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Come entrano i detersivi all'interno della membrana idrofoba?

Come entrano i detersivi all'interno della membrana idrofoba?


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Secondo Biologia molecolare e cellulare (Stephen L. Wolfe),

Le membrane si disperdono quasi istantaneamente se esposte a un ambiente non polare o a detersivi, che sono molecole anfipatiche che possono formare un rivestimento idrofilo attorno alle porzioni idrofobe dei lipidi e delle proteine ​​di membrana in soluzioni acquose.

Questa potrebbe essere una domanda stupida ma... se i detersivi possono "formare strati attorno alle porzioni idrofobe" delle molecole sospese dalla membrana, devono, in qualche modo, entrare nell'interno della membrana idrofoba... giusto?

Come entrano all'interno della membrana? Formano ammassi come vescicole endocitiche? Cosa succede dopo che hanno formato cappotti idrofili attorno alle regioni di molecole idrofobe?


Dipende dalla concentrazione, ma a concentrazioni più elevate le molecole detergenti formano le cosiddette micelle, dove la "coda" idrofoba è orientata verso la parte interna e la "testa" idrofila è orientata verso l'esterno. Questo permette anche alla micella di fondersi con la membrana e quindi di disintegrarla. Questa illustrazione da Wikipedia mostra schematicamente:

È tratto dall'articolo sul tensioattivo, che ha maggiori dettagli.


La membrana viene dispersa dai detergenti. Ma i detergenti, nelle giuste concentrazioni e condizioni (sale, pH, et) formano micelle con curvatura minore rispetto ai lipidi che compongono le membrane cellulari. Con un po' di fortuna, possono formare una piccola bolla micellare idrofoba attorno alla proteina.

Questa figura raffigura micelle detergenti attorno alle regioni legate alla membrana di una proteina di membrana, si spera senza distorcere la forma della proteina!

Dato che hai chiesto nei commenti, ecco un'immagine della densità elettronica della micella del detersivo nei cristalli di porin ompF: la densità del detersivo è blu, la proteina è rossa. Per un po', dalla metà degli anni '90 fino a forse qualche anno fa, c'è stato un numero ragionevole di simulazioni, comprese le molecole di detersivo. La mobilità delle catene nelle micelle significa che nessuna struttura specifica del modello sarebbe accurata, ma può aiutare a comprendere l'ambiente elettromagnetico del solvente in casi importanti come il trasferimento di carica in un centro di fotoreazione o la dinamica del trasporto attraverso un'importazione/ esportare proteine.


Effetto idrofobo

Il effetto idrofobico è la tendenza osservata delle sostanze non polari ad aggregarsi in una soluzione acquosa ed escludere le molecole d'acqua. [1] [2] La parola idrofobico significa letteralmente "paura dell'acqua", e descrive la segregazione dell'acqua e delle sostanze non polari, che massimizza il legame idrogeno tra le molecole d'acqua e riduce al minimo l'area di contatto tra l'acqua e le molecole non polari. In termini di termodinamica, l'effetto idrofobico è il cambio di energia libera dell'acqua che circonda un soluto. [3] Una variazione positiva di energia libera del solvente circostante indica idrofobicità, mentre una variazione negativa di energia libera implica idrofilia.

L'effetto idrofobico è responsabile della separazione di una miscela di olio e acqua nei suoi due componenti. È anche responsabile degli effetti relativi alla biologia, tra cui: la membrana cellulare e la formazione di vescicole, il ripiegamento delle proteine, l'inserimento delle proteine ​​di membrana nell'ambiente lipidico non polare e le associazioni tra proteine ​​e piccole molecole. Quindi l'effetto idrofobico è essenziale per la vita. [4] [5] [6] [7] Le sostanze per le quali si osserva questo effetto sono note come idrofobi.


Come entrano i detersivi all'interno della membrana idrofoba? - Biologia

Qui presentiamo una rassegna completa dei detergenti da laboratorio e delle loro applicazioni negli esperimenti biomedici. Questa recensione include discussioni sui detergenti ionici, non ionici e zwitterionici, le loro proprietà generali e informazioni sui detergenti comunemente usati da ciascun gruppo. Infine, includiamo una breve discussione sui risultati del sondaggio Labome per alcuni comuni detergenti.

I detergenti utilizzati nei laboratori biomedici sono tensioattivi blandi (agenti di superficie), utilizzati per la lisi cellulare (cioè la distruzione delle membrane cellulari) e il rilascio di materiali intracellulari. Sono molecole anfifiliche, contenenti sia regioni idrofile che idrofobe. Questa proprietà anfifilica consente ai detergenti di rompere le associazioni proteina-proteina, proteina-lipidi e lipidi-lipidi, denaturare le proteine ​​e altre macromolecole e prevenire il legame non specifico nei saggi immunochimici e nella cristallizzazione delle proteine.

Esistono molti tipi di detergenti utilizzati nelle ricerche di laboratorio. Continuano a essere sviluppati nuovi composti anfifilici, solitamente progettati per applicazioni specifiche (ad esempio, maltosio-neopentil glicole [1] e dicarbossilati glicosil-sostituiti [2]). Questo articolo passa in rassegna le caratteristiche e le applicazioni dei detergenti da laboratorio più comunemente utilizzati.

TipoSostanze chimiche
ionicosodio dodecil solfato (SDS), desossicolato, colato, sarkosyl
non ionicoTriton X-100, DDM, digitonina, interpolazione 20, interpolazione 80
zwitterionicoCHAPS
caotropicourea

I detersivi sono composti organici anfifilici costituiti da una frazione idrofobica di idrocarburi non polari (coda) e un gruppo di testa polare idrofilo (Fig. 1A). Questa struttura molecolare è molto simile ai fosfolipidi anfifilici che compongono le nostre membrane cellulari, tranne per il fatto che i fosfolipidi possiedono una coppia di code idrofobiche attaccate al gruppo di testa idrofilo (Fig 1D). Quando disciolte in acqua a concentrazioni e temperature appropriate, le molecole anfifiliche si autoassemblano in strutture che mantengono i loro gruppi di testa idrofili all'esterno e le code idrofobe all'interno lontano dall'acqua. A causa delle loro differenze molecolari, le molecole detergenti formano micelle sferiche (Fig. 1C) mentre i fosfolipidi hanno maggiori probabilità di sviluppare un doppio strato (Fig. 1D). La somiglianza nelle strutture molecolari consente al detergente di penetrare nei doppi strati fosfolipidici e quindi di distruggere le membrane cellulari.

Inoltre, il nucleo idrofobo della micella può legarsi alle regioni idrofobe delle proteine ​​(Fig 1B). Il numero di molecole detergenti in una micella è chiamato numero di aggregazione, un parametro importante utilizzato per valutare la solubilità delle proteine ​​di membrana [3]. La lunghezza della regione idrofoba è direttamente proporzionale al grado di idrofobicità, ed è abbastanza costante tra i detergenti, mentre il gruppo di testa carico è variabile. Sia la temperatura che la concentrazione sono parametri importanti della separazione di fase e della solubilità di un detergente. La concentrazione minima di detersivo alla quale si osservano le micelle a una data temperatura è chiamata concentrazione critica delle micelle (CMC). A qualsiasi concentrazione inferiore alla CMC, si osservano solo monomeri a concentrazioni superiori alla CMC, coesistono micelle e monomeri, insieme ad altre fasi non micellari che non sono disciolte in acqua. Allo stesso modo, la temperatura più bassa alla quale si formano le micelle è chiamata temperatura critica delle micelle (CMT). La CMC è anche influenzata dal grado di lipofilia del gruppo di testa. Generalmente, un carattere lipofilo o lipofobico basso determina un'elevata CMC.

I comuni detergenti sono classificati in tre gruppi in base alle loro caratteristiche: ionici (anionici o cationici), non ionici e zwitterionici. Di seguito discuto i detergenti comuni in ciascuna di queste categorie e fornisco informazioni importanti sulla selezione e l'uso dei detergenti da laboratorio.

I detergenti ionici sono costituiti da una catena idrofoba e da un gruppo di testa carico che può essere anionico o cationico. Generalmente hanno valori di CMC più alti rispetto ai detergenti non ionici e tendono ad essere abbastanza aggressivi. A causa dei loro gruppi di testa carichi, i detergenti ionici non possono essere rimossi mediante cromatografia a scambio ionico. Inoltre, dovrebbero essere prese ulteriori precauzioni quando si utilizzano detergenti ionici perché alcune delle loro proprietà possono essere alterate in tamponi con forza ionica variabile (ad esempio, CMC può diminuire drasticamente quando la concentrazione di NaCl aumenta da 0 a 500 mM).

L'SDS anionico è un tensioattivo molto comunemente usato ed efficace nel solubilizzare la maggior parte delle proteine. Interrompe i legami non covalenti all'interno e tra le proteine, denaturandole e causando la perdita della loro conformazione e funzione native. L'SDS si lega a una proteina con un rapporto di 1,4:1 p/p (corrispondente a circa una molecola di SDS per due amminoacidi), mascherando la carica della proteina. Quindi SDS aggiunge una carica negativa complessiva a tutte le proteine ​​nel campione indipendentemente dal loro punto isoelettrico (pI). Una volta legate da molecole SDS caricate negativamente, le proteine ​​possono essere separate in base alle dimensioni. Questa è una grande ragione per l'ampio uso dell'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) per la separazione e lo studio delle proteine. Di solito, per la lisi cellulare completa in presenza di SDS, un campione deve essere sonicato o tranciato (ad esempio, fatto passare attraverso un ago da 19G) più volte per garantire la degradazione del DNA. L'SDS non può essere utilizzato quando sono richieste proteine ​​attive o quando si studiano le interazioni proteina-proteina perché entrambe sono interrotte dall'SDS. Quando si lavora con SDS è importante sapere che SDS precipita a basse temperature e questo effetto è potenziato in presenza di sali di potassio. Questo fenomeno a volte può essere sfruttato per rimuovere SDS da un campione di proteine ​​[4].

Il sodio desossicolato e il sodio colato sono detergenti a base di sali biliari. Sono entrambi detergenti anionici. Questi detergenti sono spesso utilizzati per la distruzione della membrana e l'estrazione di proteine ​​di membrana, ad esempio il recettore apelina [5]. Il desossicolato denatura le proteine ​​mentre il colato è un detergente non denaturante. Un potenziale vantaggio per entrambi questi detergenti è che possono essere rimossi dai campioni tramite dialisi, il che può aiutare con la quantificazione e/o l'analisi a valle delle proteine.

Sarkosyl, noto anche come sarcosyl o sodio lauroyl sarcosinate, è un tensioattivo anionico. È anfifilico a causa della catena idrofoba di 14 atomi di carbonio (lauroyl) e del carbossilato idrofilo. Il carbossilato con un valore di pKa di 3,6 è caricato negativamente in qualsiasi soluzione fisiologica. Sarkosyl è preparato da lauroil cloruro e sarcosina in presenza di idrossido di sodio e viene purificato mediante ricristallizzazione da alcol, o mediante acidificazione con un acido minerale, separazione dell'acido libero e neutralizzazione dell'acido libero. Sarkosyl è stato utilizzato anche per migliorare la bagnabilità e la penetrazione di prodotti farmaceutici topici. Nell'industria alimentare, il sarkosyl è approvato per l'uso nella lavorazione, imballaggio e trasporto di alimenti destinati al consumo umano e negli adesivi utilizzati per la conservazione o il trasporto di alimenti. È ampiamente utilizzato in formulazioni cosmetiche come shampoo e bagnoschiuma a concentrazioni intorno al 3-13% [6]. Sarkosyl è anche utilizzato nella lavorazione della finitura dei metalli per le sue proprietà di modifica dei cristalli, antiruggine e anticorrosione.

Sarkosyl è ampiamente utilizzato negli esperimenti di laboratorio, ad esempio per solubilizzare la tau nella ricerca sulla malattia di Alzheimer [7], grazie alla sua buona solubilità in acqua, all'elevata stabilità della schiuma e alla forte capacità di assorbimento delle proteine. Sarkosyl funge da detergente per permeabilizzare le cellule ed estrarre proteine ​​in tecniche di isolamento e purificazione come il western blot e l'ELISA indiretto. Può anche inibire l'inizio della trascrizione del DNA.

Una delle principali applicazioni del sarkosyl è per solubilizzare e ripiegare le proteine ​​dai corpi di inclusione (aggregati proteici all'interno del citoplasma o dei nuclei). Proteine ​​eucariotiche ricombinanti sovraespresse in Escherichia coli tendono a formare tali organismi di inclusione. Sarkosyl è spesso usato per solubilizzare un pellet di corpi inclusi per estrarre le proteine ​​e consentire loro di ripiegarsi nella loro forma nativa. Il lavoro precedente prevedeva la solubilizzazione dei corpi di inclusione con denaturanti, come l'urea o il guanidinio cloridrato, e il ripiegamento mediante diluizione lenta, tuttavia, la maggior parte delle proteine ​​solubilizzate si aggregano e precipitano dopo la rimozione dei detergenti forti. Sarkosyl è un agente solubilizzante efficace che riduce al minimo l'aggregazione e consente il ripiegamento a concentrazioni proteiche più elevate (fino a 10 volte superiori rispetto all'utilizzo di guanidinio cloridrato [8]). Uno studio ha scoperto che oltre il 95% delle proteine ​​​​di fusione del corpo di inclusione sono state solubilizzate con il 10% di sarkosyl e che le proteine ​​potrebbero quindi essere recuperate con una miscela di altri detergenti (cioè Triton X-100 e CHAPS) [9]. Le proteine ​​nell'estratto solubile con sarkosyl possono anche essere conservate a 4°C per una settimana prima della purificazione per affinità. Va notato, tuttavia, che il sarkosyl interferisce con il successivo processo cromatografico e deve essere rimosso dalla soluzione mediante diluizione o dialisi.

I detergenti non ionici hanno gruppi di testa idrofili non caricati. Sono considerati tensioattivi delicati poiché rompono le associazioni proteina-lipidi e lipidi-lipidi, ma in genere non le interazioni proteina-proteina e, in generale, non denaturano le proteine. Pertanto, molte proteine ​​di membrana possono essere solubilizzate nella loro forma nativa e attiva, mantenendo i loro interattori proteici. Tuttavia, poiché non tutte le proteine ​​si comportano allo stesso modo con diversi detergenti non ionici, potrebbero essere necessari tentativi ed errori per trovare il detergente migliore per le proteine ​​di interesse. Inoltre, va notato che la maggior parte dei detergenti non ionici interferisce con la spettrofotometria ultravioletta (UV). Pertanto, la determinazione delle proteine ​​a 280 nm in presenza di detergenti non ionici è tipicamente imprecisa.

Tutti i membri della famiglia Triton: Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40 (NP-40), Igepal® CA-630, sono abbastanza simili, differendo leggermente nel numero medio (n) di monomeri per micella (9,6, 8,0, 9,0 e 9,5, rispettivamente) e la distribuzione dimensionale del loro gruppo di testa a base di polietilenglicole (PEG). I valori di CMC di questi detergenti sono bassi, e quindi non possono essere facilmente rimossi dalla dialisi. Triton X-100, un tipico detergente non ionico, deriva dal poliossietilene e contiene un gruppo alchilfenil idrofobo. Triton X-100 è comunemente usato per isolare complessi proteici di membrana e il tensioattivo di scelta per la maggior parte, ad esempio per esperimenti di co-immunoprecipitazione. Altri membri della famiglia Triton sono utilizzati per l'isolamento delle proteine ​​di membrana mediante separazione di fase a causa di bassi punti di intorbidamento (la temperatura alla quale le micelle si aggregano e formano una fase distinta). Mentre il punto di nuvola di Triton X-100 è 64°C, il punto di cloud di Triton X-114 è 23°C. Ciò consente l'estrazione e la solubilizzazione delle proteine ​​di membrana in Triton X-114 senza portare i campioni a temperature più calde che potrebbero denaturare molte proteine.

Brij™ 35 è un altro tensioattivo di poliossietilene non ionico, comunemente usato come componente di tamponi di lisi cellulare o tamponi di analisi o un tensioattivo nelle applicazioni HPLC.

L'n-dodecil-β-D-maltoside (DDM) è un tensioattivo glicosidico, sempre più utilizzato con l'isolamento idrofobico e delle proteine ​​di membrana quando è necessario preservare l'attività proteica. È più efficiente nella solubilizzazione delle proteine ​​per l'elettroforesi 2-D rispetto a molti altri detergenti, inclusi CHAPS e NP-40 [10]. La glicocatena nel suo sito lipofilo, il suo alto CMC di 0,17 mM e l'interfaccia delle micelle creano un microambiente acquoso ideale per solubilizzare e mantenere la stabilità della membrana e delle proteine ​​idrofobe [11]. Ad esempio, Winkler MBL et al hanno purificato la proteina NCR1 con l'aggiunta di n-dodecil-β-D-maltopiranoside [12], così come Li Y et al per le proteine ​​LptB2FG e LptB2FGC [13]. Steichen JM et al. complessi proteici misti in una soluzione di DDM da Anatrace prima di Cryo-EM [14].

Altri maltosidi, come il beta-decil-maltoside, hanno diverse lunghezze delle catene alchiliche idrofobe. Il glucoside (ottil-glucoside) è una potenziale alternativa ai detergenti maltoside per la ricerca sulle proteine ​​[15].

Digitonina, un glicoside steroideo derivato dalla pianta della digitale purpurea (Digitale purpurea), viene utilizzato per la solubilizzazione delle membrane cellulari. Come con altri detergenti non ionici discussi qui, la digitonina viene spesso utilizzata per solubilizzare le proteine ​​di membrana senza denaturarle. Ad esempio, B de Laval et al hanno lisato cellule con l'1% di digitonina per la reazione della trasposasi Tn5 durante il protocollo ATAC-seq [16]. Zhao Y et al hanno rilasciato recettori AMPA sinaptici ed extrasinaptici dalla densità postsinaptica con digitonina [17]. Inoltre, la digitonina viene utilizzata per estrarre gli organelli cellulari. La digitonina interagisce con il colesterolo nelle membrane e quindi può essere utilizzata per permeabilizzare la membrana plasmatica ricca di colesterolo lasciando intatte le membrane degli organelli poveri di colesterolo.

Tween-20 e Tween-80 sono tensioattivi polisorbati con una frazione di estere di acidi grassi e una lunga catena di poliossietilene. Hanno CMC molto basso, sono generalmente tensioattivi delicati, non influiscono sull'attività proteica e sono efficaci nella solubilizzazione. Le interpolazioni non sono ingredienti comuni dei tamponi di lisi cellulare, tuttavia, sono abitualmente utilizzati come agenti di lavaggio nell'immunoblotting e nell'ELISA per ridurre al minimo il legame non specifico degli anticorpi e rimuovere le frazioni non legate e utilizzate per permeabilizzare le membrane cellulari. Ad esempio, Yang J et al hanno immunocolorato il tag FLAG intracellulare dopo aver trattato le cellule HEK293 con 0,2% di Tween 20 [18].

Una domanda comune riguardante i detersivi della famiglia Tween è la differenza tra Tween 20 e Tween 80, i due componenti più comunemente usati. Tween 20 ha acido laurico, mentre Tween 80 ha acido oleico (Figura 3). La tabella 2 riassume vari aspetti tra di loro. Questi detersivi possono essere spesso usati in modo intercambiabile, tuttavia, la differenza tra loro a volte è importante, come ad esempio in in vivo studi che possono essere influenzati dai diversi livelli di effetto emolitico di Tween 20 e Tween 80 [19]. Greenwood DJ e altri, ad esempio, sono cresciuti Mycobacterium tuberculosis in un terreno addizionato con 0,05% di Tween 80 [20]. Ouadah Y et al hanno iniettato una soluzione di dibenzazepina con 0,1% v/v Tween 80 nei topi per inibire la segnalazione di Notch [21].

Sinonimi Formula chimica Peso molecolare Densità (g/ml) Aspetto esteriore Applicazioni
tra 20polisorbato 20, poliossietilene sorbitano monolaurato, PEG (20) sorbitano monolauratoC 58 H 114 O 26 12281.1Liquido viscoso trasparente, da giallo a giallo-verdeun'ampia gamma di applicazioni: come agente bloccante in tamponi di lavaggio PBS o TBS per ELISA, Western blotting e altri metodi di immunodosaggio per la lisi di cellule di mammifero e come agente solubilizzante per proteine ​​di membrana.
Tween 80polisorbato 80, poliossietilene sorbitano monooleato, PEG (80) sorbitano monooleatoC 64 H 124 O 26 13101.06-1.09liquido viscoso color ambracome agente stabilizzante per proteine ​​utilizzate nei test per l'identificazione del fenotipo di alcuni micobatteri utilizzati nelle preparazioni vaccinali [22]

Sebbene i detergenti non ionici siano generalmente relativamente delicati, molte proteine ​​si denaturano o si aggregano in presenza di questi detergenti. Per migliorare questo problema sono stati sviluppati nuovi anfifili glico-litocolati non ionici (GLC-1, GLC-2 e GLC-3) e gli anfifili glico-diosgenina (GDN) [23]. La GDN è stata utilizzata per estrarre l'ATP sintasi dimerica mitocondriale del lievito per comprendere meglio come funziona la proteina [24]. Pluronic F-68 è comunemente usato nella coltura cellulare in sospensione allo 0,1% per ridurre la forza di taglio dell'acqua [25].

I gruppi principali dei detergenti zwitterionici sono idrofili e contengono cariche sia positive che negative in numero uguale, con conseguente carica netta zero. Sono tensioattivi più aggressivi rispetto ai detergenti non ionici. Un tipico detergente zwitterionico è il 3-[(3-colamidopropil)dimetilammonio]-1-propansolfonato, meglio conosciuto come CHAPS. CHAPS alto CMC (6 mM a temperatura ambiente) consente un'efficace rimozione mediante dialisi. È molto comune nella preparazione del campione a concentrazioni del 2-4% per la focalizzazione isoelettrica e l'elettroforesi 2D. CHAPSO differisce da CHAPS in quanto contiene un gruppo di testa più polare, che lo rende più capace di solubilizzare le molecole idrofobiche. Pertanto, CHAPSO viene utilizzato principalmente per la solubilizzazione delle proteine ​​integrali di membrana.

Gli agenti caotropici sono sostanze simili ai tensioattivi in ​​quanto rompono le interazioni non covalenti (legami idrogeno, interazioni dipolo-dipolo, interazioni idrofobiche) facilitando la denaturazione delle proteine, che in questo caso è solitamente reversibile. L'urea è un comune agente caotropico utilizzato da solo o in combinazione con tiourea o altri detergenti, in applicazioni come l'elettroforesi su gel 2D e la digestione enzimatica in soluzione delle proteine ​​per la preparazione durante i flussi di lavoro proteomici. Quando si utilizza l'urea, occorre prestare particolare attenzione a non riscaldare il campione oltre i 37°C poiché ciò porterà alla carbamilazione delle proteine ​​[26].

Per la solubilità delle proteine ​​di membrana, in genere dovrebbe essere scelto un detergente con un alto CMC e anche il volume e la concentrazione del tampone sono cruciali poiché dovrebbe essere presente una quantità sufficiente di detergente per solubilizzare tutte le proteine ​​​​di membrana nel campione. Nella maggior parte dei casi, la concentrazione del detergente dovrebbe essere ben vicina al livello di CMC (almeno 2 volte il CMC) per garantire una concentrazione di micelle sufficiente per solubilizzare le proteine ​​di membrana. Secondo Linke [3], è necessaria almeno una micella per molecola proteica di membrana per imitare sufficientemente l'ambiente lipidico di una membrana (Fig. 1B, D).

La separazione di fase può essere utilizzata per purificare ulteriormente le proteine. Ciò richiede la regolazione della temperatura e delle concentrazioni di sali e detergente nel tampone per far sì che le micelle detergenti si aggregano e si separino dallo strato acquoso. In questo caso le proteine ​​di membrana, circondate dalle micelle, si aggregano con il detergente. La temperatura alla quale la soluzione detergente si separa in due fasi, il punto di intorbidamento, è influenzata dal glicerolo o dai sali nel tampone (es. Triton X-114 ha un punto di intorbidamento di 23°C, ma in presenza di glicerolo al 20%, il punto di intorbidamento scende a 4°C). Questo è molto importante poiché la stabilità di una proteina è influenzata dalle alte temperature.

Un buon detergente dovrebbe essere in grado di lisare le cellule, solubilizzare le proteine ​​ed essere adatto per le applicazioni a valle. Inoltre, dovrebbe essere considerata la proteina solubilizzata in forma nativa o denaturata. Non esiste un detersivo ideale per tutte le applicazioni, e anche nella stessa applicazione il risultato varia (Tabella 3). Pertanto, dopo aver considerato le opzioni, spesso sono necessari tentativi ed errori per trovare il detersivo migliore e una miscela di detersivi può essere ottimale. Inoltre, la preparazione fresca della soluzione di lavoro detergente è solitamente la pratica migliore per evitare l'idrolisi e l'ossidazione.

DetergenteMW (Da) monomeroMW (Da) micelleCMC (mM) 25 o CAggregazione n.Punto di nuvola (o C)Media Peso micellareForzadializzabileApplicazioni
SDS28918,0007-1062>10018,000DuroLisi cellulare, elettroforesi, WB, ibridazione
Tritone X-10062590,0000.2-0.9100-1556580,000MiteNoSaggi immunoenzimatici, IP, solubilizzazione della membrana
CHAPS6156,150610>1006,150MiteIEF, IP
NP-4068090,0000.059 45-50 MiteNoIEF
n-dodecil-β-D-maltoside511 0.1598 50,000 Cristallizzazione delle proteine
Tween-201228 0.06 76 MiteNoWB, ELISA, immunodosaggi enzimatici
Digitonina122970,000<0.560 70,000MiteNoSolubilità della membrana

Le applicazioni a valle richiedono spesso che le concentrazioni di detersivo vengano abbassate o completamente rimosse. Per tali scopi, la cromatografia ad esclusione dimensionale o la dialisi può essere utilizzata se la dimensione della micella è sostanzialmente diversa dalla proteina di interesse o se le micelle sono abbastanza piccole (cioè, alta CMC) da passare attraverso il tubo di dialisi [3]. Altri metodi impiegano l'uso di perline o resine non polari che legano il detergente, composti di inclusione di ciclodestrina [27], cromatografia a scambio ionico o precipitazione di proteine. Tuttavia, il tampone utilizzato dopo la rimozione del detergente deve essere selezionato con attenzione per evitare la precipitazione o l'aggregazione delle proteine.

Labome esamina la letteratura per l'applicazione dei detergenti. Nella tabella seguente sono elencati i principali fornitori, ed il numero di articoli, indicando la maggior parte dei detersivi forniti da MilliporeSigma.

detergente fornitori
Tritone X-100Thermo Fisher [28, 29], Scienze della microscopia elettronica [30], Amresco, JT Baker
Tween-20Bio-Rad [31], MilliporeSigma [29], Thermo Fisher
SDSAmresco, Bio-Rad, Q.BIOgene, MilliporeSigma
NP-40Roche, Millipore Sigma [32]
CHAPSMillipore Sigma, JT Baker
digitoninaMillipore Sigma, Wako
DDMGeneron [33], Anatrace [15]

Thermo Fisher Pierce Triton X-100, ad esempio, BP151 [29] o 85111 [28], è stato utilizzato per lisare campioni di cellule e tessuti per l'immunoistochimica [29] e l'immunocitochimica [28]. MilliporeSigma Triton X-100 è stato utilizzato per lisare le cellule [34] o permeabilizzare le cellule in immunocitochimica [35] e nel tampone bloccante per immunoistochimica [36, 37] e test di protezione della proteinasi K [38].

Tween-20 è comunemente usato nei tamponi di lavaggio, come TBS-Tween (TBS-T) o PBS-Tween (PBT-T), in vari immunodosaggi. MilliporeSigma Tween-20, ad esempio, P1379 [29], è stato utilizzato nei blot di lavaggio [29], negli esperimenti IHC (P1379) [39], nell'immunoprecipitazione [40] e nella PCR multiplex a matrice microfluidica [41] e altri [ 42]. MilliporeSigma Tween-80, è stato utilizzato per sciogliere erlotinib (un farmaco chemioterapico) [43] e come integratore per crescere M. tubercolosi ceppi [44].

Lonza SDS (numero di catalogo 51213) è stato utilizzato nelle preparazioni della cromatina [39]. Amresco SDS è stato utilizzato in SDS-PAGE [45]. Bio-Rad sodio dodecil solfato è stato utilizzato per preparare un tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione [46]. MilliporeSigma-Aldrich SDS è stato utilizzato per preparare tamponi per, tra gli altri, saggi di ottanoilazione in vitro, tampone campione Laemmli, esperimenti 2D-DIGE [47].

Roche NP-40 è stato utilizzato nella lisi cellulare [48, 49]. MilliporeSigma NP-40 è stato utilizzato per preparare il tampone per il test di radioimmunoprecipitazione [46], il tampone per i tamponi di lisi/omogeneizzazione cellulare [50, 51] e il tampone RIPA per il test di immunoprecipitazione [52].

MilliporeSigma CHAPS è stato utilizzato nei tamponi per la cristallizzazione delle proteine ​​[53]. JT Baker CHAPS è stato utilizzato per lisare le cellule per studiare l'interazione virale con la proteina ASF1 umana [54].

MilliporeSigma è stato utilizzato in un esperimento di immunocitochimica per studiare PI4P [55] e utilizzato per eseguire saggi di protezione della proteinasi K [38] e per estrarre RNA [56]. Wako digitonin è stato utilizzato per lisare le cellule [57] ed eseguire esperimenti di immunoprecipitazione [58].

Y Lee et al hanno solubilizzato una proteina GPCR con dodecilmaltoside / DDM da Generon [33]. Anatrace n-decil-beta-D-maltopiranoside è stato utilizzato per la purificazione delle proteine ​​[59, 60] così come il suo n-dodecil-beta-D-maltoside [61] e n-undecil-beta-D-maltoside [62, 63] . Anche il glicon beta-dodecil-maltoside e il beta-decil-maltoside sono stati utilizzati nella purificazione delle proteine ​​[64]. Anatrace n-ottil-beta-glucoside è stato utilizzato nella solubilizzazione delle proteine ​​AQP4 [15].

Silva MC et al hanno utilizzato Brij-35 come detergente per l'analisi del biosensore di interferometria del biostrato [65]. Per la purificazione delle proteine, sono stati utilizzati Affymetrix octyl glucosio neopentil glicole (OGNPG) all'1% [66] e MilliporeSigma colesteril emisuccinato allo 0,1% o 0,05% (p/v) [11, 67]. Per i test relativi alla cromatina, sono stati utilizzati MilliporeSigma-Aldrich sodio desossicolato (numero di catalogo D6750) e Igepal (numero di catalogo I8896) e TEKnova N-lauroylsarcosine (numero di catalogo S3379) [39].


Detergenti per la lisi cellulare e l'estrazione di proteine

I detersivi sono molecole anfipatiche, nel senso che contengono sia una "coda" non polare avente carattere alifatico o aromatico, sia una "testa" polare. Il carattere ionico del gruppo di testa polare costituisce la base per un'ampia classificazione dei detergenti: possono essere ionici (carichi, anionico o cationico), non ionici (non carichi) o zwitterionici (con gruppi carichi sia positivamente che negativamente ma con una carica netta pari a zero ).

Detergenti in soluzione

Come i componenti delle membrane biologiche, i detergenti hanno proprietà di associazione idrofobica come risultato dei loro gruppi di coda non polari. Tuttavia, i detersivi sono essi stessi solubili in acqua. Di conseguenza, le molecole detergenti consentono la dispersione (miscibilità) di composti idrofobici insolubili in acqua in mezzi acquosi, compresa l'estrazione e la solubilizzazione delle proteine ​​di membrana.

I detergenti a bassa concentrazione in soluzione acquosa formano un monostrato all'interfaccia aria-liquido. A concentrazioni più elevate, i monomeri detergenti si aggregano in strutture chiamate micelle. Una micella è un aggregato colloidale termodinamicamente stabile di monomeri detergenti in cui le estremità non polari sono sequestrate verso l'interno, evitando l'esposizione all'acqua, e le estremità polari sono orientate verso l'esterno a contatto con l'acqua.

Struttura idealizzata di una micella detergente.

Sia il numero di monomeri detergenti per micella (numero di aggregazione) che l'intervallo di concentrazione del detergente al di sopra del quale si formano le micelle (chiamata concentrazione micella critica, CMC) sono proprietà specifiche di ciascun detersivo particolare (vedi tabella). La temperatura micella critica (CMT) è la temperatura più bassa alla quale possono formarsi le micelle. Il CMT corrisponde a quello che è noto come punto di intorbidamento poiché le micelle detergenti formano sospensioni cristalline a temperature inferiori al CMT e sono di nuovo limpide a temperature superiori al CMT.

Le proprietà detergenti sono influenzate da condizioni sperimentali quali concentrazione, temperatura, pH tampone e forza ionica e dalla presenza di vari additivi. Ad esempio, la CMC di alcuni detergenti non ionici diminuisce con l'aumentare della temperatura, mentre la CMC di detergenti ionici diminuisce con l'aggiunta di controione a causa della ridotta repulsione elettrostatica tra i gruppi di testa carichi. In altri casi, additivi come l'urea distruggono efficacemente la struttura dell'acqua e causano una diminuzione del CMC del detergente. Generalmente, aumenti drammatici del numero di aggregazione si verificano con l'aumento della forza ionica.

I detergenti possono essere denaturanti o non denaturanti rispetto alla struttura proteica. I detergenti denaturanti possono essere anionici come sodio dodecil solfato (SDS) o cationici come etil trimetil ammonio bromuro. Questi detergenti distruggono totalmente le membrane e denaturano le proteine ​​rompendo le interazioni proteina-proteina. I detergenti non denaturanti possono essere suddivisi in detergenti non ionici come Triton X-100, sali biliari come il colato e detergenti zwitterionici come CHAPS.

Proprietà dei comuni detergenti.

DetergenteTipoAg.#‡MW
mono
(micella)
CMC
mm
(% p/v)
Nube
punto
°C
dializzabile
Thermo Scientific Triton X-100non ionico140647 (90K)0.24 (0.0155)64No
Thermo Scientific Triton X-114non ionico537 ( – )0.21 (0.0113)23No
NP-40non ionico149617 (90K)0.29 (0.0179)80No
Thermo Scientific Brij-35non ionico401225 (49K)0.09 (0.0110)>100No
Thermo Scientific Brij-58non ionico701120 (82K)0.08 (0.0086)>100No
Thermo Scientific Tween 20non ionico1228 ( – )0.06 (0.0074)95No
Thermo Scientific Tween 80non ionico601310 (76K)0.01 (0.0016)No
Ottil glucosidenon ionico27292 (8K)23-24 (

‡Agg.# = Numero di aggregazione, che è il numero di molecole per micella.

Soluzioni detergenti purificate

Sebbene i detersivi siano disponibili da diverse fonti commerciali e utilizzati abitualmente in molti laboratori di ricerca, l'importanza della purezza e della stabilità del detersivo non è ampiamente apprezzata. I detersivi contengono spesso tracce di impurità dalla loro fabbricazione. Alcune di queste impurità, in particolare i perossidi che si trovano nella maggior parte dei detergenti non ionici, distruggono l'attività delle proteine. Inoltre, diversi tipi di detergenti si ossidano facilmente se esposti all'aria o ai raggi UV, facendo perdere loro le proprietà e la potenza come agenti solubilizzanti. Offriamo diversi detergenti di elevata purezza, a basso contenuto di perossido, confezionati sotto azoto gassoso in fiale di vetro trasparente. Queste soluzioni detergenti Thermo Scientific Surfact-Amps offrono convenienza, qualità e uniformità insuperabili per tutte le applicazioni di detersivo. Un kit campionatore include 10 diversi detergenti purificati (sette nel formato Surfact-Amps e tre in forma solida).

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Struttura delle membrane cellulari

A major factor determining the behavior and interaction of molecules in biological samples is their hydrophilicity or hydrophobicity. Most proteins and other molecules with charged or polar functional groups are soluble (or miscible) in water because they participate in the highly ordered, hydrogen-bonded intermolecular structure of water. Some other proteins (or at least parts of proteins), as well as fats and lipids, lack polar or charged functional groups consequently, they are excluded from the ordered interaction of water with other polar molecules and tend to associate together in structures having minimal surface area contact with the polar environment. This association of nonpolar molecules in aqueous solutions is commonly called hydrophobic attraction, although it is more accurately understood as exclusion from the hydrophilic environment.

The formation and stability of biological membranes results in large measure from the hydrophobic attraction of phospholipids, which form bilayer sheets having hydrophobic lipid "tails" oriented within the sheet thickness and polar "head" groups oriented to the outer and inner aqueous environments. Membrane proteins completely span the membrane thickness or are embedded at one side of the membrane in accord with their structure of hydrophobic and hydrophilic amino acid side chains and other functional groups.

Membrane disruption, protein binding and solubilization

Generally, moderate concentrations of mild (i.e., nonionic) detergents compromise the integrity of cell membranes, thereby facilitating lysis of cells and extraction of soluble protein, often in native form. Using certain buffer conditions, various detergents effectively penetrate between the membrane bilayers at concentrations sufficient to form mixed micelles with isolated phospholipids and membrane proteins.

Detergent-based cell lysis. Both denaturing and non-denaturing cell lysis reagents may be used for protein extraction procedures.

Denaturing detergents such as SDS bind to both membrane (hydrophobic) and non-membrane (water-soluble, hydrophilic) proteins at concentrations below the CMC (i.e., as monomers). The reaction is equilibrium driven until saturated. Therefore, the free concentration of monomers determines the detergent concentration. SDS binding is cooperative (i.e., the binding of one molecule of SDS increases the probability that another molecule of SDS will bind to that protein) and alters most proteins into rigid rods whose length is proportional to molecular weight.

Non-denaturing detergents such as Triton X-100 have rigid and bulky nonpolar heads that do not penetrate into water-soluble proteins consequently, they generally do not disrupt native interactions and structures of water-soluble proteins and do not have cooperative binding properties. The main effect of non-denaturing detergents is to associate with hydrophobic parts of membrane proteins, thereby conferring miscibility to them.

At concentrations below the CMC, detergent monomers bind to water-soluble proteins. Above the CMC, binding of detergent to proteins competes with the self-association of detergent molecules into micelles. Consequently, there is effectively no increase in protein-bound detergent monomers with increasing detergent concentration beyond the CMC.

Detergent monomers solubilize membrane proteins by partitioning into the membrane bilayer. With increasing amounts of detergents, membranes undergo various stages of solubilization. The initial stage is lysis or rupture of the membrane. At detergent:membrane lipid molar ratios of 0.1:1 through 1:1, the lipid bilayer usually remains intact but selective extraction of some membrane proteins occurs. Increasing the ratio to 2:1, solubilization of the membrane occurs, resulting in mixed micelles. These include phospholipid–detergent micelles, detergent–protein micelles, and lipid–detergent–protein micelles. At a ratio of 10:1, all native membrane lipid:protein interactions are effectively exchanged for detergent:protein interactions.

The amount of detergent needed for optimal protein extraction depends on the CMC, aggregation number, temperature and nature of the membrane and the detergent. The solubilization buffer should contain sufficient detergent to provide greater than 1 micelle per membrane protein molecule to help ensure that individual protein molecules are isolated in separate micelles.

Detergents used for cell lysis. Major characteristics of denaturing and non-denaturing detergents used for protein extraction.


How Detergents Work

Neither detergents nor soaps accomplish anything except binding to the soil until some mechanical energy or agitation is added into the equation. Swishing the soapy water around allows the soap or detergent to pull the grime away from clothes or dishes and into the larger pool of rinse water. Rinsing washes the detergent and soil away.

Warm or hot water melts fats and oils so that it is easier for the soap or detergent to dissolve the soil and pull it away into the rinse water. Detergents are similar to soap, but they are less likely to form films (soap scum) and are not as affected by the presence of minerals in the water (hard water).


Content Background: How Does an Anabolic Steroid Reach its Target?

Once in the bloodstream, the anabolic steroid travels to all tissues in the body, where it enters the cells to reach its target. In order to get into a muscle cell for example, the steroid must leave the capillary and then enter the muscle cell. This means that the steroid must cross two different types of membranes, the capillary membrane and the muscle cell membrane. To cross the capillary membrane, there are numerous pores or fenestra 1 , which allow small molecules to squeeze through (Figure 3 and see Module 1). However the muscle cell membrane (like most cells in the body) does not have these small pores and therefore the steroid can only cross the membrane by diffusing across or by transport via a carrier protein. Steroids cross the cell membrane by passive diffusion 2 , which occurs in the direction of the concentration gradient – this does not require energy. Passive diffusion depends on the physiochemical characteristics of the membrane and the drug 3 . The muscle cell membrane, like all cell membranes in the body, is a lipid bilayer (Figure 4). It consists of lipids arranged with their polar 4 head groups facing the outside and inside of the cell. The chains of fatty acids face each other, forming the hydrophobic 5 (water-fearing) or non-polar 6 interior. Because anabolic steroids 7 are very lipophilic 8 (lipid-loving), they diffuse easily into the hydrophobic membrane interior. As they concentrate within the hydrophobic membrane interior, a new driving force is generated, pushing the steroid into the cytoplasmic side of the cell membrane. Once the anabolic steroid diffuses into the cytoplasm of the cell, it binds to the androgen receptor 9 (Figure 5). [Receptors for other steroids are found in the nucleus instead of the cytoplasm.] This complex of steroid and protein then crosses the nuclear membrane to enter the nucleus of the cell, where it exerts its effects. In this case, passive diffusion can’t occur because the protein is too large and not lipophilic. Instead, the steroid-receptor complex moves through small pores in the nuclear membrane to enter the nucleus. Although scientists are still elucidating exactly how this occurs, it is possible that the complex interacts with transport proteins that line the nuclear pores. This is an example of facilitated diffusion 10 , which occurs in the direction of the concentration gradient. Therefore, no energy is required. This is unlike active transport 11 , which occurs against the concentration gradient, and requires energy.

Definitions:
1 small spaces or pores within endothelial cells that form the capillary membrane. These pores allow charged drugs or larger drugs to pass through the capillaries.
2 the movement of a solute in its uncharged form to cross a membrane along a concentration gradient. No energy is required.
3 a substance that affects the structure or function of a cell or organism.
4 a chemical property of a substance that indicates an uneven distribution of charge within the molecule. A polar substance or drug mixes well with water but not with organic solvents and lipids. Polar or charged compounds do not cross cell membranes (lipid) very easily.
5 “water-fearing” a compound that is soluble in fat but not water. This is typical of compounds with chains of C atoms.
6 a chemical property of a substance that indicates an even distribution of charge within the molecule. A non-polar or non-charged compound mixes well with organic solvents and lipids but not with water.
7 synthetic versions of testosterone designed to promote muscle growth without producing androgenic effects. The better term is anabolic-androgenic steroid.
8 high lipid solubility. Lipophilic compounds dissolve readily in oil or organic solvent. They exist in an uncharged or non-polar form and cross biological membranes very easily.
9 a protein to which hormones, neurotransmitters and drugs bind. Di solito si trovano sulle membrane cellulari e stimolano una funzione una volta legate.
10 the movement of molecules across a membrane with the concentration gradient. No energy is required, but transport proteins can become saturated, limiting the diffusion process.
11 the movement of molecules against the concentration gradient with the help of a transport protein. This transport requires energy in the form of ATP.

Figura 3 A capillary is composed of endothelial cells that connect together loosely. Small pores or fenestrae are also present, allowing solutes to move in and out of the capillaries.

Figura 4 Schematic view of cell membrane. Lipids are arranged with polar head-groups facing the outside and inside of the cell, while the fatty acid chains form the non-polar (hydrophobic) membrane interior.

Figura 5 Testosterone (or anabolic-androgenic steroids) binds to the androgen receptor in the cytoplasm and the complex moves into the nucleus where it interacts with DNA to initiate protein synthesis.


Detergents

Detergents are critical tools for the study of membrane proteins. They are vital for the isolation and purification of the proteins and are used in the primary solubilization step of reconstitution. They are invaluable in membrane protein recrystallization.

So What are detergents? Detergents are soluble amphiphilic molecules consisting of a polar head group and hydrophobic chain (or tail) and exhibit unique properties in aqueous solutions in which they spontaneously form spherical micellar structures. Membrane proteins are frequently soluble in micelles formed by amphiphilic detergents. Detergents solubilize membrane proteins by creating a mock lipid bilayer environment normally inhabited by the protein.

3 Major Detergent Classifications

    • Ionic Detergents: These have a polar head that can be either anionic or cationic and a hydrophobic chain or tail with a steroidal backbone. They are very efficient at solubilizing proteins, but almost always cause denaturation of the protein to some extent. An example of an ionic detergent is Sodium Dodecyl Sulfate (SDS).

      • Non-Ionic Detergents: These detergents have an uncharged hydrophilic head of either Polyoxyethylene or glycosidic group. It is a relatively mild detergent that solubilizes proteins by breaking the lipid-lipid interactions or lipid-protein interactions. Ionic detergents do not break the protein-protein interactions thereby, the solubilized protein is structurally intact in its biological form. Ionic detergents are effective in isolating active membrane proteins. Examples of Non-Ionic detergents are - n-Octyl-β-D-glucopyranoside (OG) and n-dodecyl-β-D-maltoside(DDM).
      • Zwitterionic Detergents: The polar head groups of zwitterionic detergents have a neutral charge. They have both ionic and non-ionic properties. The strength of action of zwitterionic detergents is intermediate between both ionic and non-ionic detergents.

      Zwitterionic Detergents for Membrane Proteins

      Zwitterionic detergents are efficient at breaking protein-protein interactions and are less harsh than ionic detergents. While zwitterionic detergents break the protein bonds, they are still successful at maintaining the native state and charge of individual proteins.
      Due to their versatility, Zwitterionic detergents are useful in a variety of applications such as:

      • cromatografia
      • Different types of electrophoresis, including 2D gel electrophoresis
      • Mass spectrometry
      • Solubilization of organelles and inclusion bodies.

      Examples of zwitterionic detergents include CHAPS and CHAPSO.

      Synthetic zwitterionic detergents are known as sulfobetaines. This group of substances retain their zwitterionic characteristics over a wide pH range.


      YopN and TyeA Hydrophobic Contacts Required for Regulating Ysc-Yop Type III Secretion Activity by Yersinia pseudotuberculosis

      Yersinia bacteria target Yop effector toxins to the interior of host immune cells by the Ysc-Yop type III secretion system. A YopN-TyeA heterodimer is central to controlling Ysc-Yop targeting activity. A + 1 frameshift event in the 3-prime end of yopN can also produce a singular secreted YopN-TyeA polypeptide that retains some regulatory function even though the C-terminal coding sequence of this YopN differs greatly from wild type. Thus, this YopN C-terminal segment was analyzed for its role in type III secretion control. Bacteria producing YopN truncated after residue 278, or with altered sequence between residues 279 and 287, had lost type III secretion control and function. In contrast, YopN variants with manipulated sequence beyond residue 287 maintained full control and function. Scrutiny of the YopN-TyeA complex structure revealed that residue W279 functioned as a likely hydrophobic contact site with TyeA. Indeed, a YopN W279G mutant lost all ability to bind TyeA. The TyeA residue F8 was also critical for reciprocal YopN binding. Thus, we conclude that specific hydrophobic contacts between opposing YopN and TyeA termini establishes a complex needed for regulating Ysc-Yop activity.

      Parole chiave: bacterial pathogenesis molecular modeling mutagenesis protein secretion protein-protein interaction regulation.

      Cifre

      32 kDa) polypeptide, while the double asterisk ( ** ) reveals the naturally produced and secreted

      42 kDa YopN-TyeA hybrid. The arrows (←) indicate a non-specific protein band recognized by the anti-YopN antiserum and the anti-YopD antiserum. The band appearing just above the nonspecific band in the ΔtyeA strain likely represents a frameshifting event that causes full-length YopN to be fused with the TyeAΔ19−59 deletion remnant resulting in a hybrid product that has a predicted molecular weight of

      38 kDa. Strains: Parent (YopNnativo), YPIII/pIB102 ΔyscU, lcrQ double mutant, YPIII/pIB75-26 ΔyopN null mutant, YPIII/pIB82 ΔtyeA null mutant, YPIII/pIB801a ΔyopN, tyeA double mutant, YPIII/pIB8201a Mutant 1–YopN288(scramble)293, YPIII/pIB8213 Mutant 2–YopN288STOP, YPIII/pIB8212 Mutant 3–YopN279(F+1), 287(F−1), YPIII/pIB8208 Mutant 4–YopN279(F+1), 287STOP, YPIII/pIB8207 Mutant 5–YopN279STOP, YPIII/pIB8209. The theoretical molecular masses predicted from amino acid sequence are given in parentheses.


      How do detergents get in hydrophobic membrane interior? - Biologia

      Detergents are invaluable tools for studying membrane proteins. However, these deceptively simple, amphipathic molecules exhibit complex behavior when they self-associate and interact with other molecules. The phase behavior and assembled structures of detergents are markedly influenced not only by their unique chemical and physical properties but also by concentration, ionic conditions, and the presence of other lipids and proteins. In this minireview, we discuss the various aggregate forms detergents assume and some misconceptions about their structure. The distinction between detergents and the membrane lipids that they may (or may not) replace is emphasized in the most recent high resolution structures of membrane proteins. Detergents are clearly friends and foes, but with the knowledge of how they work, we can use the increasing variety of detergents to our advantage.

      Published, JBC Papers in Press, June 29, 2001, DOI 10.1074/jbc.R100031200

      This minireview will be reprinted in the 2001 Minireview Compendium, which will be available in December, 2001. This is the third article of four in the “Membrane Protein Structural Biology Minireview Series.” Some of the work discussed in this minireview was supported in part by National Institutes of Health Grants P01 GM57323 (to R. M. G. and S. F. M.) and HL56773 (to R. M. G.).

      This minireview is dedicated to Drs. Jacqueline A. Reynolds and the late Martin Zulauf who gave one of us (R. M. G.) invaluable insights into the behavior of detergents.

      To whom correspondence may be addressed. Tel.: 517-355-9724 Fax: 517-353-9334 E-mail: [email protected]

      To whom correspondence may be addressed. Tel.: 517-355-0199 Fax: 517-353-9334 E-mail: [email protected]


      Modeling Protein–Protein and Protein–Nucleic Acid Interactions: Structure, Thermodynamics, and Kinetics

      Huan-Xiang Zhou , . Harianto Tjong , in Annual Reports in Computational Chemistry , 2008

      3.1 Electrostatic contribution

      It is well understood that hydrophobic interactions make favorable contributions to binding. However, the effects of electrostatic interactions are subtle. Neglecting conformational changes, the electrostatic contribution is given by

      where G el is the electrostatic free energy of each subunit (A or B) or the complex (AB), which can be calculated by solving the Poisson–Boltzmann (PB) equation. The subtlety of the electrostatic contribution can be appreciated by decomposing it into two components: the desolvation cost W desol and the solvent-screened interaction energy W int ( Figure 4.2 ). To obtain W desol , the electrostatic solvation energy of each subunit is calculated twice, first by itself and then in the presence of its partner, which has its partial charges zeroed out. The difference in the results between these two calculations gives the desolvation cost for that subunit, and adding the corresponding quantity for its partner gives W desol . The difference between W el and W desol comes from the interactions between the partial charges of the two subunits in the solvent environment.

      Figure 4.2 . Decomposition of the electrostatic contribution to binding affinity into desolvation cost and solvent-screened interaction. Interactions of protein charges with the solvent (represented by shadows around binding molecules) are indicated by outgoing arrows. Upon binding, the binding molecules are desolvated within their interface and charge–charge interactions, as indicated by a double-headed arrow, emerge.

      It is clear that W desol opposes binding. W int will favor binding when the charges on the two subunits have complementary charge distributions, which should be true in general. There W el consists of two opposite components. Whether electrostatic interactions make a net positive or net negative contribution to binding rests on the balance between the two components. In particular, the balance is very sensitive to how the boundary between the protein low dielectric and the solvent high dielectric is precisely specified. As shown on a large number of protein–protein and protein–RNA complexes [16–19] , when the dielectric boundary is chosen as the molecular surface (MS), as is often done in the literature, W desol outweighs W int , leading to net destabilization. However, when the dielectric boundary is switched to the van der Waals (vdW) surface, the situation is reversed and electrostatic stabilization is now predicted.

      How can one then decide on the choice of the dielectric boundary? One possibility is to benchmark PB calculations against explicit-solvent molecular dynamics (MD) simulations. Most of such efforts have been limited to small solute molecules [20–22] . However, it has been shown that the difference between MS and vdW results for electrostatic solvation energies depends on solute size [23] . Therefore parameterization on small solutes (either against explicit-solvent MD results or against experimental data) may not be reliable for calculating electrostatic contributions to protein–protein and protein–nucleic acid binding.

      One can benchmark PB calculations directly against experimental data on protein–protein and protein–nucleic acid binding affinities. Potentially one type of useful data is the dependence of binding affinities on salt concentration. The screening of electrostatic interactions by salts can be captured by the PB equation (it should be mentioned that salts can also specifically bind to proteins and nucleic acids such specific salt effects require special treatment). Unfortunately, it has been found that the screening effects predicted by MS and vdW calculations are essentially identical and thus cannot discriminate between the two choices of the dielectric boundary [16,18] . On the other hand, effects of mutations involving charged or polar residues have been found to have discriminating power, with experimental data favoring the vdW surface as the choice for the dielectric boundary [16–18] . Experimental data for mutational effects on binding affinity continue to accumulate in the literature [24,25] , providing opportunities for comprehensive benchmarking of PB calculation protocols.

      In the literature, the MS is still widely chosen as the dielectric boundary. The difference between this choice and the vdW surface is that, according to the latter protocol, the many crevices in the protein interior are treated as part of the solvent high dielectric. These crevices are not accessible to a spherical solvent used in defining the MS, and hence their being treated as part of the solvent dielectric is perceived as unrealistic or undesirable. However, this perception is open to question. Water molecules can access protein interiors, as demonstrated by many protein X-ray structures with water occupying interior positions, by the observation of positionally disordered water molecules in a hydrophobic cavity of interleukin 1? [26] ( Figure 4.3 ), and by molecular dynamics simulations [27] . In proteins like myoglobin and acetylcholinesterase (featuring a deeply buried active site connected to the exterior only through a narrow gorge), access by small molecules like water, made possible by the dynamics of the proteins, is essential for biological functions. We suggest that the vdW protocol provides a way to account for water access to protein interiors. Failure to account for this important property is perhaps the cause for overprediction of p K a shifts by the MS protocol (which is often “corrected” by increasing the protein dielectric constant to 20). In principle the vdW protocol can be mimicked by the MS protocol with appropriately reduced atomic radii. However, it has been found the precise amount of radius reduction varies from protein to protein and thus mimicking one protocol by the other appears to be a futile exercise [23] . We will come back to the debate between MS and vdW in Section 4.3 .

      Figure 4.3 . The presence of water molecules inside a hydrophobic cavity of interleukin 1?. The cavity is separated from the bulk solution according to the MS criterion but connected to the bulk solution according to the vdW criterion. When the three water molecules are moved from separate positions in the bulk solution to the configurations shown inside the cavity, the MS protocol predicts an increase of 0.9 kcal/mol in electrostatic free energy whereas the vdW protocol predicts a decrease of −2.2 kcal/mol.

      The generalized Born (GB) model has been developed as a fast substitute of the PB equation [28–31] . The GB model can be tailored to match PB results for electrostatic solvation energies obtained by either the MS or the vdW protocol. The errors of GB results in reproducing the PB counterparts are at least of the order of typical mutational effects on binding affinities. Therefore caution should be exercised when applying the GB model to calculate mutational effects.

      There is also progress in the opposite direction, i.e., toward more accurate modeling of electrostatic effects, by accounting for electronic polarization via quantum mechanical treatments [32,33] . Such treatments have not been used to directly predict the effects of mutations on the binding free energy, but it is already clear that electronic polarization can significantly influence electrostatic contributions to binding.

      Comparing PB or GB calculations against experimental data for mutational effects on binding affinity is premised on the assumption that the mutational effects are assumed to be dominated by electrostatic contributions. That is, possible contributions by hydrophobic interactions and by changes of conformational entropy are not taken into consideration.


      Guarda il video: OSMOSI (Dicembre 2022).