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12.5: BCL-2 - Biologia

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BCL-2 è un proto-oncogene umano situato sul cromosoma 18. Il suo prodotto è una proteina integrale di membrana (chiamata Bcl-2) situata nelle membrane del reticolo endoplasmatico (ER), involucro nucleare e nelle membrane esterne dei mitocondri. Il gene è stato scoperto come locus traslocato in a B-Cell ioeucemia (da cui il nome). Questa traslocazione si trova anche in alcuni linfomi a cellule B.

Nelle cellule B cancerose, la porzione del cromosoma 18 contenente il BCL-2 locus ha subito una traslocazione reciproca con la porzione del cromosoma 14 contenente il locus della catena pesante dell'anticorpo. Questa traslocazione t(14;18) pone il BCL-2 gene vicino al potenziatore del gene della catena pesante. Questo potenziatore è molto attivo nelle cellule B (il cui compito è sintetizzare grandi quantità di anticorpi). Quindi non è sorprendente scoprire che la proteina Bcl-2 è espressa ad alti livelli in queste cellule t(14;18).

Ciò che rende BCL-2 un proto-oncogene?

Le cellule B, come tutti i linfociti attivati, muoiono pochi giorni dopo aver avuto la possibilità di svolgere il proprio lavoro. Questo assicura che non restino in giro dopo che la minaccia è stata affrontata e rivolgono il loro attacco contro i componenti del sé. Le cellule B che invecchiano si uccidono da apoptosi. Tuttavia, alti livelli della proteina Bcl-2 proteggono le cellule dalla morte precoce per apoptosi. La proteina Bcl-2 sopprime l'apoptosi impedendo l'attivazione delle caspasi che effettuano il processo. Quindi i geni che codificano per gli inibitori dell'apoptosi devono essere aggiunti all'elenco dei geni che possono agire come oncogeni. In questo caso l'effetto non si ottiene aumentando il tasso di proliferazione cellulare ma riducendo il tasso di morte cellulare.

Sebbene la traslocazione t (14:18) si trovi nei linfomi a cellule B e nelle leucemie, qualcos'altro deve contribuire a creare il cancro perché oltre il 50% di noi ha un piccolo numero di cellule B con quella traslocazione che non progredisce mai verso il cancro. I loci genici anticorpali sono luoghi pericolosi in cui i proto-oncogeni possono stabilirsi. Traslocazione del proto-oncogene c-myc vicino al potenziatore dei geni della catena pesante dell'anticorpo produce anche cellule B cancerose con conseguente linfoma di Burkitt. La traslocazione del BCL-2 locus è solo una delle tante mutazioni che possono dare origine a un clone maligno di cellule B. Tutte le leucemie risultanti sono designate leucemia linfatica cronica o CLL.


L'origano dimostra effetti di soppressione del tumore distinti nel modello di carcinoma mammario

Scopo: C'è stato un notevole interesse nell'identificazione di alimenti vegetali naturali per lo sviluppo di agenti efficaci contro il cancro. Pertanto, sono stati valutati gli effetti antitumorali dell'origano nel modello di cancro al seno in vivo e in vitro.

Metodi: L'origano liofilizzato (ORE) è stato somministrato a due concentrazioni di 0,3 e 3% attraverso la dieta. L'esperimento è stato interrotto 14 settimane dopo la somministrazione del cancerogeno. All'autopsia, i tumori mammari sono stati rimossi e preparati per l'analisi istopatologica e immunoistochimica. Inoltre, è stata effettuata una valutazione in vitro in cellule MCF-7.

Risultati: L'ORE a basso dosaggio ha soppresso la frequenza del tumore del 55,5%, l'incidenza del tumore del 44% e il volume del tumore del 44,5% rispetto agli animali di controllo. L'analisi delle cellule tumorali di ratto ha mostrato una diminuzione dell'espressione di Ki67, VEGFR-2, CD24 ed EpCAM e un aumento dell'espressione della caspasi-3 dopo il trattamento con ORE a basse dosi. Inoltre, sono state osservate una diminuzione dell'espressione di Bcl-2, VEGFR-2, CD24 ed EpCAM e un aumento dell'espressione della caspasi-3 nelle cellule di carcinoma ad alte dosi di ORE allungato la latenza del tumore di 12,5 giorni. L'analisi istopatologica ha rivelato una diminuzione del rapporto tra carcinomi di alto/basso grado in entrambi i gruppi trattati. Studi in vitro hanno mostrato che ORE diminuiva la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule MCF-7. Nelle cellule MCF-7 trattate con ORE, un aumento delle cellule che esprimono sub-G 0/G 1 Sono stati osservati il ​​contenuto di DNA e un aumento della percentuale di cellule MCF-7 positive per annessina V/PI. In vitro, sono state trovate vie apoptotiche sia caspasi-dipendenti che possibili non caspasi-dipendenti. Nelle cellule MCF-7 trattate con ORE sono state osservate la disattivazione dell'attività anti-apoptotica di Bcl-2, una diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale e l'attivazione della via dell'apoptosi mitocondriale.

Conclusioni: I nostri risultati dimostrano, per la prima volta, un distinto effetto soppressivo del tumore dell'origano nel modello di cancro al seno.

Parole chiave: Angiogenesi Apoptosi Cellule staminali tumorali Proliferazione cellulare Cellule MCF-7 Carcinogenesi mammaria Origano Ratto.


Ruolo dell'attivazione dell'autofagia nell'alleviare la neurotossicità dell'alcol

Proteine ​​della famiglia Bcl-2

Le proteine ​​della famiglia Bcl-2 sono noti bersagli dell'esposizione all'alcol nel cervello ( Heaton et al., 2015 ). Sono ben noti per la loro regolazione della morte/sopravvivenza cellulare. Studi recenti indicano che le proteine ​​della famiglia Bcl-2 svolgono un duplice ruolo nella regolazione dell'autofagia oltre al loro ruolo nella sopravvivenza cellulare (Decuypere et al, 2012 Hardwick e Soane, 2013). Le proteine ​​antiapoptotiche della famiglia Bcl-2, come Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1, possono sopprimere l'autofagia legandosi direttamente a Beclin1. Sembra che solo la proteina Bcl-2 residente nell'ER sopprima l'autofagia (Pattingre et al., 2005 Chang et al., 2010). Oltre al legame con Beclin1, Bcl-2 e Bcl-xL possono anche regolare negativamente la risposta autofagica controllando l'omeostasi del calcio ER che svolge un ruolo importante nell'inizio dell'autofagia (Brady et al., 2007 Høyer-Hansen et al ., 2007). In contrasto con le proteine ​​antiapoptotiche della famiglia Bcl-2, le proteine ​​proapoptotiche solo BH3, come Bnip3, Bnip3L/Nix, Bad, Bik, Noxa, Puma e Bim, generalmente inducono l'autofagia attraverso il loro legame a Bcl-2 e il successivo spostamento del inibitorio Bcl-2 dal complesso Beclin1. Tuttavia, il ruolo delle proteine ​​proapoptotiche Bax e Bak nell'autofagia è controverso. Sono state riportate sia la regolazione positiva che negativa dell'autofagia da parte di Bax e Bak (Ding et al., 2011).

È stato dimostrato che l'etanolo modula la proteina della famiglia Bcl-2 nei neuroni in vitro e in vivo (Ge et al., 2004 Liu et al., 2009 Heaton et al., 2011, 2015 Ali Shah et al., 2013). Generalmente, l'alcol riduce l'espressione delle proteine ​​della famiglia Bcl-2 antiapoptotiche ma aumenta l'espressione delle proteine ​​antiapoptotiche, che possono attivare l'autofagia.


Risultati

Proteina Bcl-2 ricombinante con la sequenza transmembrana C-terminale (TM) sostituita da un His6-tag (His6-Bcl-2ΔTM) è stato preparato. Il liposoma è stato realizzato con i lipidi caratteristici MOM e un analogo lipidico chelante Ni 2+ che si lega all'His6-tag al C-terminale del ricombinante Bcl-2, generando così un Bcl-2 legato alla membrana che imita il Bcl-2 legato alla MOM nativa. Il liposoma è stato anche caricato con colorante a fluorescenza, Cascade Blue (CB, Mr 𢏀.5 kDa) o destrani marcati con CB (Mr 𢏃 o 10 kDa). La formazione di pori da parte di Bcl-2 rilascerebbe le molecole fluorescenti dal liposoma, che sarebbero legate dall'anticorpo anti-CB all'esterno del liposoma causando una riduzione (quenching) della fluorescenza CB. L'estensione e la cinetica dell'estinzione della fluorescenza indicano l'entità e la cinetica del rilascio del colorante dal liposoma, che è direttamente correlata all'entità e alla cinetica della formazione dei pori Bcl-2 nella membrana.

Correlazione diretta tra concentrazione e dimensione dei pori di Bcl-2

Utilizzando l'approccio di cui sopra, abbiamo esaminato l'entità del rilascio delle tre molecole fluorescenti di diverse dimensioni da diverse concentrazioni di Bcl-2 dopo l'interazione con tBid. Come mostrato nella Figura 1A, il rilascio significativo di CB 0,5-kDa è iniziato a una concentrazione di Bcl-2 inferiore (25 nM) rispetto a quella per CB-destrano 3-kDa (50 nM). Il rilascio di 10-kDa CB-destrano non è stato rilevato nemmeno alla più alta concentrazione di Bcl-2 (100 nM). Se i pori di Bcl-2 sono formati solo da monomeri, questi pori dovrebbero avere una dimensione uniforme che sarà indipendente dalla concentrazione di Bcl-2. Poiché i risultati mostrano che la dimensione dei pori di Bcl-2 dipende positivamente dalla concentrazione di Bcl-2, suggerisce che l'oligomerizzazione di Bcl-2 è coinvolta nella formazione dei pori, almeno quello grande.

UN, grado di rilascio di coloranti CB 0,5-kDa (barra nera), 3 (barra allungata) o 10-kDa (barra bianca) CB-destrani da 12,5 μM liposoma chelante Ni 2+ da varie concentrazioni di His6-La proteina Bcl-2ΔTM in presenza o assenza di 10 nM tBid è stata determinata dall'entità dell'estinzione della fluorescenza (Bcl-2ΔTM/㥏Tritone) dopo 3 ore di incubazione a pH 7,4. I dati mostrati sono le medie di tre esperimenti indipendenti con deviazione standard (S.D., barra di errore). B, cinetica di rilascio del colorante CB e dei CB-destrani da 12,5 μM Ni 2+ -liposoma di 100 nM His6-Bcl-2ΔTM e 10 nM tBid a pH 7,4 sono stati misurati monitorando continuamente l'entità dell'estinzione della fluorescenza per 3 ore. I dati mostrati sono le medie di tre esperimenti indipendenti con S.D. (Barre di errore). (□) 0,5-kDa CB (●) 3-kDa CB-destrano (○) 10-kDa CB-destrano (■) il controllo negativo, liposoma caricato con CB 0,5-kDa incubato con tampone proteico .

Correlazione inversa tra la cinetica del rilascio del colorante da parte di Bcl-2 e la dimensione del colorante

Per testare ulteriormente il modello per la formazione dei pori Bcl-2, è stata esaminata la cinetica di rilascio di coloranti di diverse dimensioni. Come mostrato nella Figura 1B, anche se sia 0,5-kDa CB che 3-kDa CB-destrano sono stati rilasciati dal liposoma da 100 nM Bcl-2 dopo l'interazione con tBid, il colorante piccolo è stato rilasciato a una velocità maggiore rispetto a quello grande. Il tempo per metà del rilascio massimo (t1/2) per CB e CB-destrano era 𢏃 e 30 min, rispettivamente. Il 10-kDa CB-destrano non è stato rilasciato nemmeno dopo ore di incubazione, escludendo la possibilità che l'esposizione prolungata dei liposomi a Bcl-2 e tBid possa causare danni non specifici alla membrana. Se i pori di Bcl-2 sono formati solo da monomeri, i coloranti di diverse dimensioni dovrebbero essere rilasciati dal liposoma alla stessa velocità dettata dalla velocità di conversione di Bcl-2 dalla conformazione legata alla membrana alla conformazione dei pori, un costante ad una data concentrazione proteica. Al contrario, se l'oligomerizzazione è coinvolta nella formazione dei pori, la velocità di rilascio del colorante piccolo dovrebbe essere superiore a quella del colorante grande poiché la velocità di formazione dei pori oligomerici piccoli dovrebbe essere superiore a quella dei pori oligomerici grandi. Pertanto, i dati cinetici di cui sopra forniscono ulteriore supporto al modello secondo cui le proteine ​​Bcl-2 formano pori tramite oligomerizzazione.

Miglioramento della formazione dei pori mediante oligomerizzazione di Bcl-2

Per determinare l'effetto dell'oligomerizzazione di Bcl-2 sulla formazione dei pori, abbiamo utilizzato proteine ​​Bcl-2 in diversi stati oligomerici o di diverse potenze oligomerizzanti. Durante la purificazione di His6-Bcl-2ΔTM, abbiamo osservato che la proteina è stata eluita dalla colonna di filtrazione del gel Superdex 200 principalmente nelle frazioni monomeriche e oligomeriche come giudicato dalla loro co-eluizione con gli standard proteici di 25 e 200 kDa, rispettivamente ( Fig. 2A ). La proteina in entrambe le frazioni è pura al 90% secondo l'analisi SDS-PAGE seguita dalla colorazione Coomassie Blue (Fig. 2B). L'identità della proteina è stata confermata mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo specifico per Bcl-2 (Fig. 2C). La massa molare media ponderale della proteina monomerica è 24.540 ± 982 g/mol come determinato dall'analisi di diffusione della luce multi-angolo (Fig. 2D), vicino al valore calcolato per l'His monomerico6-Bcl-2ΔTM, 24.795 g/mol, confermando che la proteina monomerica è la Bcl-2 monomerica. Concepibilmente la proteina oligomerica è un oligomero Bcl-2 poiché è eluita prima della proteina monomerica dalla colonna di gel filtrazione. Il monomero e l'oligomero Bcl-2 purificati sono abbastanza stabili poiché sono stati eluiti nella frazione corrispondente dopo una seconda cromatografia di filtrazione su gel (Fig. 2E). Questo ci ha fornito l'opportunità di testare quale forma della proteina Bcl-2 è più efficiente nella formazione dei pori. Come mostrato nella Figura 2F, le proteine ​​Bcl-2 sia monomeriche che oligomeriche hanno rilasciato la stessa quantità di 3-kDa CB-destrani dai liposomi dopo un'incubazione di 3 ore. Tuttavia, la cinetica del rilascio del colorante da parte delle due forme di Bcl- è diversa. La velocità di rilascio indotta dall'oligomerico Bcl-2 è molto più alta di quella da quella monomerica poiché t1/2 per il primo è 𢏃.3 min e il secondo � min. Questi risultati dimostrano che, sebbene sia l'oligomero che il monomero Bcl-2 siano competenti per la formazione dei pori, l'oligomero è molto più efficiente nella formazione dei pori rispetto al monomero, indicando che l'oligomerizzazione di Bcl-2 è una fase intermedia durante la formazione dei pori. reazione di formazione.

UN, oligomerizzazione di His6-Bcl-2ΔTM è stato esaminato mediante cromatografia di filtrazione su gel. L'A280 è stato monitorato per ciascuna frazione eluita e riportato in grafico. Le posizioni di eluizione per gli standard proteici sono indicate nella parte superiore del grafico con M . corrispondenteR. B, purezza sia monomerica (corsia 1) che oligomerica (corsia 2) His6-Le proteine ​​Bcl-2ΔTM eluite dalla suddetta colonna di gel filtrazione sono state analizzate mediante SDS-PAGE e colorazione di Coomassie. mR degli standard proteici è indicato a sinistra del gel. C, identità del monomerico (corsia 1) e oligomerico (corsia 2) His6-Le proteine ​​Bcl-2ΔTM sono state determinate mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo specifico per Bcl-2. D, massa molare media ponderale di His6-Il monomero Bcl-2ΔTM eluito dalla colonna di filtrazione su gel è stato determinato mediante analisi di diffusione della luce multi-angolo. E, stabilità di His wild-type6-L'oligomero Bcl-2ΔTM (grafico superiore, ●) e il monomero (grafico inferiore, ■) o il monomero mutante G154A/G155A (grafico inferiore, ○) sono stati testati iniettando le frazioni corrispondenti da la prima colonna di gel filtrazione nella seconda cromatografia. F, cinetica di rilascio di 3-kDa CB-destrano da 12,5 μM Ni 2+ -liposoma di 100 nM His6-Bcl-2ΔTM monomero o oligomero e 10 nM tBid a pH 7,4 sono stati monitorati come sopra. I dati mostrati sono medie con S.D. (barre di errore) da tre esperimenti indipendenti utilizzando l'oligomero Bcl-2 (▲), il monomero (○) o il tampone proteico (●).

In uno studio precedente abbiamo generato un mutante Bcl-2 in cui i due residui di glicina nelle posizioni 154 e 155 sono stati modificati in alanina. Questo mutante ha mostrato una maggiore attività di formazione dei pori nei liposomi(14). Misurando l'aumento concentrazione-dipendente dell'anisotropia del triptofano abbiamo scoperto che la proteina mutante ha un'affinità di omoassociazione di 6,5 volte maggiore rispetto alla proteina di tipo selvatico (Fig. 3A). Se confrontata con la proteina monomerica di tipo selvatico, la proteina mutante monomerica (Fig. 3B) ha avuto un grado di formazione molto maggiore del poro che rilascia colorante da 3 kDa dopo un'incubazione di 3 ore. Inoltre, la cinetica di formazione dei pori era molto più veloce con il mutante, con un t1/2 di � min, che è 3 volte più breve di t1/2 per il tipo selvatico (Fig. 3B). Questi dati supportano ulteriormente il modello secondo cui l'oligomerizzazione delle proteine ​​Bcl-2 facilita la formazione dei pori.

UN, omo-associazione di His wild di tipo selvatico6-Bcl-2ΔTM o il mutante G154A/G155A è stato esaminato misurando l'anisotropia di fluorescenza dopo aver titolato la proteina corrispondente nel tampone D. I dati mostrati sono le medie di tre titolazioni indipendenti con S.D. (barre di errore) e (■) per wild-type e (●) per il mutante. KD per il legame del wild-type o del mutante è 196 ± 43 o 30 ± 5 nM, rispettivamente. B, la cinetica di rilascio di 3-kDa CB-destrano da 12,5 μM Ni 2+ -liposoma è stata monitorata in presenza di His monomerico wild-type da 100 nM6-Bcl-2ΔTM o il mutante G154A/G155A e 10 nM tBid a pH 7,4 come sopra. I dati mostrati sono medie con S.D. (Barre di errore) da tre esperimenti indipendenti utilizzando il tampone wild-type (○), mutante (●) o proteico (□).

Oligomerizzazione di Bcl-2 nella membrana rilevata mediante cromatografia di reticolazione chimica e filtrazione su gel

Per determinare se l'oligomerizzazione di Bcl-2 si verifica nella membrana liposomiale, è stato utilizzato un cross-linker sulfidrilico reattivo omobifunzionale BMH. il suo6La proteina -Bcl-2ΔTM contiene solo una cisteina in posizione 158. Pertanto, può essere generato solo l'addotto dimero (Fig. 4A), anche se alcuni Bcl-2 sono in forma oligomerica come mostrato dalla cromatografia di filtrazione su gel (Fig. 2A). La specificità della reazione BMH è stata dimostrata dal fatto che non è stato osservato alcun addotto dimero anche in presenza di BMH quando è stato utilizzato un mutante Bcl-2 nullo cisteina (Fig. 4A).

UN, omo-associazione di His6-Bcl-2ΔTM in soluzione (pH 7.4) è stato rilevato mediante reticolazione con BMH. I dati mostrati sono un gel SDS-PAGE rappresentativo colorato con Coomassie da tre esperimenti indipendenti. (●), freccia monomero Bcl-2, dimero Bcl-2 reticolato. B, omo-associazione di His6-Bcl-2ΔTM nella membrana liposomiale è stato monitorato mediante reticolazione BMH dopo che la proteina è stata incubata con il liposoma a pH 5,0 e la proteina legata alla membrana è stata purificata mediante centrifugazione float-up del saccarosio. I dati mostrati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. C, oligomerizzazione di 50 o 800 nM His6-Bcl-2ΔTM nella membrana è stato determinato mediante cromatografia di filtrazione su gel dopo incubazione della proteina a pH 7,4 con 12,5 μM Ni 2+ -liposoma in assenza o presenza di 5 nM tBid. Le proteine ​​nelle frazioni eluite sono state analizzate mediante SDS-PAGE e immunoblotting con un anticorpo specifico per Bcl-2. Le posizioni di eluizione degli standard proteici sono indicate nella parte superiore del grafico con MR. D, l'oligomerizzazione di 200 nM Bax nella membrana in assenza o presenza di 20 nM tBid è stata determinata in modo simile, tranne per il fatto che è stato utilizzato un anticorpo specifico per Bax nell'immunoblotting.

La proteina Bcl-2 è stata incubata con il liposoma a pH 5 per 3 ore, una condizione nota per favorire la formazione dei pori(14). Dopo centrifugazione float-up della densità di saccarosio, la frazione contenente il liposoma superiore è stata raccolta e sottoposta a reticolazione BMH. È stato rilevato un addotto BMH-dipendente con un MR � kDa, il M previstoR del dimero His6-Bcl-2ΔTM ( Fig. 4B ). Poiché BMH contiene due gruppi maleimmidici distanziati da un linker 16 Å e la molecola Bcl-2 ha dimensioni di 50흅휵 (Å) secondo la struttura NMR(3), il prodotto di reticolazione è molto probabilmente formato da due molecole Bcl-2 che sono legate l'una all'altra nella membrana. I dati dimostrano quindi che almeno alcune proteine ​​Bcl-2 formano dimero nella membrana in condizione di formazione di pori.

Per determinare lo stato oligomerico di Bcl-2 legato alla membrana dopo l'interazione con tBid, un'altra condizione in cui Bcl-2 forma pori (Fig. 1), abbiamo prima isolato i liposomi dopo l'incubazione con Bcl-2 e/o tBid utilizzando CL- Cromatografia di filtrazione su gel 2B. Le proteine ​​legate alla membrana sono state solubilizzate da CHAPS, un detergente ionico zwitter che non modifica lo stato oligomerico delle proteine ​​della famiglia Bcl-2 (25, 26), e quindi sottoposte a cromatografia di filtrazione su gel Superdex 200. Come mostrato nella Figura 4C, Bcl-2 legato alla membrana è stato facilmente rilevato dopo l'incubazione con liposomi in presenza di tBid. La forma principale di Bcl-2 è il dimero e il trimero come giudicato dalla loro coeluizione con gli standard proteici di 43 e 67 kDa, rispettivamente. In assenza di tBid, in queste frazioni vengono rilevate solo proteine ​​Bcl-2 residue, suggerendo che una piccola frazione della proteina Bcl-2 legata alla membrana si trova negli stati dimero e trimero anche in assenza di tBid. L'interazione tBid aumenta sostanzialmente la quantità di proteine ​​Bcl-2 legate alla membrana, dimeriche e trimeriche. Oligomeri Bcl-2 interessantemente più grandi con M . apparenteR superiore a 67 kDa è stato rilevato quando è stata utilizzata una concentrazione più elevata di Bcl-2. Poiché la dimensione dei pori Bcl-2 è direttamente correlata con la sua concentrazione (Fig. 1A), questo risultato suggerisce che gli oligomeri Bcl-2 più grandi formano i pori Bcl-2 più grandi.

Nel nostro studio precedente, Bax ha anche formato pori nella membrana liposomiale dopo l'interazione con tBid(14). Il poro Bax è più grande del poro Bcl-2, rilasciando 10-kDa CB-destrano. Concepibilmente il poro di Bax è formato da un oligomero più grande. Infatti, grandi oligomeri Bax sono stati rilevati nelle frazioni di membrana utilizzando il saggio di gel filtrazione uguale a quello per Bcl-2. In presenza di tBid, oligomeri Bax con MR sono stati rilevati da 67 a 200 kDa e oltre (Fig. 4D, grafico in basso). In confronto, gli oligomeri Bcl-2 sono tutti inferiori a 200 kDa anche a una concentrazione 4 volte superiore a quella di Bax (Fig. 4C). Non è stato rilevato Bax nella frazione di membrana in assenza di tBid (Fig. 4D, grafico in alto), coerentemente con il fatto che Bax è una proteina solubile prima dell'interazione con tBid. Presi insieme, questi risultati hanno dimostrato che sia Bcl-2 che Bax formano oligomeri nella membrana dopo l'interazione con tBid, ma le dimensioni degli oligomeri Bcl-2 sono inferiori a quelle degli oligomeri Bax, il che è direttamente correlato alla loro dimensione dei pori.


Biologia della famiglia BCL-2

La via apoptotica intrinseca è regolata dalla famiglia BCL-2 ed è costituita da 2 gruppi principali di proteine: (1) le proteine ​​di sopravvivenza con il suo membro fondatore BCL-2, 3,4 MCL-1, 9 BCL-xL, 15 B- linfoma cellulare-w (BCL-w), 19 e gene correlato a BCL-2 espresso nel fegato fetale-1 (BFL-1), 20 che inibiscono la morte cellulare e (2) le proteine ​​proapoptotiche, che possono essere ulteriormente suddivise in (a) proteine ​​solo BH3: mediatore della morte cellulare che interagisce con BCL-2 (BIM), 21 modulatore dell'apoptosi sovraregolato da p53 (PUMA BBC2), 22,23 NOXA (proteina indotta da forbolo-12 miristato-13-acetato 1 PMAIP1), 24 promotore di morte associato a BCL-2 (BAD), dominio che interagisce con BH3 (BID), 25 killer che interagisce con BCL-2 (BIK), 26 fattore modificante BCL-2 (BMF), 27 Harakiri (HRK) ) 28 e (b) la proteina X associata a BCL-2 (BAX) 29 /BCL-2 omologo antagonista killer (BOK) 30 proteine ​​simili (incluso il killer ovarico correlato a BCL-2 [BOK]). 31 Tutte le proteine ​​della famiglia BCL-2 condividono i comuni domini di omologia BCL-2 (BH) in base alla loro somiglianza di sequenza. 32 Le proteine ​​Prosurvival e BAX/BAK-like contengono rispettivamente 4 e 3 domini BH, mentre le proteine ​​solo BH3 condividono solo il dominio BH3 con la famiglia più ampia (Figura 1).

Membri della famiglia BCL-2 e loro attivazione. La famiglia di proteine ​​BCL-2 contiene domini BH funzionalmente conservati e può essere suddivisa in proteine ​​prosopravvivenza, proapoptotiche solo BH3 e proapoptotiche effettrici. TM, transmembrana.

Membri della famiglia BCL-2 e loro attivazione. La famiglia di proteine ​​BCL-2 contiene domini BH funzionalmente conservati e può essere suddivisa in proteine ​​prosopravvivenza, proapoptotiche solo BH3 e proapoptotiche effettrici. TM, transmembrana.

Attivazione della via apoptotica

L'apoptosi è composta da 3 fasi distinte: (1) iniziazione, (2) impegno e (3) esecuzione. Questo processo è indotto su stimoli di stress come la privazione di nutrienti o il danno al DNA (Figura 2). Le proteine ​​solo BH3 vengono attivate come stimolo di morte in modo temporale e specifico del tipo cellulare e spostano/attivano le proteine ​​simili a BAX/BAK nella fase iniziale. 33 Durante la fase di impegno, BAX e BAK formano omodimeri ed eterodimeri, che si assemblano ulteriormente in strutture simili a pori nella membrana mitocondriale esterna e causano la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna (MOMP). 34-38 Ciò porta successivamente alla perdita del potenziale transmembrana mitocondriale e alla fosforilazione ossidativa e al rilascio del citocromo C dallo spazio intermembrana mitocondriale nel citoplasma. 39 Nella fase di esecuzione, il citocromo C insieme all'APAF-1 e alla procaspasi-9 formano l'apoptosoma, che media la scissione della procaspasi-9 nella sua forma attiva caspasi-9 e di conseguenza promuove l'attivazione delle caspasi-3, 6 e 7 dell'effettore , che inducono le DNasi a scindere il DNA in frammenti. È importante notare che il "punto di non ritorno" si verifica generalmente a livello di attivazione BAX/BAK, 37 a quel punto la cellula si impegna a subire la morte cellulare programmata. A causa delle differenze strutturali, le proteine ​​solo BH3 hanno affinità variabili per particolari proteine ​​pro-sopravvivenza (Figura 3). 40 Alcune proteine ​​solo BH3 come BIM e PUMA si legano promiscuamente a tutte le proteine ​​pro-sopravvivenza. 41,42 Altre proteine ​​solo BH3 si legano in modo più selettivo, come BAD, che si lega a BCL-2, BCL-xL e BCL-W, e NOXA, che si lega principalmente a MCL-1. 40

La via intrinseca dell'apoptosi.

La via intrinseca dell'apoptosi.

Profilo di legame delle proteine ​​proapoptotiche solo BH3 ed effettrici alle proteine ​​​​prosurvival e come le proteine ​​​​prosurvival sono prese di mira dagli inibitori delle proteine ​​​​della famiglia BCL-2.

Profilo di legame delle proteine ​​proapoptotiche BH3-only ed effettrici alle proteine ​​prosurvival e come le proteine ​​prosurvival sono prese di mira dagli inibitori delle proteine ​​della famiglia BCL-2.

Sono state proposte due forme principali di induzione dell'apoptosi. (1) Nel modello di attivazione diretta, le proteine ​​solo BH3 agiscono come attivatori (es. BIM, Bid/tBid, PUMA) o sensibilizzanti (es. BAD, NOXA). Gli attivatori si legano sia alle proteine ​​prosurvival che a quelle BAX/BAK, portando all'integrazione nella membrana mitocondriale esterna. Le proteine ​​di sopravvivenza come BCL-xL possono sequestrare solo proteine ​​BH3 e quindi prevenire l'attivazione di BAX. I sensibilizzanti si legano direttamente alla proteina di sopravvivenza e mediano il rilascio degli attivatori. (2) Il modello indiretto (spostamento) presuppone che BAX e BAK siano costitutivamente attivi ma siano legati a proteine ​​di sopravvivenza per prevenire l'apoptosi. Le proteine ​​solo BH3 spostano BAX e BAK su stimolo di morte. Poiché le proteine ​​​​solo BH3 hanno affinità di legame diverse per ciascuna proteina prosopravvivenza, l'inizio dell'apoptosi richiede l'attivazione di diverse proteine ​​​​solo BH3 per spostare quantità sufficienti di BAX e BAK per causare MOMP. Nell'ultimo decennio, è diventato evidente che questi 2 modelli probabilmente coesistono e operano in un modo specifico del contesto, portando a un modello unificato in cui le proteine ​​pro-sopravvivenza sequestrano sia le proteine ​​solo BH3 che attivano anche BAX e BAK (Figura 2). 38 Il fatto che le proteine ​​solo BH3 abbiano diverse modalità di legame per ciascuna proteina prosopravvivenza offre l'opportunità di indirizzare le proteine ​​prosopravvivenza con inibitori farmacologicamente selettivi con un grande potenziale terapeutico nelle neoplasie ematologiche. 40


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Il silenziamento dell'RNA descrive diversi percorsi meccanicamente correlati che sono coinvolti nel controllo e nella regolazione dell'espressione genica. [4] [5] [6] Le vie di silenziamento dell'RNA sono associate all'attività regolatoria di piccoli RNA non codificanti (circa 20-30 nucleotidi di lunghezza) che funzionano come fattori coinvolti nell'inattivazione di sequenze omologhe, promuovendo l'attività endonucleasica, arresto traduzionale, e/o modificazione cromatica o del DNA. [7] [8] [9] Nel contesto in cui il fenomeno è stato studiato per la prima volta, si è scoperto che il piccolo RNA svolge un ruolo importante nella difesa delle piante dai virus. Ad esempio, questi studi hanno dimostrato che gli enzimi rilevano l'RNA a doppio filamento (dsRNA) che normalmente non si trova nelle cellule e lo digeriscono in piccoli pezzi che non sono in grado di causare malattie. [10] [11] [12] [13] [2]

Mentre alcune funzioni del silenziamento dell'RNA e dei suoi meccanismi sono comprese, molte non lo sono. Ad esempio, il silenziamento dell'RNA si è dimostrato importante nella regolazione dello sviluppo e nel controllo degli eventi di trasposizione. [14] È stato dimostrato che il silenziamento dell'RNA svolge un ruolo nella protezione antivirale nelle piante e negli insetti. [15] Anche nel lievito, è stato dimostrato che il silenziamento dell'RNA mantiene la struttura dell'eterocromatina. [16] Tuttavia, il ruolo variegato e sfumato del silenziamento dell'RNA nella regolazione dell'espressione genica rimane un'indagine scientifica in corso. Una gamma di funzioni diverse è stata proposta per un numero crescente di piccole sequenze di RNA caratterizzate, ad esempio regolazione dello sviluppo, destino delle cellule neuronali, morte cellulare, proliferazione, accumulo di grasso, destino delle cellule ematopoietiche, secrezione di insulina. [17]

Funzioni di silenziamento dell'RNA reprimendo la traduzione o scindendo l'RNA messaggero (mRNA), a seconda della quantità di complementarità dell'appaiamento di basi. L'RNA è stato ampiamente studiato nel suo ruolo di intermediario nella traduzione dei geni in proteine. [18] Le funzioni di regolamentazione più attive, tuttavia, hanno iniziato ad essere affrontate dai ricercatori solo a partire dalla fine degli anni '90. [19] Lo studio di riferimento che fornisce una comprensione del primo meccanismo identificato è stato pubblicato nel 1998 da Fire et al., [1] dimostrando che l'RNA a doppio filamento potrebbe agire come innesco per il silenziamento genico. [19] Da allora, sono state identificate e caratterizzate varie altre classi di silenziamento dell'RNA. [4] Attualmente, il potenziale terapeutico di queste scoperte viene esplorato, ad esempio, nel contesto della terapia genica mirata. [20] [21]

Mentre il silenziamento dell'RNA è una classe di meccanismi in evoluzione, un tema comune è la relazione fondamentale tra piccoli RNA ed espressione genica. [8] È stato anche osservato che le principali vie di silenziamento dell'RNA attualmente identificate hanno meccanismi d'azione che possono coinvolgere sia il silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS) [22] sia le vie di silenziamento genico dipendente dalla cromatina (CDGS). [4] Il CDGS comporta l'assemblaggio di piccoli complessi di RNA su trascritti nascenti ed è considerato come un meccanismo d'azione comprensivo che implica eventi di silenziamento genico trascrizionale (TGS) e silenziamento genico co-trascrizionale (CTGS). [23] Ciò è significativo almeno perché l'evidenza suggerisce che i piccoli RNA svolgono un ruolo nella modulazione della struttura della cromatina e del TGS. [24] [25]

Nonostante l'attenzione iniziale in letteratura sull'interferenza dell'RNA (RNAi) come meccanismo centrale che si verifica a livello della traduzione dell'RNA messaggero, da allora ne sono stati identificati altri nella famiglia più ampia delle vie di silenziamento dell'RNA conservato che agiscono a livello del DNA e della cromatina. [26] Il silenziamento dell'RNA si riferisce all'attività di silenziamento di una serie di piccoli RNA ed è generalmente considerato come una categoria più ampia dell'RNAi. Sebbene i termini siano stati talvolta usati in modo intercambiabile in letteratura, RNAi è generalmente considerato come un ramo del silenziamento dell'RNA. Nella misura in cui è utile tracciare una distinzione tra questi concetti correlati, il silenziamento dell'RNA può essere pensato come riferito allo schema più ampio di controlli correlati a piccoli RNA coinvolti nell'espressione genica e nella protezione del genoma contro sequenze di DNA ripetitive mobili, retroelementi, e trasposoni nella misura in cui questi possono indurre mutazioni. [27] I meccanismi molecolari per il silenziamento dell'RNA sono stati inizialmente studiati nelle piante [12] ma da allora si sono ampliati per coprire una varietà di argomenti, dai funghi ai mammiferi, fornendo una forte evidenza che questi percorsi sono altamente conservati. [28]

Attualmente sono state identificate almeno tre classi primarie di piccoli RNA, ovvero: piccoli RNA interferenti (siRNA), microRNA (miRNA) e RNA interagenti con piwi (piRNA).

Piccolo RNA interferente (siRNA) Modifica

gli siRNA agiscono nel nucleo e nel citoplasma e sono coinvolti nell'RNAi e nel CDGS. [4] I siRNA provengono da lunghi precursori di dsRNA derivati ​​da una varietà di precursori di RNA a singolo filamento (ssRNA), come gli RNA senso e antisenso. i siRNA provengono anche da RNA a forcina derivati ​​dalla trascrizione di regioni ripetute invertite. i siRNA possono anche derivare enzimaticamente da precursori di RNA non codificanti. [29] Il volume della letteratura su siRNA nell'ambito di RNAi è ampio.

MicroRNA (miRNA) Modifica

The majority of miRNAs act in the cytoplasm and mediate mRNA degradation or translational arrest. [30] However, some plant miRNAs have been shown to act directly to promote DNA methylation. [31] miRNAs come from hairpin precursors generated by the RNaseIII enzymes Drosha and Dicer. [32] Both miRNA and siRNA form either the RNA-induced silencing complex (RISC) or the nuclear form of RISC known as RNA-induced transcriptional silencing complex (RITS). [33] The volume of literature on miRNA within the framework of RNAi is extensive.

Three prime untranslated regions and microRNAs Edit

Three prime untranslated regions (3'UTRs) of messenger RNAs (mRNAs) often contain regulatory sequences that post-transcriptionally cause RNA interference. Such 3'-UTRs often contain both binding sites for microRNAs (miRNAs) as well as for regulatory proteins. By binding to specific sites within the 3'-UTR, miRNAs can decrease gene expression of various mRNAs by either inhibiting translation or directly causing degradation of the transcript. The 3'-UTR also may have silencer regions that bind repressor proteins that inhibit the expression of a mRNA.

The 3'-UTR often contains microRNA response elements (MREs). MREs are sequences to which miRNAs bind. These are prevalent motifs within 3'-UTRs. Among all regulatory motifs within the 3'-UTRs (e.g. including silencer regions), MREs make up about half of the motifs.

As of 2014, the miRBase web site, [34] an archive of miRNA sequences and annotations, listed 28,645 entries in 233 biologic species. Of these, 1,881 miRNAs were in annotated human miRNA loci. miRNAs were predicted to have an average of about four hundred target mRNAs (affecting expression of several hundred genes). [35] Freidman et al. [35] estimate that >45,000 miRNA target sites within human mRNA 3'UTRs are conserved above background levels, and >60% of human protein-coding genes have been under selective pressure to maintain pairing to miRNAs.

Direct experiments show that a single miRNA can reduce the stability of hundreds of unique mRNAs. [36] Other experiments show that a single miRNA may repress the production of hundreds of proteins, but that this repression often is relatively mild (less than 2-fold). [37] [38]

The effects of miRNA dysregulation of gene expression seem to be important in cancer. [39] For instance, in gastrointestinal cancers, nine miRNAs have been identified as epigenetically altered and effective in down regulating DNA repair enzymes. [40]

The effects of miRNA dysregulation of gene expression also seem to be important in neuropsychiatric disorders, such as schizophrenia, bipolar disorder, major depression, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorders. [41] [42] [43]

Piwi-interacting RNA (piRNA) Edit

piRNAs represent the largest class of small non-coding RNA molecules expressed in animal cells, deriving from a large variety of sources, including repetitive DNA and transposons. [44] However, the biogenesis of piRNAs is also the least well understood. [45] piRNAs appear to act both at the post-transcriptional and chromatin levels. They are distinct from miRNA due to at least an increase in terms of size and complexity. Repeat associated small interfering RNA (rasiRNAs) are considered to be a subspecies of piRNA. [3]

The most basic mechanistic flow for RNA Silencing is as follows: (For a more detailed explanation of the mechanism, refer to the RNAi:Cellular mechanism article.)

1: RNA with inverted repeats hairpin/panhandle constructs --> 2: dsRNA --> 3: miRNAs/siRNAs --> 4: RISC --> 5: Destruction of target mRNA

  1. It has been discovered that the best precursor to good RNA silencing is to have single stranded antisense RNA with inverted repeats which, in turn, build small hairpin RNA and panhandle constructs. [6] The hairpin or panhandle constructs exist so that the RNA can remain independent and not anneal with other RNA strands.
  2. These small hairpin RNAs and/or panhandles then get transported from the nucleus to the cytosol through the nuclear export receptor called exportin-5, and then get transformed into a dsRNA, a double stranded RNA, which, like DNA, is a double stranded series of nucleotides. If the mechanism didn't use dsRNAs, but only single strands, there would be a higher chance for it to hybridize to other "good" mRNAs. As a double strand, it can be kept on call for when it is needed.
  3. The dsRNA then gets cut up by a Dicer into small (21-28 nt = nucleotides long) strands of miRNAs (microRNAs) or siRNAs (short interfering RNAs.) A Dicer is an endoribonucleaseRNase, which is a complex of a protein mixed with strand(s) of RNA.
  4. Lastly, the double stranded miRNAs/siRNAs separate into single strands the antisense RNA strand of the two will combine with another endoribonuclease enzyme complex called RISC (RNA-induced silencing complex), which includes the catalytic component Argonaute, and will guide the RISC to break up the "perfectly complementary" target mRNA or viral genomic RNA so that it can be destroyed. [2][6]
  5. It means that based on a short sequence specific area, a corresponding mRNA will be cut. To make sure, it will be cut in many other places as well. (If the mechanism only worked with a long stretch, then there would be higher chance that it would not have time to match to its complementary long mRNA.) It has also been shown that the repeated-associated short interference RNAs (rasiRNA) have a role in guiding chromatin modification. [2]

For an animated explanation of the mechanism of RNAi by Nature Reviews, see the External Links section below.

Immunity against viruses or transposons Edit

RNA silencing is the mechanism that our cells (and cells from all kingdoms) use to fight RNA viruses and transposons (which originate from our own cells as well as from other vehicles). [2] In the case of RNA viruses, these get destroyed immediately by the mechanism cited above. In the case of transposons, it's a little more indirect. Since transposons are located in different parts of the genome, the different transcriptions from the different promoters produce complementary mRNAs that can hybridize with each other. When this happens, the RNAi machinery goes into action, debilitating the mRNAs of the proteins that would be required to move the transposons themselves. [46]

Down-regulation of genes Edit

For a detailed explanation of the down-regulation of genes, see RNAi:downregulation of genes

Up-regulation of genes Edit

For a detailed explanation of the up-regulation of genes, see RNAi:upregulation of genes

RNA silencing also gets regulated Edit

The same way that RNA silencing regulates downstream target mRNAs, RNA silencing itself is regulated. For example, silencing signals get spread between cells by a group of enzymes called RdRPs (RNA-dependent RNA polymerases) or RDRs. [2]

Growing understanding of small RNA gene-silencing mechanisms involving dsRNA-mediated sequence-specific mRNA degradation has directly impacted the fields of functional genomics, biomedicine, and experimental biology. The following section describes various applications involving the effects of RNA silencing. These include uses in biotechnology, therapeutics, and laboratory research. Bioinformatics techniques are also being applied to identify and characterize large numbers of small RNAs and their targets.

Biotechnology Edit

Artificial introduction of long dsRNAs or siRNAs has been adopted as a tool to inactivate gene expression, both in cultured cells and in living organisms. [2] Structural and functional resolution of small RNAs as the effectors of RNA silencing has had a direct impact on experimental biology. For example, dsRNA may be synthesized to have a specific sequence complementary to a gene of interest. Once introduced into a cell or biological system, it is recognized as exogenous genetic material and activates the corresponding RNA silencing pathway. This mechanism can be used to effect decreases in gene expression with respect to the target, useful for investigating loss of function for genes relative to a phenotype. That is, studying the phenotypic and/or physiologic effects of expression decreases can reveal the role of a gene product. The observable effects can be nuanced, such that some methods can distinguish between “knockdown” (decrease expression) and “knockout” (eliminate expression) of a gene. [47] RNA interference technologies have been noted recently as one of the most widely utilized techniques in functional genomics. [48] Screens developed using small RNAs have been used to identify genes involved in fundamental processes such as cell division, apoptosis and fat regulation.

Biomedicine Edit

Since at least the mid-2000s, there has been intensifying interest in developing short interfering RNAs for biomedical and therapeutic applications. [49] Bolstering this interest is a growing number of experiments which have successfully demonstrated the clinical potential and safety of small RNAs for combatting diseases ranging from viral infections to cancer as well as neurodegenerative disorders. [50] In 2004, the first Investigational New Drug applications for siRNA were filed in the United States with the Food and Drug Administration it was intended as a therapy for age-related macular degeneration. [48] RNA silencing in vitro and in vivo has been accomplished by creating triggers (nucleic acids that induce RNAi) either via expression in viruses or synthesis of oligonucleotides. [51] Optimistically many studies indicate that small RNA-based therapies may offer novel and potent weapons against pathogens and diseases where small molecule/pharmacologic and vaccine/biologic treatments have failed or proved less effective in the past. [49] However, it is also warned that the design and delivery of small RNA effector molecules should be carefully considered in order to ensure safety and efficacy.

The role of RNA silencing in therapeutics, clinical medicine, and diagnostics is a fast developing area and it is expected that in the next few years some of the compounds using this technology will reach market approval. A report has been summarized below to highlight the many clinical domains in which RNA silencing is playing an increasingly important role, chief among them are ocular and retinal disorders, cancer, kidney disorders, LDL lowering, and antiviral. [51] The following table displays a listing of RNAi based therapy currently in various phases of clinical trials. The status of these trials can be monitored on the ClinicalTrials.gov website, a service of the National Institutes of Health (NIH). [52] Of note are treatments in development for ocular and retinal disorders, that were among the first compounds to reach clinical development. AGN211745 (sirna027) (Allergan) and bevasiranib (Cand5) (Opko) underwent clinical development for the treatment of age-related macular degeneration, but trials were terminated before the compounds reached the market. Other compounds in development for ocular conditions include SYL040012 (Sylentis) and QPI-007 (Quark). SYL040012 (bamosinan) is a drug candidate under clinical development for glaucoma, a progressive optic neurdegeneration frequently associated to increased intraocular pressure QPI-007 is a candidate for the treatment of angle-closure glaucoma and Non-arteritic anterior ischaemic optic neuropathy both compounds are currently undergoing phase II clinical trials. Several compounds are also under development for conditions such as cancer and rare diseases.

Clinical domain Droga Indication Obbiettivo
Ocular and retinal disorders TD101 Pachyonychia congenita Keratin 6A N171K mutant
Ocular and retinal disorders QPI-1007 Non-arteritic anterior ischaemic optic neuropathy Caspase 2
Ocular and retinal disorders AGN211745 Age-related macular degeneration, choroidal neovascularization VEGFR1
Ocular and retinal disorders PF-655 Diabetic macular oedema, age-related macular degeneration RTP801
Ocular and retinal disorders SYL040012 Glaucoma β2 adrenergic receptor
Ocular and retinal disorders Bevasiranib Diabetic macular oedema VEGF
Ocular and retinal disorders Bevasiranib Macular degeneration VEGF
Cancro CEQ508 Familial adenomatous polyposis β-catenin
Cancro ALN-PLK1 Tumore al fegato PLK1
Cancro FANG Solid tumor Furin
Cancro CALAA-01 Solid tumor RRM2
Cancro SPC2996 leucemia linfatica cronica BCL-2
Cancro ALN-VSP02 Solid tumor VEGF, kinesin spindle protein
Cancro NCT00672542 Metastatic melanoma LMP2, LMP7, and MECL1
Cancro Atu027 Solid malignancies PKN3
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Acute kidney injury p53
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Graft dysfunction kidney transplant p53
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Kidney injury acute renal failure p53
LDL lowering TKM-ApoB Hypercholesterolaemia APOB
LDL lowering PRO-040,201 Hypercholesterolaemia APOB
Antivirale miravirsen Virus dell'epatite C miR-122
Antivirale pHIV7-shI-TAR-CCR5RZ HIV HIV Tat protein, HIV TAR RNA, human CCR5
Antivirale ALN-RSV01 RSV RSV nucleocapsid
Antivirale ALN-RSV01 RSV in lung transplant patients RSV nucleocapsid

Main challenge Edit

As with conventional manufactured drugs, the main challenge in developing successful offshoots of the RNAi-based drugs is the precise delivery of the RNAi triggers to where they are needed in the body. The reason that the ocular macular degeneration antidote was successful sooner than the antidote with other diseases is that the eyeball is almost a closed system, and the serum can be injected with a needle exactly where it needs to be. The future successful drugs will be the ones who are able to land where needed, probably with the help of nanobots. Below is a rendition of a table [51] that shows the existing means of delivery of the RNAi triggers.

Laboratory Edit

The scientific community has been quick to harness RNA silencing as a research tool. The strategic targeting of mRNA can provide a large amount of information about gene function and its ability to be turned on and off. Induced RNA silencing can serve as a controlled method for suppressing gene expression. Since the machinery is conserved across most eukaryotes, these experiments scale well to a range of model organisms. [53] In practice, expressing synthetic short hairpin RNAs can be used to reach stable knock-down. [54] If promoters can be made to express these designer short hairpin RNAs, the result is often potent, stable, and controlled gene knock-down in both in vitro and in vivo contexts. [55] Short hairpin RNA vector systems can be seen as roughly analogous in scope to using cDNA overexpression systems. [56] Overall, synthetic and natural small RNAs have proven to be an important tool for studying gene function in cells as well as animals. [57]

Bioinformatics approaches to identify small RNAs and their targets have returned several hundred, if not thousands of, small RNA candidates predicted to affect gene expression in plants, C. elegans, D. melanogaster, zebrafish, mouse, rat, and human. [58] These methods are largely directed to identifying small RNA candidates for knock-out experiments but may have broader applications. One bioinformatics approach evaluated sequence conservation criteria by filtering seed complementary target-binding sites. The cited study predicted that approximately one third of mammalian genes were to be regulated by, in this case, miRNAs. [59]

Ethics & Risk-Benefit Analysis Edit

One aspect of RNA silencing to consider is its possible off-target affects, toxicity, and delivery methods. If RNA silencing is to become a conventional drug, it must first pass the typical ethical issues of biomedicine. [60] Using risk-benefit analysis, researchers can determine whether RNA silencing conforms to ethical ideologies such as nonmaleficence, beneficence, and autonomy. [61]

There is a risk of creating infection-competent viruses that could infect non-consenting people. [62] There is also a risk of affecting future generations based on these treatments. These two scenarios, in respect to autonomy, is possible unethical. At this moment, unsafe delivery methods and unintended aspects of vector viruses add to the argument against RNA silencing. [61]

In terms of off-target effects, siRNA can induce innate interferon responses, inhibit endogenous miRNAs through saturation, and may have complementary sequences to other non-target mRNAs. These off-targets could also have target up-regulations such as oncogenes and antiapoptotic genes. The toxicity of RNA silencing is still under review as there are conflicting reports. [61] [62] [63]

RNA silencing is quickly developing, because of that, the ethical issues need to be discussed further. With the knowledge of general ethical principles, we must continuously perform risk-benefit analysis. [61]


Conclusioni

The method reported here, EMIRGE, reconstructs full-length SSU sequences from metagenomic data from a microbial community of interest, accurate to the species level. In addition, the method also provides accurate SSU sequence abundance estimates. EMIRGE is robust to errors and omissions in the reference database, and is broadly applicable to any dataset produced with short read sequencing technology. An open-source implementation of the algorithm is freely available [41]. We expect that application of the method, especially with very deep sequencing, will provide new insights into fine details of changing microbial community structure.


Original articles

Lovell, J. F. et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cellula 135, 1074–1084 (2008)

Edlich, F. et al. Bcl-x(L) retrotranslocates Bax from the mitochondria into the cytosol. Cellula 145, 104–116 (2011)

Czabotar et al. Bax crystal structures reveal how BH3 domains activate Bax and nucleate its oligomerization to induce apoptosis. Cellula 152, 519–531 (2013)

Ichim et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol. Cellula 57, 860–872 (2015)

McArthur, K. et al. BAK/BAX macropores facilitate mitochondrial herniation and mtDNA efflux during apoptosis. Scienza 23, eaao6047 (2018)


Informazioni sull'autore

Jonathan B Baell, Sanji Kulasegaram, John P Parisot & Brian J Smith

Present address: Present addresses: Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Parkville, Victoria, Australia (J.B.B.) Chemistry Department, Monash University, Clayton, Victoria, Australia (S.K.) Peter McCallum Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia (J.P.P.) Department of Chemistry, La Trobe Institute of Molecular Sciences, La Trobe University, Bundoora, Victoria, Australia (B.J.S.).,

Peter E Czabotar and Brad E Sleebs: These authors contributed equally to this work.

Affiliazioni

Chemical Biology Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Guillaume Lessene, Brad E Sleebs, Kym N Lowes, Jonathan B Baell, Wilhelmus J A Kersten, Sanji Kulasegaram, Rebecca M Moss, John P Parisot, Brian J Smith, Ian P Street, Hong Yang, David C S Huang & Keith G Watson

Department of Medical Biology, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia

Guillaume Lessene, Peter E Czabotar, Brad E Sleebs, Kym N Lowes, Jerry M Adams, Jonathan B Baell, Peter M Colman, Wilhelmus J A Kersten, Sanji Kulasegaram, Rebecca M Moss, John P Parisot, Brian J Smith, Ian P Street, Hong Yang, David C S Huang & Keith G Watson

Structural Biology Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Peter E Czabotar & Peter M Colman

Department of Early Discovery Biochemistry, Genentech, Inc., San Francisco, California, USA

Kerry Zobel, Kurt Deshayes & Wayne J Fairbrother

Molecular Genetics of Cancer Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Department of Discovery Chemistry, Genentech, Inc., San Francisco, California, USA


Guarda il video: Apoptosis Regulation by Genes. Bcl-2 Family (Dicembre 2022).