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Perché CAS9 non scinde la sequenza CRISPR originale nel genoma batterico?

Perché CAS9 non scinde la sequenza CRISPR originale nel genoma batterico?


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CAS9 è l'endonucleasi RNA-guidata che scinde il DNA come specificato dalla sequenza di RNA e viene utilizzata per colpire i virus che infettano i batteri. Allora perché questa combinazione RNA+endonucleasi non taglia anche le sequenze spaziali CRISPR originali (che hanno anche lo stesso DNA?). È la stessa ragione per cui il genoma batterico è metilato (e quindi protegge dagli enzimi di restrizione)? La metilazione fa anche la differenza per CAS9 come fa per gli enzimi di restrizione?

Questo in realtà era un dubbio chiesto a Eric Lander in questa conferenza.


Non è lo stato di metilazione. Il crRNA non è solo complementare alla sequenza spaziatrice all'interno dell'array CRISPR, ma anche alla sequenza ripetuta che fiancheggia tale spaziatore. L'accoppiamento di basi aggiuntivo dello sgRNA con la ripetizione impedisce una scissione nucleolitica da Cas9. Inoltre, gli array in genere non contengono sequenze PAM.

Qui troverai una bella illustrazione:


La spiegazione relativa alla complementarità dell'impugnatura 5' è vera per i sistemi CRISPR-Cas di tipo III. Nei sistemi di tipo II come Cas9 è richiesto un motivo adiacente protospacer per l'auto-riconoscimento rispetto al non auto-riconoscimento.

PS: Se questa domanda è stata posta a Eric Lander e ovviamente non è stato in grado di rispondere (altrimenti perché la domanda viene posta qui?), allora non sono sorpreso del motivo per cui il suo "Heroes of CRISPR" è così impreciso e travisato.


Sfruttando un'unione precisa delle estremità non omologhe per una cancellazione precisa ed efficiente nell'editing del genoma mediato da CRISPR/Cas9

Molte applicazioni dell'editing del genoma mediato da CRISPR/Cas9 richiedono l'unione delle estremità non omologhe indotta da Cas9 (NHEJ), che si pensava fosse soggetta a errori. Tuttavia, con estremità direttamente legabili, le rotture del doppio filamento del DNA indotte da Cas9 possono essere riparate preferibilmente da NHEJ accurato.

Risultati

Nella riparazione di due rotture adiacenti del doppio filamento indotte da Cas9-gRNA accoppiati in 71 siti genomici, l'accuratezza NHEJ rappresenta circa il 50% degli eventi NHEJ. Questo approccio accoppiato Cas9-gRNA sottovaluta il livello di accurato NHEJ a causa di frequenti inserimenti di modelli + 1, che possono essere evitati dall'orientamento predefinito Watson/Crick dei motivi adiacenti protospacer (PAM). La strategia accoppiata Cas9-gRNA fornisce anche un approccio flessibile e senza reporter per l'analisi di NHEJ sia accurati che mutageni nelle cellule e in vivo, ed è stata convalidata nelle cellule carenti di XRCC4 e nel fegato di topo. A causa delle alte frequenze di delezioni precise della lunghezza definita "3n"-, "3n + 1"- o "3n + 2"-bp, viene utilizzato un NHEJ accurato per migliorare l'efficienza e l'omogeneità dei knockout genici e delle delezioni in-frame mirate . Rispetto a "3n + 1"-bp, "3n + 2"-bp può superare + 1 inserimenti modellati per aumentare la frequenza delle mutazioni fuori quadro. Applicando Cas9-gRNA accoppiati per modificare i domini MDC1 e 53BP1 chiave, siamo in grado di generare delezioni precise e previste per l'analisi funzionale. Infine, un inibitore Plk3 promuove NHEJ con una propensione verso NHEJ accurato, fornendo un approccio chimico per migliorare l'editing del genoma che richiede delezioni precise.

Conclusioni

NHEJ è intrinsecamente accurato nella riparazione delle rotture del doppio filamento del DNA indotte da Cas9 e può essere sfruttato per migliorare l'editing del genoma CRISPR/Cas9 che richiede la cancellazione precisa di una lunghezza definita.


Introduzione

Con l'esplosione di interesse per l'"editing del genoma" derivante dalla dimostrazione che Cas9 agisce come una nucleasi guidata dall'RNA (cioè le sequenze di RNA sono utilizzate per guidare l'attività della nucleasi verso una specifica sequenza di DNA), i ricercatori hanno lavorato instancabilmente per scoprire nuovi modi per manipolare il genoma e l'espressione genica. Questo sforzo ha portato a una serie di nuovi geni e approcci che utilizzano altre nucleasi guidate da RNA, nucleasi guidate dal DNA, fattori di trascrizione sintetici e altre tecniche interessanti. L'ultimo approccio, pubblicato nell'attuale numero di Biologia del genoma [1], utilizza un enzima coinvolto nella riparazione e replicazione del DNA noto come lembo endonucleasi 1 (FEN-1) fuso con l'endonucleasi Fok1. Xu e colleghi [1] hanno dimostrato che questa strategia si traduce in una nucleasi guidata dal DNA che, se iniettata, può causare in modo efficiente grandi delezioni nel genoma del pesce zebra in vivo. Questo rappresenta un nuovo strumento significativo nella casella degli strumenti di modifica del genoma.


1. INTRODUZIONE

I legumi sono la terza più grande famiglia di angiosperme con più di 19.500 specie conosciute appartenenti a 751 generi (Lewis, 2005), inclusa una vasta gamma di colture alimentari che sono importanti fonti di proteine ​​vegetali e aminoacidi essenziali. Anche le leguminose svolgono un ruolo fondamentale nell'agricoltura sostenibile promuovendo la salute del suolo attraverso la fissazione simbiotica dell'azoto e il rilascio di materia organica di alta qualità nei suoli. Nonostante i benefici per la salute e l'importanza ecologica, la produzione di legumi è influenzata da scarsi raccolti. Aumentare il potenziale di resa e l'affidabilità è una sfida complessa che trarrà vantaggio dall'adozione di nuove strategie come la selezione assistita dalla genomica (selezione assistita da marcatori o selezione genomica) e l'allevamento di precisione (editing genetico).

Nell'ultimo decennio sono stati compiuti enormi progressi nel sequenziamento e nell'analisi strutturale dei genomi delle leguminose. Sono state generate bozze di genoma e trascrittomi per più di 35 specie di leguminose (Bauchet et al., 2019). Queste risorse fondamentali stanno facilitando la scoperta e l'impiego di marcatori molecolari nella selezione di tratti complessi e nello sviluppo di cultivar superiori di colture di leguminose da granella (Varshney et al., 2019). Lo stato attuale e le prospettive di applicare strategie avanzate di backcrossing assistito da marcatori, selezione assistita da marcatore e selezione genomica per il miglioramento dei legumi sono stati ampiamente esaminati altrove (Afzal et al., 2020 Jain et al., 2017 Mousavi-Derazmahalleh et al., 2019 Varshney et al., 2015 Varshney et al., 2019). In questa recensione, ci concentriamo sui recenti progressi nella tecnologia di modifica del genoma e sulla sua utilità come strumento di selezione di precisione per il miglioramento delle colture di leguminose.

L'editing genetico si basa sull'uso di nucleasi ingegnerizzate e percorsi di riparazione del DNA cellulare per apportare modifiche precise e mirate al genoma di un organismo. Lo sviluppo di metodologie di editing genetico è iniziato quasi tre decenni fa con la scoperta chiave che specifiche rotture a doppio filamento possono essere introdotte nei cromosomi utilizzando una meganucleasi I-SceI (Rouet et al., 1994). Tuttavia, l'applicazione delle meganucleasi per l'editing genico è stata limitata a causa della bassa frequenza dei siti bersaglio nella maggior parte dei geni. Gli sforzi per sviluppare sistemi di modifica genica efficienti hanno ricevuto un grande impulso con l'introduzione di nucleasi a dita di zinco programmabili (ZFNs Bibikova et al., 2002) e nucleasi effettori simili ad attivatori della trascrizione (TALENs Li et al., 2011 Zhang et al., 2011). Tuttavia, la vera svolta in questa tecnologia rivoluzionaria è arrivata con il successo dell'adattamento della nucleasi Cas9 guidata da RNA sfruttata dal sistema immunitario adattativo a brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) a cluster procariotici di tipo II regolarmente interspaziati per l'editing del genoma nelle cellule eucariotiche (Cong et al., 2013 Mali et al., 2013).


Materiali e metodi

Ceppi e virus del baco da seta

Il ceppo �” di B. mori è stato mantenuto presso il nostro laboratorio e utilizzato in questo studio. Le larve del baco da seta venivano allevate su foglie fresche di gelso in condizioni standard. Le larve del baco da seta sono state inoculate per via orale con il ceppo Chongqing di tipo selvatico (WT) di BmNPV e gli OB sono stati raccolti dall'emolinfa infetta prima che le larve morissero (Dong et al., 2014). Il numero di OB è stato contato utilizzando un'emocitometria Nageotte e conservato a 4ଌ.

Costruzione vettoriale

Le cassette di espressione Cas9 e sgRNA del gene bersaglio cioè-1 sono stati costruiti come descritto nel nostro studio precedente (Dong et al., 2016). Abbiamo selezionato i due siti target del BmNPV cioè-1 gene come siti di editing genetico, che sono stati separati da un segmento di DNA di 299 bp nel genoma BmNPV. Per evitare effetti fuori bersaglio, i siti bersaglio candidati non avevano più di 12 sequenze di corrispondenza prm nel genoma del baco da seta. Dopo singola digestione di pSL1180-IE1-Cas9-Ser-PA da AscI endonucleasi di restrizione, il frammento IE1-Cas9-Ser-PA è stato ligato al vettore pBac[3 × P3 EGFP afm] per ottenere il vettore transgenico della proteina fluorescente verde pBac[IE1-Cas9-Ser-PA-3 × P3 EGFP afm]. Contemporaneamente, i due geni bersaglio sono stati ligati al vettore pSL1180-fa dopo una singola digestione con BglII, che sono stati poi legati a un vettore pBac[3 × P3 DsRed afm] per generare un vettore transgenico di proteina fluorescente rossa per pBac[U6-sgRNA-3 × P3 DsRed afm]. Tutti i primer utilizzati nello studio sono elencati nella tabella supplementare S1 e tutti i vettori costruiti sono stati verificati mediante sequenziamento.

Microiniezione e Screening

I plasmidi donatori pBac[IE1-Cas9-Ser-PA-3 × P3 EGFP afm] e pBac[U6-sgRNA-3 × P3 DsRed afm] sono stati miscelati con il plasmide helper pHA3PIG in un rapporto molare di 1: 1 e iniettato nelle uova del baco da seta nell'embrione, con i siti di iniezione sigillati con colla atossica e quindi posto in un'incubatrice 25ଌ. Le larve sono state raccolte e date in pasto alle falene e le uova del baco da seta G1 sono state incrociate con gli ibridi parentali di G0. Gli individui positivi sono stati selezionati mediante microscopia a fluorescenza stereoscopica. Il DNA genomico è stato estratto dai ceppi transgenici e digerito con HaeIII per una notte a 37ଌ, quindi purificato e autolegato con un frammento ciclizzato. L'amplificazione PCR del prodotto legato è stata eseguita utilizzando primer specifici per trasposone di pBacL e pBacR, e quindi il prodotto amplificato è stato clonato in un vettore di clonazione T. Il sito di inserimento transgenico è stato analizzato mediante sequenziamento.

Saggi di endonucleasi T7 I

Il DNA genomico è stato estratto a diversi tempi di infezione utilizzando a TransTaq Kit ad alta fedeltà della DNA polimerasi (TransGen Biotech, Pechino, Cina) secondo il protocollo del produttore. Il sito bersaglio del genoma BmNPV è stato amplificato con un kit di reagenti PCR (Takara, Dalian, Cina) utilizzando i primer indicati (Tabella supplementare S1). Quindi, i prodotti della PCR sono stati nuovamente ricotti in NEBuffer 2 (NEB, Stati Uniti) utilizzando le seguenti condizioni: 95ଌ per 5 min 95�ଌ a -2ଌ/s 85�ଌ a -0.1ଌ /s tenere a 4ଌ e quindi digerito con T7 endonucleasi I (T7EI) per 30 min a 37ଌ. Dopo la digestione con T7EI, i prodotti sono stati sottoposti a trattamento termico a 60ଌ per 10 min per inattivare l'enzima. Le miscele enzima-DNA sono state sottoposte ad elettroforesi su gel di agarosio al 2%, utilizzando prodotti di PCR senza trattamento con T7EI come controllo negativo. I gel sono stati colorati con bromuro di etidio (EB) e sottoposti a imaging utilizzando un sistema di imaging gel Bio-Rad Gel Doc (Bio-Rad, Stati Uniti) mediante densitometria.

Saggi di sequenza

I prodotti del DNA del genoma BmNPV purificato sono stati ligati in un vettore di clonazione pEASY-T5 Zero (TransGen Biotech, Pechino, Cina) e sequenziati utilizzando primer M13. Tutti i primer utilizzati per rilevare la mutazione del gene bersaglio sono presentati nella tabella supplementare S1.

Saggi fuori target

Per studiare la frequenza dell'editing fuori bersaglio nel genoma del baco da seta, abbiamo valutato la potenziale presenza di siti fuori bersaglio per due sgRNA attraverso gli strumenti di progettazione CRISPR 1 (Naito et al., 2015). Per ogni sgRNA, abbiamo selezionato i primi tre siti con frequenze fuori bersaglio e quindi progettato i primer corrispondenti nel sito bersaglio per l'amplificazione PCR. Il prodotto PCR corrispondente è stato legato al vettore di clonazione pEASY-T5 Zero, quindi sequenziato e allineato con la sequenza del gene bersaglio. Tutti i primer dei siti fuori bersaglio utilizzati in questo studio sono presentati nella tabella supplementare S1.

Analisi di mortalità

Gli OB di BmNPV sono stati purificati da larve malate come descritto in precedenza (Dong et al., 2014). Le larve transgeniche del baco da seta sono state allevate su foglie fresche di gelso in condizioni standard e poi le larve di quarto stadio sono state inoculate con 1 × 10 3 , 1 × 10 4 , 1 × 10 5 , 2 × 10 5 , 1 × 10 6 , 1 × 10 7 e 1 × 10 8 OB/larva. Per dose sono state utilizzate in ogni linea transgenica all'età di 4 larve instar, e ogni dose è stata eseguita in triplicato. Le larve infette sono state allevate individualmente in piastre e monitorate giornalmente fino a quando tutte si sono impupate o sono morte.

Saggio di replicazione quantitativa del DNA in PCR in tempo reale (qPCR)

L'estrazione del DNA genomico seguita da PCR quantitativa è stata eseguita come descritto in precedenza (Dong et al., 2015, 2017). Una curva standard del DNA è stata costruita sulla base del Ct valore del campione di controllo della diluizione seriale, che è stato poi utilizzato per calcolare il numero di copie GP41. Le condizioni di q-PCR erano le seguenti: 95ଌ per 30 s seguite da 40 cicli a 95ଌ per 5 s, 60ଌ per 20 s e utilizzando 1 μM di ciascun primer. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.

PCR a trascrizione inversa (RT-PCR)

L'RNA totale è stato isolato da ciascuna linea transgenica a 0, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 ore dopo l'inoculazione con BmNPV e i corrispondenti cDNA sono stati sintetizzati secondo il protocollo del produttore (OMEGA, Stati Uniti). L'analisi RT-PCR è stata eseguita con SYBR Select Master Mix Reagent (Bio-Rad, Stati Uniti) utilizzando primer specifici per il cioè-1, vp39, e poli geni (Tabella supplementare S1). Il B.mori sw22934 gene è stato utilizzato come controllo. Le condizioni di RT-PCR erano le seguenti: 95ଌ per 30 s seguite da 40 cicli a 95ଌ per 5 s e 60ଌ per 20 s, utilizzando 1 M di ciascun primer. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato.

Analisi delle caratteristiche economiche

Sono state ottenute quattro linee ibride transgeniche, ovvero Cas9(-)/sgRNA(-), Cas9(+)/sgRNA(-), Cas9(+)/sgRNA(-) e Cas9(+)/sg RNA(+) da Cas9 e ibridazione di linee transgeniche di sgRNA. Ciascun ceppo transgenico è stato sottoposto a screening in triplicato, con ogni replica costituita da 30 larve a vari stadi di sviluppo, dall'inizio del quarto stadio fino alla pupa. È stato calcolato il peso medio delle larve per ogni stadio di sviluppo. Un totale di 30 bozzoli di ciascun ceppo è stato selezionato casualmente prima della fase di falena, sono stati analizzati il ​​volume totale del bozzolo e la dimensione del bozzolo ed è stato calcolato il tasso di guscio del bozzolo. Ogni linea transgenica è stata determinata mediante la media di tre repliche indipendenti.

Analisi statistica

Tutte le linee transgeniche sono state vagliate in triplicato, con ciascuna replica costituita da 30 larve. Tutti i dati sono stati espressi come media ± DS di tre esperimenti indipendenti. Le analisi statistiche sono state eseguite con lo Student’s T-test utilizzando GraphPad Prism 5. Differenze con P < 0,01 sono stati considerati statisticamente significativi.


Approcci per progettare piante resistenti alle malattie con le tecnologie CRISPR

I recenti progressi nella tecnologia CRISPR hanno consentito agli scienziati di sviluppare un'ampia gamma di varianti CRISPR con diverse applicazioni, comprese le modifiche sopra descritte. In questa sezione, ci concentriamo sulle applicazioni CRISPR che sono state utilizzate con successo per progettare piante resistenti alle malattie.

Interruzione genica tramite indel nelle sequenze codificanti

Questa è l'applicazione più comune del sistema CRISPR-Cas9. Sfrutta il comportamento soggetto a errori del meccanismo cellulare di riparazione del DNA NHEJ. Il risultato è un inserimento o delezione (indel) di uno o più nucleotidi nel sito guidato da sgRNA, che introduce una mutazione frameshift e interrompe la produzione genica (Fig. 1). Questa tecnologia è stata utilizzata in diverse colture, inclusi cereali essenziali come riso e frumento, per introdurre tratti di interesse [28]. Nel contesto della resistenza alle malattie, questa tecnologia è stata utilizzata per ingegnerizzare la resistenza interrompendo la suscettibilità delle piante (S), che altera l'interazione pianta-patogeno, portando a una ridotta fitness del patogeno sulla pianta ospite [45]. Un esempio notevole di questa applicazione è stato l'uso di CRISPR-Cas9 per introdurre indel che influenzano le proteine ​​4E del fattore di iniziazione della traduzione eucariotica (eIF4Es), che ha indotto con successo la resistenza contro più virus a RNA in Arabidopsis e cetriolo (Cucumis sativus) [46, 47].

Applicazione di tecnologie basate su CRISPR/Cas per la progettazione di piante resistenti alle malattie. La tecnologia CRISPR, più ampiamente con Cas9, può essere applicata per ottenere una precisa modifica del genoma del genoma della pianta per sviluppare resistenza contro vari agenti patogeni. CRISPR/Cas9 può essere utilizzato per interrompere la suscettibilità delle piante (S) geni mirando a regioni codificanti per eliminare questi geni o per alterare sequenze di regioni promotrici (ad esempio, il sito di legame dell'effettore del promotore del patogeno), precludendo il legame dell'effettore del patogeno al promotore e quindi interrompendo la suscettibilità della pianta. Inoltre, la capacità di eseguire il targeting multiplex mediato da Cas9 può facilitare la delezione cromosomica di S cluster di geni, generando resistenza a lungo termine al patogeno bersaglio. La riparazione diretta dall'omologia (HDR) mediata da Cas9 può essere utilizzata per introdurre resistenza (R) geni contro i patogeni nei casi in cui l'interazione pianta-patogeno (e S geni) non è ben studiato. Per sviluppare la resistenza ai patogeni senza interrompere o sostituire interi geni, è possibile applicare editor di base o tecnologia Cas9 (tramite evoluzione sintetica diretta sotto la pressione selettiva biotica) per ottenere mutazioni specifiche (biomimazione) o evoluzione di geni resistenti ai patogeni di interesse. Oltre a utilizzare le tecnologie CRISPR per l'ingegneria del genoma vegetale per sviluppare piante resistenti alle malattie, la funzione nativa di CRISPR può essere imitata per mirare direttamente e interferire con i genomi dei patogeni di interesse senza influenzare il genoma della pianta. Ad esempio, CRISPR può interferire con i genomi del DNA di agenti patogeni, come i virus del DNA, attraverso sistemi CRISPR mirati al DNA, incluso Cas9. I sistemi CRISPR possono anche essere utilizzati per mirare e distruggere i genomi dell'RNA del patogeno (o la trascrizione dell'RNA dei patogeni con i genomi del DNA) attraverso i sistemi CRISPR mirati all'RNA, come Cas13 e FnCas9

Interruzione genica tramite indel nelle regioni promotrici

Un approccio simile può essere utilizzato per introdurre indel nella regione del promotore invece della regione codificante di un gene vegetale. L'editing del promotore mediato da CRISPR può essere applicato in due modi: per interrompere la sequenza del promotore, con l'obiettivo di bloccare completamente l'espressione genica, o per interrompere un sito di legame effettore, con l'obiettivo di interrompere la suscettibilità della pianta impedendo a un effettore patogeno di legarsi a il promotore. Quest'ultimo approccio è stato utilizzato per modificare il promotore del gene trasportatore dello zucchero di riso OsSWEET14, interrompendo la connessione con l'effettore di un batterio patogeno della peronospora e portando così alla resistenza alla peronospora (Fig. 1) [48,49,50,51]. Oltre all'editing del promotore, è stato dimostrato che CRISPR altera la regolazione genica prendendo di mira le regioni open reading frame (ORF) a monte e l'editing cis-elementi normativi [52].

Delezione genica tramite sgRNA multiplex

Nei sistemi CRISPR, è possibile utilizzare più sgRNA per introdurre più DSB in posizioni precise nel genoma bersaglio. Ad esempio, due sgRNA che si legano prima del codone di inizio e dopo il codone di arresto del gene di interesse produrranno DSB nelle rispettive posizioni. Questi DSB determinano quindi la rimozione del frammento di DNA contenente il gene di interesse, prima che il meccanismo di riparazione cellulare NHEJ ripari i DSB. Poiché gli sgRNA possono essere progettati in qualsiasi regione genomica contenente un'appropriata sequenza trinucleotidica PAM, questo approccio può essere ed è stato utilizzato per eliminare grandi frammenti cromosomici e singoli geni [53, 54]. Ciò è ulteriormente facilitato dallo sviluppo di un Cas9 progettato razionalmente, SpCas9-NG, in grado di riconoscere NG PAM, una stringenza rilassata rispetto ai tipici NGG PAM [55]. Nel contesto della resistenza ai patogeni ingegnerizzati, i cluster di geni rendono questo approccio particolarmente utile. In S cluster di geni, dove multipli S i geni risiedono in posizioni cromosomiche adiacenti [56], è probabile che l'eliminazione del frammento cromosomico generi una resistenza a lungo termine al patogeno bersaglio (Fig. 1).

Inserimento genico tramite riparazione diretta per omologia

Le suddette tecniche CRISPR possono essere utilizzate per generare resistenza alle malattie attraverso l'alterazione di S gene(i). Tuttavia, tutte le proteine ​​vegetali, compresi i prodotti di S geni, sono importanti e per lo più multifunzionali, l'interruzione di queste proteine ​​comporta quindi costi per la salute e/o la produttività delle piante. Ci sono approcci alternativi, come il suddetto cis-modifica dell'elemento regolatore e del promotore, per alterare l'espressione genica invece della distruzione genica, ma spesso è necessario utilizzare la resistenza (R) geni contro i patogeni nei casi in cui l'interazione pianta-patogeno non è ben studiata, e la S geni non sono stati ampiamente esplorati. In tali casi, il toolkit CRISPR può essere utilizzato per R inserimento genico.

L'inserimento del gene mediato da CRISPR funziona tramite un percorso alternativo che opera dopo che Cas9 ha prodotto il DSB dettato da sgRNA, questo percorso utilizza l'HDR cellulare, piuttosto che il macchinario NHEJ. Un frammento di consegna, contenente an R gene circondato da sequenza omologa alle estremità DSB, è integrato con Cas9 e gli sgRNA. Questa cassetta guida l'inserimento mediato da HDR del R gene tra i due siti DSB (Fig. 1). Questa strategia è stata utilizzata per introdurre uno o più geni in precise posizioni genomiche [57]. Tuttavia, l'efficienza dell'HDR nelle piante è molto bassa [58], e sebbene siano in fase di sviluppo nuove strategie per migliorarla, attualmente, ciò rende l'inserimento genico nelle piante difficile da implementare [59].

Oltre a generare resistenza alle malattie, l'inserimento del gene mediato da CRISPR può essere utilizzato per studiare importanti S funzioni geniche. Per dimostrarlo, Wang et al. ha utilizzato l'HDR nel riso per incorporare la proteina fluorescente verde (GFP) fusa nel frame con i loci della glutatione S-transferasi [60]. Questa applicazione ha il potenziale per essere utilizzata nello studio S funzioni geniche, come la localizzazione delle proteine ​​e la regolazione spaziotemporale di S espressione genica. Le proteine ​​ospiti che giocano un ruolo chiave nella patogenicità possono essere etichettate con GFP direttamente nel genoma per studiarne l'espressione e la localizzazione durante l'infezione. Tuttavia, tali modifiche proteiche possono alterare la loro espressione e localizzazione, dimostrando i limiti di questo approccio.

Biomimazione tramite promotore, allele o sostituzione genica

Le preoccupazioni relative all'introduzione di DNA estraneo nei prodotti delle colture indicano che è probabile che l'uso di CRISPR per l'inserimento dei geni sia soggetto a lunghi processi normativi e potenzialmente al rifiuto dei consumatori. Per superare questa sfida, CRISPR offre un approccio alternativo che funziona sul principio della biomimazione. È noto da decenni che le specie autoctone e i parenti selvatici delle colture coltivate costituiscono un ricco pool genetico, in particolare per la resistenza agli stress biotici e abiotici [61]. Diversi studi recenti ne hanno individuati molti R geni nei parenti selvatici delle specie coltivate e hanno dimostrato il successo del trasferimento della resistenza attraverso l'identificazione di an R gene e il suo trasferimento alle specie coltivate [62, 63]. CRISPR può essere utilizzato per sostituire il difettoso o poco performante R gene in una varietà di colture coltivate con il funzionale R gene da una varietà nativa resistente alle malattie tramite metodologia HDR multiplex.

La biomimazione si riferisce qui all'introduzione di mutazioni mediate da CRISPR in modo tale che la sequenza del gene bersaglio venga convertita nella sequenza di una varietà resistente alla malattia. Quindi, invece di sostituire l'intero gene, il ricercatore introduce solo le mutazioni specifiche associate al tratto di resistenza alla malattia, assumendo che le differenze nucleotidiche tra il gene di interesse nelle varietà coltivate e selvatiche non siano altrimenti significative per la vitalità e la produttività delle piante (Fig. .1). Ciò è stato ottenuto principalmente utilizzando un sistema CRISPR progettato per la modifica mirata dei nucleotidi. Una fusione di una Cas9 o nickasi nucleasi-morta con citidina deaminasi può indirizzare la mutagenesi puntiforme con elevata precisione e questo approccio è stato utilizzato con successo in diverse specie per la modificazione genica [64]. Lo stesso approccio è stato utilizzato per introdurre la sostituzione N176K codificata dall'allele di resistenza al virus eIF4E (eIF4E1) di Pisum sativum nel Arabidopsis EIF4E1 gene da generare Arabidopsis piante resistenti a Virus della vena gialla del trifoglio (ClYVV) [65]. Studi recenti hanno stabilito l'uso dell'evoluzione sintetica diretta per evolvere varianti geniche resistenti agli inibitori dello splicing e agli erbicidi [66,67,68]. Lo stesso approccio può essere utilizzato sotto la pressione selettiva biotica per evolvere varianti geniche che conferiscono resistenza a patogeni selezionati.


Conclusioni

CRISPR-cas è senza dubbio una delle invenzioni più ingegnose del 21° secolo. Ha già cambiato il modo in cui facciamo scienza ed è emozionante pensare a tutte le possibilità che potrebbe portare in futuro. Molto è stato fatto nei primi cinque anni di sviluppo di CRISPR-cas. Molti miglioramenti e modifiche hanno reso possibile ai gruppi di ricerca di tutto il mondo di utilizzare i sistemi CRISPR-cas per modificare i geni di alcuni dei più frequenti NMGD, sia in vitro e in vivo. Le loro realizzazioni sono davvero notevoli e stimolanti nell'aprire un nuovo orizzonte di speranza per i pazienti. Di tutti i NMGD affrontati qui, il DMD è probabilmente il primo a raggiungere la clinica in un momento poco chiaro in futuro, se tutti gli ostacoli vengono superati.

Detto questo, all'attuale livello di sviluppo, non ci sono prove sufficienti per il passaggio di CRISPR-cas a studi clinici per il trattamento di NMGD nel prossimo futuro. Ci sono ancora molte questioni da considerare prima di tentare l'uso di CRISPR-cas9 nei pazienti. Nel complesso, dovremmo superare tre ostacoli principali: efficacia, sicurezza e consegna. L'efficacia di CRISPR-cas è variabile, mentre il controllo sui suoi componenti, il dosaggio, il metabolismo e gli effetti a lungo termine in vivo poco chiaro. Sebbene gli eventi fuori bersaglio sembrino apparire in rare occasioni, questa rimane ancora una domanda aperta: la maggior parte degli studi non ha valutato l'intero genoma per la mutagenesi. Inoltre, alcuni degli autori che hanno effettuato l'analisi dell'intero genoma riportano un leggero aumento degli indel nelle aree adiacenti alle sequenze di targeting. Infine, la consegna rimane un'importante difficoltà da esplorare e risolvere. I vettori virali sembrano essere tradizionalmente favoriti per la loro efficienza e livello di indagine, mentre i sistemi di somministrazione non virali sembrano aver appena iniziato il loro viaggio verso la scoperta.

Lo sviluppo di un trattamento CRISPR-cas solleva già alcune complesse preoccupazioni etiche che devono essere affrontate e prese in considerazione durante la progettazione di studi sia preclinici che clinici. Sono necessari grandi sforzi da parte di numerose parti interessate all'interno della società per il beneficio ottimale degli individui che soffrono di queste malattie neurologiche rare e monogeniche.


Prime Editing come nuovo strumento CRISPR per migliorare precisione e versatilità

Prime Editing come nuovo strumento CRISPR per migliorare precisione e versatilità

Reporter: Stephen J. Williams, PhD

CRISPR è diventato un potente strumento molecolare per l'editing dei genomi nella ricerca, nella scoperta di farmaci e nella clinica

(vedi post ed ebook su questo sito sotto )

tuttavia, come discusso su questo sito

( vedi i post sotto )

ci sono stati molti casi di effetti fuori bersaglio in cui i geni, diversi dal bersaglio selezionato, sono stati eliminati. Questo problema "fuori bersaglio" ha ostacolato gran parte dell'utilità di CRISPR nella terapia genica e nella terapia CART

Tuttavia, un articolo in Scienza di Jon Cohen spiega a Natura la scoperta della carta di un nuovo strumento nell'arsenale CRISPR chiamato editing principale, inteso ad aumentare la specificità di CRISPR e le capacità di editing di precisione.

IL PRIME EDITING PROMETTE DI ESSERE UN TAGLIO SOPRA CRISPR

Di Jon Cohen | 25 ottobre 2019

Primo la modifica promette di essere una spanna sopra CRISPR Jon Cohen CRISPR, un genoma straordinariamente potente-la modifica strumento inventato nel 2012, può ancora essere goffo. … Primo la modifica aggira le carenze di entrambe le tecniche modificando pesantemente la proteina Cas9 e l'RNA guida. … ” Primo la modifica "Potrebbe diventare il modo in cui le mutazioni che causano malattie vengono riparate", dice.

Lo sforzo, guidato dai dott. David Liu e Andrew Anzalone del Broad Institute (Cambridge, MA), si basano sulla modifica della proteina Cas9 e dell'RNA guida, in modo che ci sia solo un nick in un singolo filamento della doppia elica. Il canonico Cas9 taglia entrambi i filamenti di DNA e quindi si basa su un'efficace attività di riparazione del gap della cellula. La seconda parte, un nuovo tipo di RNA guida chiamato pegRNA, contiene uno stampo di RNA per una nuova sequenza di DNA da aggiungere nella posizione target. Questa sintesi diretta da pegRNA del nuovo modello richiede l'attacco di un enzima della trascrittasi inversa al Cas9. Finora Liu e i suoi colleghi hanno testato la tecnologia su oltre 175 linee cellulari umane e di roditori con grande successo. Inoltre, avevano anche corretto le mutazioni che causano la malattia di Tay Sachs, cosa che i precedenti sistemi CRISPR non potevano fare. Liu sostiene che questa tecnologia potrebbe correggere oltre l'89% delle varianti patogene nelle malattie umane.

Da questo sforzo è stata costituita una società Prime Medicine.

Leggi un articolo sul Dr. Liu, il primo editing e le aziende che il Dr. Liu ha avviato, tra cui Editas Medicine, Beam Therapeutics e Prime Medicine su https://www.statnews.com/2019/11/06/questions-david -liu-crispr-prime-editing-risposte/

Come è stato annunciato, l'editing principale per le terapie umane sarà sviluppato congiuntamente da Prime Medicine e Beam Therapeutics, ciascuna incentrata su diversi tipi di modifiche e obiettivi di malattia distinti, che aiuteranno a evitare la ridondanza e ci consentiranno di coprire più territorio della malattia in generale. Le aziende condivideranno anche le conoscenze nell'editing principale e nelle tecnologie di accompagnamento, come la consegna e la produzione.

Lettore di StatNews.: Puoi confrontare i pro ei contro dell'editing principale con l'editing di base?

La prima differenza tra l'editing di base e l'editing di base è che l'editing di base è stato ampiamente utilizzato negli ultimi 3 anni e mezzo in organismi che vanno dai batteri alle piante, dai topi ai primati. Addgene mi dice che i progetti del DNA per gli editor di base del nostro laboratorio sono stati distribuiti più di 7.500 volte a più di 1.000 ricercatori in tutto il mondo e sono stati pubblicati più di 100 documenti di ricerca da molti laboratori diversi utilizzando editor di base per ottenere le modifiche genetiche desiderate per un'ampia varietà di applicazioni. Sebbene siamo molto entusiasti dell'editing principale, è nuovo di zecca e finora è stato pubblicato solo un documento. Quindi c'è molto da fare prima di poter sapere se l'editing principale si rivelerà generale e robusto come si è dimostrato l'editing di base.

Abbiamo confrontato direttamente gli editor prime e gli editor di base nel nostro studio e abbiamo scoperto che gli attuali editor di base possono offrire una maggiore efficienza di editing e meno sottoprodotti indel rispetto agli editor prime, mentre gli editor prime offrono una maggiore flessibilità di targeting e una maggiore precisione di editing. Quindi, quando la modifica desiderata è una mutazione del punto di transizione (da C a T, da T a C, da A a G o da G a A) e la base di destinazione è ben posizionata per la modifica di base (ovvero, esiste una sequenza PAM approssimativamente 15 basi dal sito di destinazione), quindi la modifica della base può comportare una maggiore efficienza di modifica e un minor numero di sottoprodotti. When the target base is not well-positioned for base editing, or when other “bystander” C or A bases are nearby that must not be edited, then prime editing offers major advantages since it does not require a precisely positioned PAM sequence and is a true “search-and-replace” editing capability, with no possibility of unwanted bystander editing at neighboring bases.

Of course, for classes of mutations other than the four types of point mutations that base editors can make, such as insertions, deletions, and the eight other kinds of point mutations, to our knowledge prime editing is currently the only approach that can make these mutations in human cells without requiring double-stranded DNA cuts or separate DNA templates.

Nucleases (such as the zinc-finger nucleases, TALE nucleases, and the original CRISPR-Cas9), base editors, and prime editors each have complementary strengths and weaknesses, just as scissors, pencils, and word processors each have unique and useful roles. All three classes of editing agents already have or will have roles in basic research and in applications such as human therapeutics and agriculture.

Nature Paper on Prime Editing CRISPR

Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA (6)

Andrew V. Anzalone, Peyton B. Randolph, Jessie R. Davis, Alexander A. Sousa,

Luke W. Koblan, Jonathan M. Levy, Peter J. Chen, Christopher Wilson,

Gregory A. Newby, Aditya Raguram & David R. Liu

Natura volume 576, pages149–157(2019)


Startup CRISPR Firm Caspr Biotech Developing COVID Dx Using New Extremophile Bacteria Nuclease

NEW YORK – A startup company called Caspr Biotech is aiming to prove the utility of nucleases from extremophile organisms in CRISPR-based diagnostics by developing a testing platform that would be within reach of countries with limited resources.

The ambitious vision of the Buenos Aires- and San Francisco-based firm collided at the beginning of 2020 with the COVID-19 pandemic, giving Cofounder and CEO Franco Goytia and his colleagues a chance to put a product on the market much sooner than they were anticipating. With it, Caspr looks to compete with CRISPR companies like Sherlock Biosciences and Mammoth Biosciences while making the next generation of precision molecular diagnostics accessible to more people worldwide.

Goytia and two collaborators founded the company at the beginning of 2019 in Argentina to use CRISPR for epigenetic reprogramming applications, but eventually shifted their focus to CRISPR-based molecular diagnostics.

The firm raised pre-seed funding from an investor in Argentina, and also received investments from IndieBio, Grid Exponential, and Paul McEwan, the former cofounder and CSO of Kapa Biosystems. The nearly $3 million in total funding allowed Caspr to establish an office in San Francisco and start fleshing out its vision out into an actual product line.

A new kind of Cas12

But before the company could start developing a CRISPR-based diagnostic, it had to decide on which Cas enzyme to use — and that was the first problem.

"We initially tried to approach the foundational universities or institutions — UC Berkeley, the Broad Institute — for licensing possibilities and had no success, even though we tried to narrow the scope of a territory or a particular application," Goytia said. "They were quite restrictive in terms of the access for the technology."

Because the freedom to operate as they wanted was important to Goytia and his colleagues, they decided on a strategy of biodiscovery to find their own novel nucleases for which they could file patents and get intellectual property protection. That strategy began by researching publicly available metagenomics databases like the NCBI's. This helped the researchers generate a hypothesis that they could find novel microorganisms within extreme environments that might contain novel CRISPR systems with differential activities that could be useful for diagnostics.

Since 2019, they've been collaborating with research groups working in extreme environments, accessing unpublished metagenomic data from, for instance, Antarctica or the South American Puna grassland and salt desert ecoregion, Goytia said, even taking expeditions to La Puna, staying with the native communities, and immersing themselves in the environment.

This immersion and respect for the native communities is an important part of the company's bioprospecting strategy, Goytia said. The firm has signed onto the Nagoya Protocol on Access to Genetic Resources and the Fair and Equitable Sharing of Benefits Arising from their Utilization to the Convention on Biological Diversity, an international agreement which aims to fairly share the benefits from the utilization of genetic resources. More than 100 countries have signed the protocol, though the US isn't one of them.

The protocol aids in the "fair prospecting and commercialization of components which are based out of genetic material of a particular environment," Goytia said. "So, from these communities, we take just a scoop of a lake or a scoop of soil or a scoop from a particular environment, and we can generate a source of income. And on that source of income, that can be something that goes back to the original communities, in part."

The biodiscovery strategy has uncovered several new nucleases that the firm's researchers are now characterizing for possible use in future diagnostics. For example, they've found enzymes that were expected to only cut DNA but also had nonspecific kinetic activity for RNA, Goytia said. They've also found enzymes that are similar to Cas9, Cas12, Cas13, and Cas14, but have less than 50 percent — in some cases, less than 30 percent — sequence identity with those more familiar nucleases.

"Also, we characterize novel functionality or differential functionality when compared to the previously disclosed or discovered enzymes from other [research] groups," he added.

When they do find enzymes that aren't the best fit for diagnostics purposes — enzymes that might better be used for therapeutics, for example — Caspr reaches out to other firms to see if there are possibilities for partnerships to make the best use of those nucleases.

Importantly, Caspr's La Puna expeditions yielded what Goytia and his colleagues are hoping will be the nuclease that puts the company on the map — a Cas12 enzyme that they've integrated into the COVID-19 assay that will likely be the company's first product to market, the Caspr Lyo-CRISPR SARS-CoV-2 Kit.

For now, Goytia isn't saying much about how this Cas12 works or how it's different from current commercially available Cas12 enzymes that would fall under Broad or UC Berkeley IP protection, except that it has about a 50 percent sequence identity with more familiar Cas12 enzymes. The nuclease also has differential activity at room temperature, allowing for Lyo-CRISPR kit to be transported and performed at room temperature. The enzyme can also be lyophilized into beads.

The company is preparing three scientific papers for publication in the next couple of months that will contain more details about the enzyme itself. Caspr has also applied for Emergency Use Authorization from the US Food and Drug Authorization and has submitted parallel regulatory applications in other regions and countries for the Lyo-CRISPR kit using its novel nuclease, and expects to receive approval in the coming weeks.

A platform approach

In the meantime, though, the company is also refining its platform technology, which is what it was developing before the COVID pandemic grabbed the world's attention.

"Since the very origin of Caspr, we've had this platform approach to molecular detection. That includes the applications within infectious diseases in healthcare, but also doing validations beyond healthcare for applications in agriculture or farming, for example," Goytia said. "This, in part, comes from the ease of reprograming or reconfiguration that CRISPR brings by tailoring the RNA guide of our system."

Throughout 2019, the company validated its technology on 12 to 15 different targets, including tropical viruses like Dengue and Zika, endemic viruses like hantavirus, so-called bacterial superbugs, and antimicrobial resistance genes. The work was done in what Caspr thought was preparation for the commercialization and production of a variety of diagnostics.

In fact, Caspr researcher Carla Gimenez, along with collaborators in Argentina, published a study in Emerging Microbes and Infections in June showing the validations they did in 2019 using the firm's platform for detection of emerging infectious diseases.

In that paper, they used a commercially available Cas12a (Lba Cas12a). Taking advantage of Cas12a's reported unspecific single-stranded DNAse activity upon target recognition, they coupled the enzyme with an ssDNA reporter, generating a fast, accurate, and ultrasensitive molecular detection method. Further, they demonstrated that Cas12a was able to detect DNA target sequences corresponding to carbapenemase resistance genes such as KPC, NDM, and OXA. And with the addition of a reverse-transcription step, the researchers were able to detect viral RNA sequences from dengue, Zika, and hantavirus genomes.

In all cases, the assay run time was less than two hours, at attomolar levels of detection. The resulting use of Cas12a to detect both DNA and RNA targets made it an appropriate and convenient tool to detect all types of pathogens, they wrote.

As COVID emerged, the researchers quickly performed initial validations and set a more aggressive timeline to fully develop a prototype assay that they could take to the FDA for EUA, and also manufacture at scale.

Gimenez and two Argentinian colleagues published a proof-of-concept paper on the BioRxiv preprint server showing a similar approach for the COVID assay as they had for the overall infectious disease platform.

They again used a commercially available Cas12a enzyme (LbCas12a), but showed that their test was characterized by a limit of detection lower than the minimum levels needed to detect the virus in clinical samples for most commercially available tests. They also pointed to the CRISPR diagnostic's portability and low cost as advantages compared to many PCR-based tests.

"As of July 2020, we're on the track to [achieving] our initial objectives in the sense that we have developed what we call the Lyo-CRISPR SARS-CoV-2 Kit, which is based out of a lyophilized format of isothermal amplification combined with our CRISPR detection through our Cas12 enzyme," Goytia added. "And given this lyophilized presentation and the accessibility of CRISPR, it allows for detection with minimal external equipment — a heat block, a fluorescent plate reader."

Making it accessible

The fact that the equipment can be transported at room temperature is one of the assay's most important features, Goytia said, given that the company is looking to deploy its diagnostics in resource-limited regions.

Even though the firm hasn't yet received EUA for the Lyo-CRISPR kit, it's already working with several early-access partners to validate the assay, both on the clinical side and on the workflow side, to compare the CRISPR-based process to qPCR workflows.

"Those results that we've been getting from those partners in the US, in Canada, in South America, in Africa, they have been very, very good," Goytia said. "From our initial clinical validations of 30 positive and 30 negative [samples] of extracted RNA, we had 100 percent sensitivity and specificity. And now having processed more than 300 samples from our external partners on their own, that degree of sensitivity and specificity remains at that very, very high standard of over 99 percent for those two variables."

He added that those validations were done on RNA extracted from nasopharyngeal or nasal swabs from COVID patients.

Importantly, the assay's simplified workflow allows for results to be obtained in less than 60 minutes, and Goytia estimated that the test will cost about $10 to $15 per patient. The improvement of both time and cost as compared to PCR-based tests is why Caspr believes its tests will be more accessible than those of its competitors.

"We're trying to take our cost of production and our price point lower and lower," Goytia added. "We believe that within the next one year, as we shift a lot of the production of many these components internally, our price point on a per-patient basis could be even much lower." Between the possibility of a lower price point and the fact that real-world validations have proven robust with a variety of RNA extraction workflows and diverse lab operations, the company is hoping to "turn this into millions of tests in the second half of this year," he said.

The CRISPR diagnostic landscape shapes up

Assuming the Lyo-CRISPR kit receives FDA EUA, it would have to be performed in laboratories rather than at the point of care, because it requires an RNA extraction step. However, it can be used in low-complexity labs or facilities, with minimal capital expenditures.

Caspr is following a familiar pattern for CRISPR-based diagnostics companies this year: it's at least the third firm in the past couple of months that's used COVID to develop a smaller, single-use version of a larger, multiplex, or more complex future diagnostic platform. Caspr's Lyo-CRISPR kit fits neatly into the competitive landscape, alongside Sherlock Bio's test for use in CLIA labs (until now, the only CRISPR-based test to receive FDA EUA), its planned point-of-care test in partnership with Binx Health, and Mammoth Bio's planned CRISPR-based SARS-CoV-2 diagnostic test, which it's developing in partnership with the consumer healthcare arm of GlaxoSmithKline for use by consumers at home and in clinics.

But the COVID tests are only the beginning of what Sherlock Bio and Mammoth Bio have planned. Sherlock Bio and Binx are already in talks to develop a multiplex assay that includes several viruses, such as SARS-CoV-2 and influenza. The company is also continuing to develop its own at-home SARS-CoV-2 test that would likely work like an at-home pregnancy test, and is even considering whether there's value in integrating its two foundational technologies — SHERLOCK and INSPECTR — into one platform for viral detection.

Mammoth Bio is also working on different version of its test with GSK. While it ultimately plans to develop an at-home COVID test, it also plans to create a version for healthcare facilities. Importantly, the company also has the potential to develop many more similar tests based on its own CRISPR technology, such as an at-home disposable test for the flu, and has been in talks with GSK about possibly developing additional tests.

So, it comes as no surprise that Caspr is also planning to create additional formats for its tests. The company will be developing a direct-from-sample application for the COVID test, which could be applied to decentralized settings such as schools, warehouses, airports, or even at home, Goytia said. This system would utilize a fully automated, reusable device and single-use cartridges for single-patient disease detection.

The core biology would still utilize the same Lyo-CRISPR technology as the initial assay, but it would be integrated into small, disposable cartridges that would be fed into the reusable device. This device could then have its own optical readout and connectivity systems, or it could be connected to a smartphone through an app, which would receive the results.

Caspr is planning to deploy the cartridge and device solution by the end of 2020, Goytia said.

"The two major developments that we're trying to do out of our technology and our enzyme is the simplified multiplex capability through CRISPR, and also to avoid the need for the isothermal amplification step," he added. "So, when you take into account that we have an enzyme that has this differential performance at room temperature, that can be lyophilized into various formats, and used directly for detection at room temperature, we envision that we could have a solution that doesn't require any kind of heating and is very accessible for molecular detection in this decentralized manner in less than ten or fifteen minutes. We're working to achieve that vision."


Leaders in Pharmaceutical Business Intelligence (LPBI) Group


UPDATED – Status “Interference — Initial memorandum” – CRISPR/Cas9 – The Biotech Patent Fight of the Century: UC, Berkeley and Broad Institute @MIT, Volume 2 (Volume Two: Latest in Genomics Methodologies for Therapeutics: Gene Editing, NGS and BioInformatics, Simulations and the Genome Ontology), Part 2: CRISPR for Gene Editing and DNA Repair

UPDATED – Status “Interference — Initial memorandum” – CRISPR/Cas9 – The Biotech Patent Fight of the Century: UC, Berkeley and Broad Institute @MIT

Reporter: Aviva Lev-Ari, PhD, RN

UPDATED on 6/30/2019

Patent office renews dispute over patent rights to CRISPR-Cas9

By Public Affairs, UC Berkeley | JUNE 25, 2019

Schematic representation of the CRISPR-Cas9 system . The Cas9 enzyme (orange) cuts the DNA (blue) in the location selected by the RNA (red). (Image courtesy of Carlos Clarivan/Science Photo Library/NTB Scanpix)

The Patent Trial and Appeal Board (PTAB) of the U.S. Patent and Trademark Office (USPTO) has declared an interference between 10 University of California patent applications and multiple previously issued Broad Institute patents.

This action is addressing the following 9/2018 determination:

In September 2018, the United States Court of Appeals issued a ruling that upheld a Patent Trial and Appeal Board (PTAB) judgment that had found no interference-in-fact between UC claims and patents already issued to Broad, stating that the claims were not directed to the same subject matter. That ruling made no specific determination regarding priority of invention of genome editing within eukaryotic cells. UC was subsequently issued six U.S. patents for CRISPR technologies in other cellular or non-cellular settings, with six additional applications set to issue in the coming weeks and holds more than 50 CRISPR patents worldwide.

Interpretation of 6/2019 declaration of an interference by The Patent Trial and Appeal Board (PTAB) of the U.S. Patent and Trademark Office (USPTO) between 10 University of California patent applications and multiple previously issued Broad Institute patents.

The action jeopardizes 13 of the Broad’s 15 CRISPR-Cas9 U.S. patents and one patent application , and signals that the USPTO will take up the issue of who first invented CRISPR-Cas9 genome editing in eukaryotic cells, that is, plant and animal cells.

The CRISPR-Cas9 DNA-targeting technology was invented by Jennifer Doudna and Martin Jinek at the University of California, Berkeley Emmanuelle Charpentier, then of Umea University in Sweden and Krzystof Chylinski at the University of Vienna.

Eldora L. Ellison, Ph.D., lead patent strategist on CRISPR matters for UC and a director at Sterne, Kessler, Goldstein & Fox. “We are confident that the USPTO will ultimately recognize that the Doudna and Charpentier team hold the priority of invention specific to eukaryotic cells, as well as other settings covered by previous patents.”

Edward Penhoet, special advisor to the UC Berkeley chancellor and special assistant to the president of the University of California. “We are committed to protecting the intellectual property of the groundbreaking inventions of UC faculty, like the CRISPR-Cas9 breakthrough. Today’s declaration of interference reinforces the importance of the university’s role in protecting discoveries and their pursuit.”


Guarda il video: Lediting genomico con Cas9 (Febbraio 2023).