesso grado di somiglianza di sequenza lungo la stessa distanza filetica del "set di risultati"). La selezione per sequenze altamente conservate comporterà ovviamente un arricchimento dei domini conservati. La progettazione dei controlli è cruciale per la corretta interpretazione dei risultati e dovrebbe essere spiegata in dettaglio nel testo.

      Risposta dell'autore

      Ho aggiunto paragrafi che spiegano il metodo ei risultati in modo più dettagliato. La dimensione del campione non è stata fornita correttamente e la dimensione del campione per il controllo non è stata inclusa e questo è stato modificato. I risultati in Fichi. ​ Figg.3 3 e ​ e4 4 non hanno un controllo diretto, rappresentano potenziali introni conservati e rappresentano un diverso insieme usato in Fichi ​ Fichi6 6 e ​ e7. 7 . È stato studiato se questo fosse il risultato di un bias nella query e rappresentasse solo un sottoinsieme di introni conservati nei geni conservati. Gli esperimenti quantitativi in Fichi. ​ Figg.6 6 e ​ e7 7 mostrano questo potenziale bias in una situazione controllata, dove l'unica differenza tra gli insiemi è la presenza di un introne. La correlazione positiva tra la presenza di un introne e l'antichità della sequenza è assunta a supporto dell'ipotesi che gli introni fossero effettivamente antichi.

      4) "Presenza preferita di introni conservati nei geni antichi"

      Nell'analisi per identificare i colpi procariotici, sono state utilizzate solo sequenze aventi "un numero di residui di amminoacidi identici di 6 (2 × 3) attorno a un sito di giunzione (virtuale)". Ciò significa 19 sequenze. L'analisi dovrebbe essere ripetuta meglio per l'intero set (218 sequenze), con il set di controllo appropriato (vedi sopra).

      Risposta dell'autore

      Come si può vedere nel grafico di Fig. ​ Fig.6, 6 , c'è una piccola finestra dove si può vedere la differenza nell'antichità dei geni. Una somiglianza inferiore (2 o 4 residui identici) selezionerebbe principalmente falsi positivi, un numero più alto selezionerà solo sequenze conservate in entrambi i set. Se viene preso l'intero set, qualsiasi effetto scomparirà nel rumore. Questo rappresenta uno dei problemi nell'analisi dei dati degli introni: data l'enorme perdita e possibile guadagno di introni durante l'evoluzione, insieme al possibile scorrimento degli introni e alla continua diversificazione delle proteine, è difficile discernere un segnale antico in questo rumore.

      A pagina 2 l'autore scrive: "La previsione più forte di uno scenario di introni precoci è la presenza di introni conservati tra proteine ​​ortologhe che si sono differenziate all'inizio del lignaggio eucariotico". Non credo sia corretto. Se gli introni si sono originati presto durante l'evoluzione degli eucarioti, ma ancora più tardi dei geni procarioti, cioè non come elementi costitutivi dei primi geni da assemblare, ci si aspetterebbe anche di trovare molti introni conservati tra gli ortologhi eucarioti.

      Risposta dell'autore

      Ho cambiato l'introduzione. Sebbene attesi negli introni precoci, gli introni conservati sono compatibili con gli introni tardivi. Come ora menzionato nell'articolo nell'ultimo paragrafo della Discussione, credo che il genoma ancestrale di procarioti ed eucarioti fosse un genoma eucariotico con caratteristiche come gli introni e le reliquie di RNA (ad esempio il ribosoma e lo spliceosoma). In questo senso, i primi eucarioti e antichi sarebbero sinonimi.

      Pagina 2/3: "Si è scoperto che gli introni conservati si trovano frequentemente e specificamente negli antichi domini proteici" la parola "specificamente" è troppo forte qui, significherebbe che gli introni conservati si trovano solo nei domini antichi, il che non è il caso (è il 53%).

      Risposta dell'autore

      Modificato in "correlato positivamente con l'antichità della sequenza".

      La parola "antico" è spesso usata come sinonimo di "conservato", ma ovviamente non è la stessa cosa. Per esempio. pagina 5 "Così, sulla base di questi risultati, gli introni sembrano essere localizzati preferenzialmente in geni antichi, in linea con uno scenario introni-precoci" questi sono geni piuttosto conservati, quindi necessariamente 'antichi'.

      Risposta dell'autore

      Controllato per riferimenti inappropriati ad antichi e conservati.

      pagina 7: "In conclusione, i dati qui presentati indicano un'elevata presenza di introni nei geni antichi, seguita da una massiccia perdita di introni più avanti nell'evoluzione". L'elevata presenza di introni sembra troppo forte, sono stati identificati un totale di 218 introni. La perdita di introni non è stata affrontata nel documento, ciò richiederebbe la mappatura della distribuzione degli introni conservati su un albero filogenetico.

      Risposta dell'autore

      Ho cambiato questo. La mia interpretazione dei dati, con un punto di vista della teoria degli esoni, è che gli antichi domini contenevano molti introni poiché multipli sono stati trovati nelle fosfatasi per esempio (Fig. ​ (Fig.4). 4 ). Il numero relativamente basso di introni conservati trovati (251) indica che molti sono stati persi durante l'evoluzione, o che la sequenza è divergente e non è stata rilevata dal metodo attuale. Nell'articolo sono mostrati due set. Il primo consiste in un insieme di introni conservati, basato sul requisito che 6 residui su 10 dovrebbero essere identici, il secondo insieme è costituito da 5 query separate in cui è stata determinata l'esatta posizione dei residui identici.

      Pagina 7: "Questi risultati supportano l'idea degli introni antichi e sono difficili da conciliare con un'origine degli introni tardiva nell'evoluzione, sebbene non si possa escludere un'inserzione direttamente dopo la scissione eucariota-procariota sulla base dei risultati attuali." Direi piuttosto che i risultati supportano bene la presenza ancestrale di introni nell'antenato comune degli eucarioti. Questo è abbastanza interessante, e l'intero documento e la discussione sarebbero molto meglio se l'autore non cercasse di argomentare troppo fortemente per un modello, che non è fortemente supportato dai dati, ma piuttosto discutesse cosa si può veramente concludere dai risultati .

      Risposta dell'autore

      Ho cambiato l'attenzione sulla distinzione tra introni tardivi e introni precoci (che non era ben supportata dai dati presentati) verso un supporto per la teoria dei geni Exon. Ho reso più esplicito che, visti alla luce degli introni tardivi, questi dati non escluderebbero uno scenario introni tardivi.


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