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Immagini reali di embrioni: come si conoscono le diverse zone (organizzatore speeman, zone marginali...)?

Immagini reali di embrioni: come si conoscono le diverse zone (organizzatore speeman, zone marginali...)?


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In molti libri di testo si disegnano figure di embrioni, ma in realtà come fa il biologo a sapere quale zona è questa di un embrione in fase di gastrulazione? Tranne il labbro dorsale qui non riesco a localizzare altro.


Arkadia migliora la segnalazione correlata ai linfonodi per indurre il mesendoderma

I membri nodali della famiglia del fattore di crescita trasformante (TGF)-β regolano l'induzione di mesoderma, endoderma e mesendoderma, un tessuto specifico per l'organizzatore di Spemann 1,2,3,4,5,6,7. Il modo in cui questi diversi tessuti si formano in risposta alle stesse molecole di segnalazione non è completamente compreso. È stato suggerito che gli effetti concentrazione-dipendenti, mediati da cofattori extracellulari e antagonisti, sono responsabili delle differenze 1,8,9,10. Qui mostriamo che la proteina nucleare Arkadia potenzia specificamente l'attività di induzione del mesendoderma di un sottoinsieme di membri della famiglia TGF-β. Le attività combinate di Arkadia e Xenopus correlati al nodo-1 sono sufficienti per indurre il mesendoderma e sopprimere il mesoderma. Arkadia dorsalizza i tessuti ventrali, determinando l'induzione dell'espressione genica specifica dell'organizzatore. Il blocco della segnalazione nodale a livello extracellulare inibisce questi effetti. Arkadia influenza l'attività nodale quando co-espresso e può funzionare nelle cellule adiacenti a quelle che producono il segnale nodale. I nostri risultati, insieme all'osservazione che i topi mutanti di Arkadia mancano di un nodo e di un mesendoderma derivato dal nodo, identificano Arkadia come un modulatore essenziale della cascata di segnalazione nodale che porta all'induzione dell'organizzatore di Spemann.


Astratto

Quest'anno, il 2019, segna il centenario della scoperta dell'embriologo E. E. Just di quello che è noto come il blocco rapido alla polispermia. L'osservazione di Just dei sottili cambiamenti che si verificano sulla superficie dell'uovo durante la fecondazione (e nella partenogenesi sperimentale) lo ha portato a postulare che l'uovo, e in effetti ogni cellula, possiede una proprietà che ha chiamato irritabilità indipendente, che rappresenta la capacità della cellula di rispondere in modo fisiologicamente rilevante a una varietà di segnali o trigger. In questo articolo, sostengo che il concetto di irritabilità indipendente di Just informò il suo contemporaneo Johannes Holtfreter poiché Holtfreter tentava di spiegare i fenomeni di induzione e competenza embrionali e che Holtfreter, a sua volta, influenzò Marc Kirschner e John Gerhart nella loro formulazione della teoria della facilitazione variazione. L'influenza di Just è particolarmente evidente nelle presentazioni di Gerhart e Kirschner di ciò che chiamano collegamento debole—una proprietà dei sistemi viventi che consente ai processi e ai componenti fondamentali di essere mescolati e abbinati in modi diversi per generare nuovi tratti. Sfortunatamente, la connessione tra l'opera di Holtfreter e quella di Just è rimasta nascosta. Questo articolo fornisce esempi di fenomeni che mostrano un legame debole e illustra il caso in cui il concetto di irritabilità indipendente di Just, attraverso Holtfreter, Gerhart e Kirschner, si è ampiamente infiltrato nelle cellule moderne e nella biologia dello sviluppo.

“Eppure i recenti grandi progressi nella [nostra comprensione dell'importanza della superficie cellulare] ci richiederanno di tornare al libro di Just [La biologia della superficie cellulare] per rivalutare la sua attualità. Forse, solo forse, potrebbe essere un altro Mendel o Miescher, che ha svolto un lavoro fondamentale non apprezzato per decenni dopo la sua morte” (Glass, 1984).


MATERIALI E METODI

Ovociti ed embrioni

Gli ovociti sono stati defogliati manualmente e coltivati ​​come descritto in precedenza (Kofron et al., 1999). Gli ovociti sono stati iniettati con oligo in terreno di coltura per ovociti (OCM) utilizzando due iniezioni equatoriali per ovocita per oligo XTcf3, o un'iniezione vegetale per oligo VegT e Axin, coltivati ​​a 18°C ​​e fecondati utilizzando la tecnica di trasferimento dell'ospite come descritto in precedenza (Zuck et al. al., 1998). Gli esperimenti di salvataggio sono stati condotti come descritto nel testo iniettando mRNA equatorialmente negli ovociti, 24 ore dopo l'oligo (Fig. 2F), o iniettando in embrioni a 4 cellule (Fig. 2E). Gli ovuli sono stati prelevati e fecondati utilizzando una sospensione di spermatozoi e gli embrioni sono stati mantenuti in 0,2 × MMR. Per le iniezioni di mRNA dopo la fecondazione (Fig. 2E), gli embrioni sono stati degelati e trasferiti al 2% di Ficoll in 0,5 × MMR allo stadio di 1 cellula. Gli mRNA sono stati diluiti con acqua distillata sterile e iniettati nei blastomeri.

Per i test sui cappucci degli animali, gli embrioni mid-blastula sono stati posti su piatti di agarosio al 2% in 1 × MMR e i cappucci degli animali sono stati sezionati usando una pinza affilata. I cappucci sono stati quindi coltivati ​​in OCM fino a quando gli embrioni fratelli hanno raggiunto lo stadio medio-tardivo della gastrula. Per gli espianti equatoriali, gli embrioni sono stati collocati su piatti di agarosio al 2% allo stadio medio di blastula e le regioni equatoriali sono state sezionate con aghi di tungsteno (Xanthos et al., 2001) e coltivate in OCM fino a quando gli embrioni fratelli hanno raggiunto lo stadio medio di neurula. Per la separazione nelle metà dorsale e ventrale allo stadio di gastrula, il lato dorsale degli embrioni è stato contrassegnato allo stadio di quattro cellule utilizzando cristalli blu del Nilo. L'asse dorsoventrale è stato riconosciuto allo stadio di quattro cellule dalle differenze di pigmentazione dei lati dorsale e ventrale. Quando gli embrioni wild-type hanno raggiunto lo stadio 10, tutti i lotti sono stati posti su piastre di agarosio al 2% in 1 × MMR pH 7,6 e divisi in due metà dorsale e ventrale e congelati in gruppi di 4 semi-embrioni a intervalli di 2 ore attraverso la gastrula fasi.

Oligo e mRNA

Gli oligodeossinucleotidi antisenso utilizzati erano oligonucleotidi chimerici fosforotioato-fosfodiestere purificati HPLC (Sigma/Genosys) con la composizione di base:

XTcf3 T1: 5′-C*G*LA*G*GGATCCCCAGTC*T*T*G*G-3′.

XTcf3 T2: 5′-G*LA*G*ATAACTCTGA*T*G*G-3′.

Gli oligo XTcf3 sono completamente complementari a tutte e quattro le varianti di XTcf3. Gli asterischi (*) rappresentano legami fosforotioato. Gli oligo sono stati risospesi in acqua sterile filtrata e iniettati nelle dosi descritte nel testo. Lunghezza intera XTcf3 nel vettore pGlomyc è stato linearizzato con Xbaio e capped XTcf3 L'mRNA è stato sintetizzato utilizzando il kit T7 mMessage mMachine (Ambion). Gli RNA sono stati estratti con fenolo, precipitati con etanolo e quindi risospesi in acqua distillata sterile per preparazioni iniettabili.

Analisi dell'espressione genica mediante RT-PCR in tempo reale

L'RNA totale è stato preparato da ovociti, embrioni ed espianti utilizzando proteinasi K e quindi trattato con DNasi priva di RNasi come descritto in precedenza (Zhang et al., 1998). Circa un sesto equivalente embrionale di RNA è stato utilizzato per la sintesi del cDNA con primer oligo(dT) seguiti da RT-PCR in tempo reale e quantificazione utilizzando il sistema LightCycler™ (Roche) come descritto da Kofron et al. (Kofron et al., 2001). I primer e le condizioni di ciclo utilizzati sono elencati nella Tabella 1. I valori di espressione relativa sono stati calcolati rispetto a una curva standard generata dalla diluizione seriale del cDNA di controllo non iniettato. I campioni sono stati normalizzati a livelli di ornitina decarbossilasi (ODC), che è stato utilizzato come controllo del caricamento. Campioni di acqua da soli o controlli privi di trascrittasi inversa nella reazione di sintesi del cDNA non sono riusciti a fornire prodotti specifici in tutti i casi.


GRADIENTI PER GLI ASSI DEL CORPO PRIMARIO NEI VERTEBRATI

Ci sono due assi primari del corpo, anteroposteriore (AP) e dorsoventrale (DV). Di solito, tuttavia, si presume che esista un solo organizzatore: l'organizzatore di tipo Spemann. come si può Due sistemi informativi posizionali ortogonali emergono sotto l'influenza di a separare organizzatore? C'è un secondo organizzatore, che è stato finora trascurato? Ci sono buoni argomenti che l'organizzatore per il modello AP non è l'organizzatore Spemann ma l'intera zona marginale (Meinhardt 2006). Nella prima gastrula, Wnt viene prodotto nella zona marginale ad eccezione della regione organizzatrice (Christian e Moon 1993). Wnt fornisce informazioni sulla posizione per la separazione in prosencefalo e mesencefalo (Kiecker e Niehrs 2001 Nordström et al. 2002 Dorsky et al. 2003). Questo sistema di formazione di modelli è evolutivamente molto antico. Un confronto delle espressioni geniche nell'idra e nella prima gastrula dei vertebrati mostra una corrispondenza sorprendente, suggerendo che il modello del cervello e del cuore dei vertebrati si è evoluto da un sistema che un tempo era responsabile del modello del corpo di un antenato simile a un'idra (Fig. 2B). ) (Meinhardt 2002). In questa prospettiva, l'organizzatore dell'idra e il blastopore vertebrato, cioè la zona marginale, l'anello germinale, ecc., Sono strutture omologhe responsabili del patterning AP.

In contrasto con l'organizzatore dell'idra, il blastoporo vertebrato si è evoluto in un enorme anello con l'organizzatore Spemann che forma una piccola toppa su questo anello. Si presume quindi che l'organizzatore di Spemann modelli l'asse DV, ma lo fa indirettamente dando origine alla linea mediana dorsale, alla notocorda e alla piastra del pavimento: una "linea alta" e non un "punto alto" per il modello DV. Entrambe le regioni organizzatrici, il blastoporo per l'AP e la linea mediana per l'asse DV, formano un sistema di coordinate cartesiane vicino che consente un modello combinatorio lungo entrambi gli assi (Fig. 2C). La generazione di una singola "linea alta" lungamente estesa per il patterning DV è un sottile processo di formazione del pattern. La soluzione dei vertebrati non è l'unica. Negli insetti, ad esempio, un organizzatore dorsale esercita un'azione reprimere influenza, facendo apparire la linea mediana sul lato ventrale opposto (Meinhardt 2004, 2008), molto in contrasto con i vertebrati in cui l'organizzatore inizia e allunga la linea mediana dorsalmente. Questo modello fornisce un razionale per la posizione dorsale o ventrale del sistema nervoso centrale nei vertebrati e negli insetti, rispettivamente.


Modello di scala dipendente da Chordin/Sizzled

Abbiamo recentemente riportato il meccanismo molecolare di ridimensionamento in bisecato Xenopus embrioni (Inomata et al. 2013). Il mezzo embrione dorsale dovrebbe formare un corretto gradiente di Chordin in base alla dimensione dell'embrione regolando tre fattori, sintesi-diffusione-degradazione. Tuttavia, se i tre fattori cambiano dinamicamente il loro valore, sarà difficile analizzare il sistema di scaling. Per eliminare questa complessità, abbiamo creato artificialmente cellule di origine, che hanno sintetizzato una quantità costante di proteina Chordin senza essere influenzate dalle dimensioni dell'embrione o dall'attività BMP (saggio di ricostituzione dell'asse D-V). In primo luogo, gli embrioni sono stati iniettati con -catenina-MO e accordo/noggin-MO (βCN-MO) per eliminare rispettivamente le cellule sorgente (organizzatore) e l'espressione di fattori dorsalizzanti endogeni (Fig. 4) (Heasman et al. 2000 Oelgeschlager et al. 2003a). Successivamente, utilizzando questi embrioni completamente ventralizzati privi di gradiente, abbiamo iniettato localmente accordo mRNA per creare esogeno un gradiente di Chordin nell'embrione. Ciò ha portato alla formazione di tre regioni distinte, le regioni dorsale (D), laterale (L) e ventrale (V), come nell'embrione di controllo. Quando il tasso di produzione della proteina Chordin è stato potenziato iniettando quattro volte più in alto accordo mRNA, gli embrioni hanno dimostrato un moderato cambiamento nella formazione dell'asse D-V. Pertanto, la forma del gradiente di Chordin sembrava essere principalmente regolata dalla degradazione.

Da questi risultati, ci siamo concentrati sull'associazione tra Chordin e Sizzled, che controlla la stabilità della proteina Chordin (Fig. 2B). Per esaminare la velocità di diffusione, abbiamo eseguito il recupero della fluorescenza dopo il test di photobleaching (FRAP) o spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) e abbiamo scoperto che Chordin e Sizzled, così come la forma secretoria di mEGFP, si diffondono rapidamente. Al contrario, il tasso di degradazione di ciascuna proteina era nettamente diverso. La proteina Sizzled era stabile nell'embrione, mentre la proteina Chordin (26,7 fmol per embrione) si è degradata molto velocemente con un'emivita di circa 30 min. Questa instabilità della proteina Chordin è stata completamente bloccata dalla quantità in eccesso di Sizzled, indicando che la maggior parte della degradazione di Chordin dipendeva dalle metalloproteasi BMP1 e Xlr. Inoltre, il gradiente di Chordin ha cambiato dinamicamente la sua forma da ripido a poco profondo a seconda della concentrazione di Sizzled, anche quando la velocità di produzione di Chordin è stata fissata dal saggio di ricostituzione dell'asse D-V. Questi risultati hanno indicato che la forma del gradiente di Chordin era principalmente regolata dalla degradazione la cui velocità dipendeva dalla quantità di proteina Sizzled.

Sulla base dell'osservazione sperimentale, abbiamo proposto il modello di ridimensionamento dipendente da Chordin/Sizzled menzionato di seguito. Prima della gastrulazione, bmps e il suo gene bersaglio sfrigolante sono stati espressi in tutto l'embrione (Fig. 5A). Tuttavia, quando l'organizzatore (cellule sorgente) si è formato localmente nell'embrione allo stadio iniziale della gastrula, ha sintetizzato Chordin diffuso nello spazio extracellulare e gradualmente ha soppresso il sfrigolante area di espressione inibendo l'attività delle BMP (Fig. 5A). Durante questo processo, la proteina Sizzled è stata gradualmente accumulata nell'embrione a causa del suo basso tasso di degradazione (Fig. 5B). Considerando la metà dorsale dell'embrione, il sfrigolante l'area di espressione è stata rapidamente soppressa dalla diffusione di Chordin (Fig. 5A in basso). L'accumulo di Sizzled è diventato inferiore a quello dell'embrione di controllo (Fig. 5B in basso). In questo mezzo embrione dorsale a basso sfrigolio, la degradazione di Chordin è stata migliorata e ha formato un gradiente ripido adatto per il piccolo embrione (Fig. 5C).

In questo modello di ridimensionamento, abbiamo proposto che la dimensione dell'embrione regoli la stabilità della proteina Chordin attraverso l'accumulo della proteina Sizzled. Per affrontare questa possibilità, la produzione di Chordin è stata fissata utilizzando il saggio di ricostituzione dell'asse D-V e la dimensione dell'embrione è stata modificata artificialmente mediante bisezione. Nonostante la produzione fissa, la riduzione della proteina Chordin è stata rilevata negli embrioni bisecati. Coerentemente con il modello di ridimensionamento dipendente da Chordin/Sizzled, questo cambiamento nella stabilità della proteina Chordin è stato eliminato quando Sizzled è stato impoverito dal morfolino. Inoltre, abbiamo costruito un modello matematico basato sui risultati sperimentali: (i) tasso di diffusione identico di Chordin e Sizzled (ii) tasso di degradazione inferiore di Sizzled rispetto a quello di Chordin (iii) regolazione dipendente da Sizzled di degradazione e (iv) soppressione dell'area di espressione Sizzled per diffusione Chordin. In questo modello matematico, abbiamo confermato che tre regioni distinte, dorsale, laterale e ventrale, potrebbero scalare alle dimensioni dell'embrione attraverso l'accumulo di Sizzled.


Discussione

Il Xenopus L'organizzatore di Spemann ha fornito un terreno di pesca fertile per la scoperta di proteine ​​secrete che regolano lo sviluppo. Ci si aspettava che potessero essere isolati nuovi fattori di crescita, invece, si è scoperto che l'organizzatore di Spemann media l'induzione embrionale attraverso la secrezione di una miscela di antagonisti del fattore di crescita (4, 5). Nel presente studio, abbiamo utilizzato il sequenziamento profondo per studiare la scelta tra epidermide e tessuto neurale.

Una ricca risorsa trascrittomica.

Il trascrittoma di cellule del cappuccio animale che erano state dissociate per diverse ore (causando la neutralizzazione), così come quello di espianti ectodermici microiniettati con un numero di mRNA che inducono il tessuto neurale, come accordo, Cerbero, e FGF8, è stato determinato da RNA-seq. Abbiamo anche esaminato l'effetto dell'induttore dell'endomesoderma Xnr2, l'induttore epidermico BMP4, e il modificatore di competenza di induzione del mesoderma xWnt8 (32). Questi dati, che comprendono un minimo di 45 × 10 9 nucleotidi sequenziati di RNA, sono forniti nei set di dati S1-S3, che possono essere facilmente estratti dalla comunità di ricerca. Ciò costituisce un'importante risorsa aperta per i biologi dello sviluppo interessati alla differenziazione dello strato germinale.

Isolamento di un inibitore Wnt.

Ricercando i geni di induzione neurale attivati ​​dalla dissociazione cellulare (che causa l'attivazione di MAPK) (19) e cercando Cerbero, accordo, e xWnt8 mRNA, abbiamo identificato una proteina che abbiamo designato come Bighead a causa del suo fenotipo di sovraespressione. Inaspettatamente, questa molecola non è stata espressa nell'ectoderma dello stadio 12 della gastrula tardiva quando sono state preparate le librerie RNA-seq. In questa fase, l'mRNA di Bighead è espresso nell'endoderma, in particolare nell'organizzatore dorsale di Spemann. L'espressione dell'organizzatore si trova nell'endoderma profondo ma non si sovrappone all'endoderma anteriore di punta (che dà origine all'intestino anteriore e al fegato), che esprime Cerberus e Dkk1 (24, 41). Alla luce del requisito di Bighead per lo sviluppo della testa, sembra che gli antagonisti del Wnt debbano emanare anche dalle regioni endodermiche più posteriori dell'organizzatore per potenziare pienamente le sue proprietà di induzione della testa.

È improbabile che la dissociazione dei cappucci animali induca l'endoderma, poiché il marker pan-endodermico Sox17 non è espresso (Dataset S1). Sembra probabile che la dissociazione dei cappucci animali porti all'attivazione prematura dei domini neurali dell'espressione di Bighead, che, nell'embrione indisturbato, sono osservati nelle fasi successive della neurula. L'identificazione di Bighead è stata fortunata, perché si è rivelata una proteina interessante.

Da quando X. laevis è allotetraploide, Bighead è codificato da due geni delle forme S e L (20). Entrambi codificano proteine ​​di circa 270 aa con un peptide segnale e vengono secreti. Negli esperimenti di sovraespressione, Bighead ha causato fenotipi molto simili all'archetipo dell'antagonista Wnt Dkk1 (41). Testa grande L'mRNA ha espanso l'espressione di un numero di marcatori della testa, ha bloccato l'espressione del En2 Gene bersaglio Wnt, ha impedito la formazione dell'asse secondario dopo una singola iniezione di xWnt8 mRNA e ridotta induzione dei primi bersagli Wnt siamois e Xnr3. Inoltre, l'aggiunta della proteina Bighead ha inibito la segnalazione canonica di Wnt nei saggi del gene reporter della luciferasi. Pertanto, Bighead si comporta come un antagonista del segnale Wnt canonico, molti dei quali sono noti per promuovere lo sviluppo della testa (48).

Ricerche approfondite di omologhi di Bighead in altri organismi hanno mostrato che è presente solo nei pesci e negli anfibi. Ad esempio, in zebrafish, Bighead corrisponde a LOC571755, una proteina di funzione sconosciuta. La proteina si è evoluta rapidamente, ma le sue sei cisteine ​​sono state conservate in molte specie. La previsione SWISS-MODEL suggerisce che la regione C-terminale di Bighead è compatibile con la struttura cristallina del prodominio di TGF-βs come miostatina/GDF8 (38, 40) forse parte di Bighead derivato da un dominio strutturale nella proregione di un antico TGF-β.

Non sono stati trovati omologhi in rettili, uccelli o mammiferi. La perdita di geni è molto comune durante l'evoluzione. Ad esempio, abbiamo descritto un'antica rete auto-organizzante di Chordin/BMP/Tolloid che regola il patterning D/V nei vertebrati e negli invertebrati (49). Tuttavia, nonostante questa profonda conservazione, alcune componenti della rete sono andate perdute. La proteina morfogenetica antidorsalizzante (ADMP) è un BMP che è stato perso nell'ornitorinco (Ornitorinco) (50). Gli sFRP Crescent e Sizzled sono presenti negli uccelli e nell'ornitorinco, ma non nei mammiferi superiori, che hanno perso il tuorlo d'uovo. Inoltre, gli sFRP non sono presenti in nessun invertebrato (51). Sembra che il requisito embrionale per il livello di regolamentazione fornito da Bighead sia stato perso insieme all'invenzione dell'amnion. Nonostante ciò, i nostri studi con l'esaurimento di Bighead da parte di MO dimostrano un requisito straordinariamente forte per questo gene nella formazione della testa durante lo sviluppo della rana.

Perché così tanti antagonisti di Wnt?

Bighead si aggiunge a una lunga lista di antagonisti Wnt nascosti. Questi includono le proteine ​​Dkk (48), sFRPs, fattore inibitorio Wnt 1 (WIF-1) (52), SOST/Sclerostin (53), Notum (un'idrolasi che rimuove palmitoleoylate da Wnt nello spazio extracellulare) (54), e Angptl4 (6). Inoltre, proteine ​​transmembrana come Shisa (una proteina coinvolta nel traffico del recettore Frizzled sulla superficie cellulare) (55), Tiki (una proteasi che taglia il terminale amminico di Wnts) (56) e Znrf3/RNF43 (una ubiquitina ligasi che mira ai recettori Frizzled e Lrp6 per la degradazione lisosomiale) (57, 58) down-regolano la segnalazione di Wnt.

Come mostrato in questo studio, Bighead si lega a Lrp6, inducendo la sua rapida endocitosi nei lisosomi. Di conseguenza, Lrp6 viene rimosso dalla superficie della cellula e degradato negli endolisosomi. Questo meccanismo molecolare è molto simile a quello degli antagonisti Wnt Dkk1 e Angptl4. Dkk1 si lega a Lrp6 e Kremen1/2 e il complesso viene interiorizzato. Angptl4 è una proteina secreta nota soprattutto per il suo ruolo di inibitore della lipoproteina lipasi (LPL), l'enzima chiave nella rimozione dei trigliceridi dal plasma sanguigno (59). Studi in Xenopus hanno dimostrato che Angptl4 si lega ai sindecani della superficie cellulare (che sono proteoglicani transmembrana) e che questa interazione innesca l'endocitosi di Lrp6 (6). Nel caso di Bighead, non è noto se sia necessario un corecettore per l'internalizzazione di Lrp6. Ciò che è chiaro, tuttavia, è che questi tre antagonisti Wnt portano all'internalizzazione di Lrp6 in una popolazione endolisosomiale che non è coinvolta nella generazione del segnale.

L'esistenza di così tanti regolatori sottolinea la ricca complessità della via di segnalazione Wnt. Di solito pensiamo al Wnt canonico come a un segnale che aumenta semplicemente i livelli di -catenina nucleare per regolare la trascrizione dal fattore di cellule T/fattore di legame del potenziatore linfoide (TCF/LEF). Tuttavia, Wnt ha effetti aggiuntivi. Ad esempio, nella stabilizzazione Wnt-dipendente delle proteine, centinaia di proteine ​​cellulari si stabilizzano, portando ad un aumento delle dimensioni della cellula (60, 61). Ciò è causato dal sequestro di GSK3 all'interno degli endosomi tardivi/corpi multivescicolari (MVB) (62, 63), diminuendo la fosforilazione dei fosfodegroni nelle proteine ​​citosoliche che normalmente portano alla loro degradazione nei proteasomi. Oltre a GSK3, un altro importante enzima citosolico, la proteina arginina metiltransferasi 1 (PRMT1), viene sequestrato all'interno degli MVB quando i corecettori Wnt vengono endocitati insieme al loro ligando Wnt (64). La recente realizzazione che Wnt3a stimola notevolmente l'endocitosi non mediata da recettori di BSA-DQ dal mezzo extracellulare (64) suggerisce che Wnt è un importante regolatore del traffico di membrana. Proponiamo che Lrp5/6 sia un importante regolatore non solo del traffico di Wnts ma anche del fluido cellulare complessivo e dell'assorbimento dei nutrienti. L'endocitosi è una proprietà cellulare universale che potrebbe essere regolata da Dkk1, Angptl4 e Bighead. Molto resta da imparare sulla fisiologia della notevole via di segnalazione Wnt (65, 66).


Ringraziamenti

Ringraziamo F. ​​Cong per aver fornito i costrutti ZNRF3 D. Koinuma per aver fornito i costrutti ALK C. Janda per aver fornito il costrutto surrogato WNT R. Thomas per le cellule H1581. Riconosciamo G. Roth e Aska Pharmaceuticals Tokyo per aver generosamente fornito hCG. Ringraziamo NXR (RRID: SCR_013731), Xenbase (RRID: SCR_004337) ed EXRC per Xenopus risorse. Si ringrazia Fabio da Silva per la lettura critica del manoscritto. Si ringrazia con gratitudine il supporto tecnico esperto da parte della struttura centrale DKFZ per la microscopia ottica e del laboratorio centrale per animali di DKFZ. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – SFB1324 – progetto numero 331351713.


ENDOBLAST A FALCE (IPOBLAST SECONDARIO)

L'endoblasto di falce forma uno strato unicellulare molto esteso che prolifera dal bordo mediale della falce di Rauber o endoblasto giunzionale in direzione centripeta e craniale durante la prima incubazione (Callebaut e Van Nueten, 1994 Callebaut et al., 1999 Fig. 13). Principalmente, contiene ooplasma.

L'endoblasto della falce appartiene alla stessa linea cellulare della falce di Rauber e ha un comportamento simile ma è dominato dalla falce di Rauber

Se un frammento di endoblasto di falce di quaglia viene posizionato sulla regione anti-falce di un blastoderma di pollo non incubato da cui la falce di Rauber è stata selettivamente raschiata via, allora un intero embrione con un PS, endoderma definitivo, nodo di Hensen e una piastra neurale si sviluppa in un direzione diametralmente opposta, a partire dalla regione antifalce (Callebaut et al., 2003a, b). Lo stesso accade quando un frammento di endoblasto di falce di quaglia viene posto sulla parte centrale isolata di un blastoderma di pollo non incubato (Callebaut et al., 2002c). L'ooplasma sottogerminale centrale posto artificialmente a contatto con il materiale falciforme di Rauber o l'endoblasto falciforme in coltura, può funzionare come substrato per la proliferazione cellulare con capacità di induzione e/o rigenerazione nello strato superiore adiacente (Callebaut et al., 2000c). Anche l'attivazione della formazione dell'embrione può avvenire da blastodischi di quaglia non fecondati (Callebaut et al., 2000d).

Quando l'endoblasto della falce di quaglia viene posizionato sulla regione isolata anti-falce di un blastoderma di pollo non incubato in coltura, si sviluppa una placca neurale precoce. Al contrario, quando un pezzo di endoblasto di falce di quaglia viene posizionato sulla regione anti-falce di un intero pollo non incubato in coltura, non ha alcun effetto induttore. Questa scoperta indica che la falce di Rauber domina o inibisce l'endoblasto di falce posizionato ectopicamente, che deriva dalla stessa linea cellulare. Questo endoblasto a falce, se sottratto all'influenza della falce di Rauber, ha poteri di induzione di gastrulazione e/o neurulazione sullo strato superiore del blastoderma non incubato, ma non ha alcuna influenza sulla formazione di isole di sangue. Il gene homeobox cHex è espresso nell'endoblasto falcetto e falcetto di Rauber (Yatskievych et al., 1997). Le trascrizioni di cHex sono state rilevate anche all'interno di isole di sangue a partire dallo stadio 4 (Hamburger e Hamilton, 1951) e nelle cellule endoteliali vascolari extraembrionali e intraembrionali. Poiché abbiamo dimostrato che la falce di Rauber e l'endoblasto giunzionale hanno un effetto di induzione sulla formazione di isole di sangue, possiamo postulare una relazione sconosciuta con il gene cHex.

Influenza dell'endoblasto falciforme su neurulazione e gastrulazione

Le basi molecolari dell'induzione neurale sono state ampiamente studiate in Xenopus laevis, e si è scoperto che era strettamente connesso allo stabilimento dell'asse dorsoventrale (De Robertis e Sasai, 1996 Hemmati-Brivanlou e Thomsen, 1995 Hemmati-Brivanlou e Melton, 1997). Nelle rane, il potenziale ectoderma è indotto dai BMP. Al contrario, uno sviluppo neurale richiede l'inattivazione delle BMP e si ottiene mediante la formazione diretta di complessi tra le BMP e fattori di induzione neurale come chordin, zucca o follistatina (Piccolo et al., 1996 Zimmermann et al., 1996). Nel blastoderma del pulcino nelle fasi iniziali, l'epidermide prospettica è caratterizzata dall'espressione del gene homeobox DLX5, che rimane un marker epidermico durante la gastrulazione e la neurulazione e consente di distinguerlo dalla placca neurale più centrale (Pera et al., 1999 ). Che i segnali verticali dallo strato inferiore siano necessari per l'instaurazione della placca neurale è stato dimostrato da questi ultimi autori da ripetute estirpazioni dell'endoblasto sottostante. In assenza degli strati germinali inferiori, l'epidermide si è espansa nella regione che normalmente forma la placca neurale.

Knoetgen et al. ( 1999a , b ) hanno analizzato il GANF (Gallo piega neurale anteriore) -indurre il potenziale di vari tessuti in diverse fasi durante lo sviluppo del pulcino mediante trapianto al margine esterno dell'area pellucida, dove le cellule epiblastiche sono destinate a diventare epidermide (Spratt, 1952 Rosenquist, 1966 Schoenwolf e Sheard, 1990 Bortier e Vakaet, 1992 Garcia-Martinez et al., 1993). I trapianti di nodo di Hensen (HH3+/HH4) su interi blastodermi hanno portato all'induzione di una struttura neuroectodermica con una forte espressione di GANF nel suo margine cranico. L'innesto del processo della testa giovane (HH4) all'area pellucida cranica laterale ha causato un ispessimento dell'epiblasto e un'induzione dell'espressione di GANF nelle cellule giustapposte.

Una molecola secreta denominata "Cerberus", che è espressa nell'endoderma anteriore, ha la proprietà di indurre strutture ectopiche della testa quando microiniettata nelle regioni ventrali di Xenopus embrioni (Bouwmeester et al., 1996 Bouwmeester, 1997). Il patterning dell'anlage del proencefalo di pollo da parte della placca precordale è stato descritto da Pera e Kessel (1997). Secondo questi autori, inoltre, la placca neurale aviaria è evidente prima dell'ingresso delle prime cellule mesendodermiche o mesodermiche assiali, escludendo la placca precordale e la notocorda come fonti primarie di induzione neurale. Durante la prima gastrulazione, le cellule invaginano attraverso la punta della striscia crescente e si diffondono radialmente per formare l'endoderma definitivo (intestino) (Vakaet, 1970). Durante questa espansione radiale, quest'ultimo endoderma definitivo spinge l'endoblasto a falce anche radialmente (Callebaut e Van Nueten, 1994 Fig. 13). L'endoblasto falciforme emicircolare cranico scorre sotto le cellule dello strato superiore che si trasformano in una piastra neurale emicircolare (Bortier e Vakaet, 1992). Queste ultime cellule sono localizzate vicino alla precedente regione antifalce, esattamente nella concavità della mezzaluna endofila cranialmente spostata. L'endoblasto a falce più caudale rimanente è localizzato sotto lo strato superiore, che darà origine alla regione centralis dell'area formante PS. Questa diversa evoluzione nella regione cranica (anti-falce) rispetto alla regione centrale (area centralis) può essere probabilmente spiegata dalla diversa reattività in queste due regioni dello strato superiore (Callebaut et al., 2002c).

L'assenza di induzione neurale dopo gli esperimenti di innesto con lo strato profondo su interi blastodermi di Gallera e Nicolet (1969) e di Knoetgen et al. (1999a, b) può probabilmente essere spiegato dalla piena presenza del materiale falcetto di Rauber. Questa scoperta indica anche che le precedenti conclusioni degli esperimenti di innesto su blastodermi interi non incubati (contenenti la falce di Rauber, l'organizzatore principale primario, o sui blastodermi PS, contenenti il ​​nodo di Hensen, un organizzatore principale secondario) devono essere riconsiderate. Pertanto, non possiamo essere d'accordo con nessuna delle conclusioni di Knoetgen et al. (1999b) che l'endoblasto da solo provoca qualsiasi cambiamento rilevabile nell'ectoblasto ospite adiacente dopo il trapianto o che l'organizzatore aviario è confinato solo al nodo di Hensen. Foley et al. (2000) hanno studiato l'eventuale ruolo dello strato profondo precoce (endofilla e/o endoblasto falciforme) sull'espressione dei marcatori molecolari Sox3 (Uwanogho et al., 1995) e Otx2 (Bally-Cuif et al., 1995) nel strato superiore. Dallo stadio 6-7 di Hamburger e Hamilton in poi, Sox3 è espresso in modo specifico nell'intera piastra neurale del pollo e Otx2 è espresso in tutto il proencefalo e il mesencefalo. Foley et al. (2000) hanno scoperto che lo strato profondo precoce regola una fase transitoria precoce dell'espressione di Otx2 e Sox3 nello strato superiore adiacente. Pertanto, hanno concluso che lo strato profondo precoce non induce il tessuto neurale o il proencefalo in modo definitivo. Tuttavia, i loro esperimenti di trapianto non sono stati eseguiti sulla falce di Rauber o su frammenti di blastoderma senza endoblasti giunzionali, ma su interi blastoderma. Recentemente, Knezevic e Mackem (2001) hanno trovato prove che due geni, successivamente associati all'organizzatore della gastrula (Gnot-1 e Gnot-2), sono indotti dai segnali dello strato profondo negli embrioni prestreak. Secondo questi ultimi autori, questi geni potrebbero forse regolare la formazione degli assi nell'embrione precoce, il che potrebbe anche spiegare l'induzione di una striatura nella parte isolata dell'area centralis da parte dell'endoblasto falciforme (Callebaut et al., 2003b).


Parte 3: sviluppo precoce della rana: come creare un girino o un gemello

00:00:0708 Sono Richard Harland.
00:00:0808 Sono all'Università di Berkeley.
00:00:0926 E oggi vi parlerò delle attività di segnalazione che danno luogo a
00:00:1322 the neural plate, the forerunner of the spinal cord and brain in vertebrate embryos.
00:00:1914 In previous talks, I've talked about the introduction to the Xenopus embryo, why it has some advantages
00:00:2509 for experiments.
00:00:2609 And I've talked about the cell shape changes that have happened in the. in the embryo
00:00:3015 that lead to the three-layered ectoderm/mesoderm/endoderm structure that is the case, the.
00:00:3625 the state at which neural tissue formation happens.
00:00:4120 Let's initially start by just reviewing the classic experiment, the organizer experiment
00:00:4520 done by Hilde Mangold and Hans Spemann.
00:00:4819 And this is the one that really set the stage for what I'm going to talk about.
00:00:5304 In this experiment, they used marked embryos.
00:00:5607 They used newts of different colors: a dark-colored, pigmented newt, and a light-colored newt.
00:01:0104 And what they were. asking the question, what happens if we move pieces of the embryo around?
00:01:0814 Do they differentiate according to how they normally were set up in the embryo?
00:01:1209 It's self-differentiating according to their original fate?
00:01:1502 Or do they adopt the fate of their surroundings?
00:01:1728 Are they told to become the fate of their surroundings?
00:01:2017 Well, there was one particular experiment that was quite spectacular,
00:01:2426 where not only did the cells self-differentiate, but they recruited cells from the rest of the embryo
00:01:3025 to make new structures, the phenomenon of embryonic induction.
00:01:3604 So here, what they did was to take this embryo, here. the dark embryo is the host, and there's
00:01:4212 this paler donor.
00:01:4328 And what they did was to cut out this dorsal lip region from the pale embryo, flip it around,
00:01:5013 and graft it in to the ventral side of the host.
00:01:5318 So, not only does this have its normal organizer side but it has a new piece of dorsal mesoderm
00:01:5904 stuck in the ventral side.
00:02:0028 And what they found was that this was enough to make the embryo twin.
00:02:0602 And that's shown down here in a representation, this particular one done by Andrea Wills,
00:02:1014 who was a student with me.
00:02:1204 So, you can see that there's a normal primary axis with a head with two eyes.
00:02:1619 Then down here, there's a secondary axis, which is fused down at the tail, but it's
00:02:2116 a complete, proper, organized secondary axis.
00:02:2524 Now, the important thing was, since they were using marked issues, they could tell
00:02:3006 what is the contribution of the graft and the host.
00:02:3228 And so here's a. a representation of the section that was made by Hilde Mangold.
00:02:3702 Here's the primary axis, with the tissues that should be familiar to us by now:
00:02:4121 the nervous system, the notochord, and the muscle.
00:02:4510 And here's the secondary axis.
00:02:4626 And there's the pale graft.
00:02:4801 The pale graft invariably contributes just to the midline tissues.
00:02:5215 Here, it's contributing to the notochord and a little bit of the somites.
00:02:5707 Sometimes it would contribute to a bit of the spinal cord.
00:02:5926 But the consistent observation is that it contributes to the midline tissues,
00:03:0420 whereas the bulk of these tissues are recruited from the host: most of the nervous system,
00:03:0810 the muscle, and so on.
00:03:1202 So this graft really must be instructing the surroundings to make this second axis and
00:03:1620 organize it properly.
00:03:1805 Here's a modern equivalent of the experiment, also done by Andrea Wills, where she's
00:03:2216 labeled the donor embryo with a red stain.
00:03:2515 And you can see in this twin, where the two axes have arranged themselves conveniently
00:03:3013 next to each other.
00:03:3117 Here is the red-labelled graft.
00:03:3308 And you can see above it the induced neural tissue.
00:03:3613 So, it's not a phenomenon just of the 1920s, but can be done in the current times.
00:03:4221 Now, I'm really going to emphasize that this induction mechanism was not obvious.
00:03:4714 And in fact, Warren Lewis, who is not as famous as Spemann and Mangold, tried a similar experiment
00:03:5313 earlier than they did.
00:03:5504 But what he concluded -- largely because the embryos were not marked --
00:03:5915 was that the result he was getting was exclusively the result of self-differentiation of the grafted tissue.
00:04:0521 And he couldn't see any induction, because the tissues were not marked.
00:04:0922 And so the bottom line is that he'd. because of this assumption of self-differentiation,
00:04:1506 he missed on the phenomenon of induction.
00:04:1800 And so we remember Spemann and Mangold, and less so Lewis.
00:04:2201 Okay, let's go back to the whole embryo and remind ourselves what we're looking at.
00:04:2713 So, we know from molecular mapping that the organizer is gonna be the top of this
00:04:3323 when it loops around again.
00:04:3428 We're going through gastrulation and neurulation.
00:04:3804 And when we loop around again. here's the organizer up here.
00:04:4013 It's going inside the embryo and is opposed to this neural plate, and is able to
00:04:4615 instruct it to make the neural tissue.
00:04:4907 So again, if we look at this MRI movie, we can see that dorsal mesoderm moving up
00:04:5604 against this overlying neural plate.
00:04:5811 And during this process, where it's opposed to the neural plate, it's in the right place
00:05:0207 to be inducing the neural tissue.
00:05:0407 So, that's the normal organizer that's going up there and is thought to be signaling
00:05:1005 to induce the neural plate.
00:05:1113 Okay, so we're going to discuss this more.
00:05:1501 But we first need to understand how we get to that position.
00:05:1724 And I'm not going to go through this in detail, but I'm going to give a brief summary of the
00:05:2126 initial events that happen to set up the organizer.
00:05:2517 And it comes down largely to the activity of two different signaling pathways: the Nodal/Smad2 pathway
00:05:3221 and the Wnt/beta-catenin pathway.
00:05:3512 We don't need to know about these pathways in detail, but what we do know is the way
00:05:4018 they're turned on in the embryo.
00:05:4224 So initially, when the egg is laid, it's got this axis from animal to vegetal,
00:05:4822 from the pigmented to the yolky side.
00:05:5122 And subsequently it was found that there are a number of pre-localized components in that
00:05:5515 polarized egg.
00:05:5717 And I'm going to talk about this red mRNA, messenger RNA, that's pre-localized,
00:06:0300 called vegt, first described by Mary Lou King's group.
00:06:0612 And there's also, slightly less well-characterized, activators of the Wnt/beta-catenin pathway
00:06:1119 down here.
00:06:1303 So initially, this is cylindrically symmetrical about the animal-vegetal axis.
00:06:1618 And an important process here, as is widespread in embryology, is the symmetry breaking.
00:06:2118 So, you have to go from a cylinder to a bilaterally symmetrical egg.
00:06:2523 And this is achieved during normal development because the sperm is going to enter on one side.
00:06:3213 That makes this giant aster.
00:06:3504 So, these astral microtubules extend throughout the egg cytoplasm during the first cell cycle.
00:06:4115 And not only do they serve to pull the maternal pronucleus towards it, but they also
00:06:4603 serve to bias the way that microtubules polymerize. polymerize in the outside cortex,
00:06:5101 the outer ten-micron layer.
00:06:5313 So as a result of this bias, there's an oriented array of microtubules that go around the embryo,
00:06:5928 here.
00:07:0028 And they act as tracks for carriage via kinesins of some of these purple components.
00:07:0622 There's a selectivity.
00:07:0822 The purple components that activate the Wnt/beta-catenin pathway get smeared out along the
00:07:1413 entire dorsal side of the embryo, whereas the red do not do this.
00:07:1826 They're sort of passively released from the vegetal cortex and spread in a graded way
00:07:2417 through the egg.
00:07:2517 So, we now have a broken symmetry, where we have the red going from vegetal to animal
00:07:2926 and the Wnt/beta-catenin concentrated from dorsal to ventral.
00:07:3504 Now, these two molecules get together and turn on the. the Nodal genes.
00:07:4000 The Nodal genes are signaling proteins in the TGF-beta superfamily.
00:07:4307 And they're turned on in the margin.
00:07:4515 And in normal development, there's a cooperativity between the purple Wnt signal and, now,
00:07:5026 this yellow protein produced from the vegt RNA.
00:07:5409 So, they get together and turn on these Nodal genes.
00:07:5802 And they turn them on at a higher level on the dorsal side and the ventral side.
00:08:0216 But they do turn them on everywhere.
00:08:0500 And these Nodal genes induce mesoderm.
00:08:0710 So, the cells that are initially naive get told, in this marginal zone, to become
00:08:1310 the prospective mesoderm.
00:08:1504 But where this interaction is the strongest -- the strongest interaction of beta-catenin
00:08:1922 and the Nodal gene expression -- that converges on the promoters of organizer gene and
00:08:2512 turns them on, especially in this dorsal region here.
00:08:2822 So, the marginal zone. the mesoderm goes all the way across in the equator,
00:08:3224 but the organizer is special in that it's only turned on at the convergence, the strongest convergence
00:08:3702 of these signals.
00:08:3804 Okay, so we've discussed that.
00:08:4024 And let's just contrast that with what happens if this cortical rotation doesn't occur.
00:08:4701 And so you can see here what. there are various tricks to. to cause this to happen.
00:08:5024 One is to irradiate the vegetal side of the embryo with ultraviolet light.
00:08:5413 And that prevents the polymerization of microtubules.
00:08:5726 The alternative is to eliminate beta-catenin production by using a reagent that
00:09:0209 blocks beta-catenin production.
00:09:0324 We'll come back to that.
00:09:0611 Either way, what happens is that we get the release of the vegt and we get the
00:09:1014 graded vegt protein, which turns on Nodal, but, in the case of the lack of cortical rotation,
00:09:1626 then this purple signal stays down here.
00:09:2001 And so as a result, there is no synergy on this side.
00:09:2225 There's no overlap between the signals.
00:09:2522 And so this whole marginal zone behaves like the ventral marginal zone.
00:09:3008 You get a. a ventralized type of embryo with no organizer.
00:09:3506 Okay, so that symmetry-breaking event back here was important.
00:09:3902 But we're gonna use this trick in the next experiment, that proves that we need organizer signal
00:09:4327 to get the neural plate to be formed.
00:09:4905 Before we go into that, we're just gonna discuss a little bit more about the graded Nodal signaling.
00:09:5327 Because there. a quite widespread view in the field is that this graded Nodal signaling
00:09:5823 is important in setting out the pattern of the marginal zone.
00:10:0217 It seems quite obvious that if there's going to be a graded signal with more on this side
00:10:0620 than that side, it should be used for something.
00:10:0922 So, we're going to get a graded response, and the phospho-Smad2 is the intracellular effector,
00:10:1515 which is known to be distributed like this.
00:10:1804 There really is graded expression of Smad2 going from dorsal to ventral.
00:10:2226 And then this proceeds as a wave across the embryo.
00:10:2505 So, it seems perfectly reasonable to think that in normal development what ought to be
00:10:3002 happening is that that signal will tell the embryo to make different kinds of mesoderm.
00:10:3618 And indeed, that whole idea is supported by this experiment, where we can take,
00:10:4127 from the blastula stage, naive ectoderm from this so-called animal cap and put it in culture.
00:10:4822 By itself, it will self-differentiate into epidermis.
00:10:5125 But if we add a signal, and we can use either Nodal or more conveniently, Activin,
00:10:5619 another member of the TGF-beta superfamily.
00:10:5908 If one adds increasing doses of that Activin signal, the mesoderm-inducing signal,
00:11:0416 one can get caps that develop in a more ventral way, making mesenchyme, whereas as one
00:11:0923 doses in the signal, more and more dorsal tissues, like muscle and ultimately a lot of notochord.
00:11:1519 So, those kinds of experiments, the description of the graded expression, as well as
00:11:2107 this result, where one's reconstructing what may be going on in the embryo, suggest that
00:11:2502 that graded signal may cause pattern.
00:11:2616 But I'm going to argue that's not true.
00:11:2913 So, just to sum up, this normal pattern in the marginal zone -- from notochord through
00:11:3502 muscle, kidney, and blood -- could in principle be set up by that graded Nodal signaling.
00:11:4204 But this was explicitly tested in a series of experiments by Ron Stewart and John Gerhard,
00:11:4724 and other very similar experiments by Jonathan Slack.
00:11:5102 And so what I want to review briefly is this experiment that shows that there's not enough
00:11:5617 information imparted by that early signal to give substantial pattern in the marginal zone.
00:12:0228 Now, what they did. they wanted to assess the effectiveness of organizer grafts.
00:12:0815 And they did this at the late blastula stage.
00:12:1021 So, this is a really early stage, before gastrulation goes on and before there's much to. là.
00:12:1522 there certainly is pattern is the marginal zone later on.
00:12:1822 So, they took normal embryos and cut them in half, vertically, so they got two hemispheres.
00:12:2418 And they used that UV irradiation trick.
00:12:2607 So, they had a graft. they were able to graft these -- labeled grafts, of course --
00:12:3220 onto UV-irradiated hosts.
00:12:3320 So, they made this recombinant.
00:12:3611 In this case, the organizer is schematically illustrated in red.
00:12:4005 So, you've got a half organizer here.
00:12:4214 One of their first questions was, if you only put in a right organizer, do you only get
00:12:4612 a right embryo?
00:12:4714 And there are. the answer was no.
00:12:4822 You get a bilaterally symmetrical embryo.
00:12:5101 But also, in many cases this graft will give you a normal tadpole.
00:12:5517 So, you rescue development also, as shown by the lineage tracing experiment,
00:13:0009 from this ventralized half.
00:13:0215 But this is really the key one in my exper. in my view.
00:13:0615 So here, they've cut just 30 degrees off the dorsal midline axis, so they've cut the organizer
00:13:1228 into the right piece, and this piece has no organizer.
00:13:1607 Now, by the model I was discussing earlier, there should be some graded Activin signaling
00:13:2212 or graded. graded Nodal signaling in here that's inducing things like muscle.
00:13:2707 Well, we're gonna ask that question.
00:13:2819 We're gonna take this side and, again, fuse it to a naive ventralized piece,
00:13:3418 put them together, and ask what happens.
00:13:3806 And the result in most cases is there's absolutely no dorsal pattern in the embryo.
00:13:4411 And just to nail this home, I want to stress that.
00:13:4713 So, they're taking this ventralized piece and putting on this piece from a normal embryo
00:13:5305 that lacks just the organizer, but still has that dorsolateral prospective mesoderm
00:13:5714 that would make muscle if it were left alone.
00:14:0002 But in the context of this recombinant, you just get this completely ventralized embryo,
00:14:0518 as opposed to something that would make a little muscle and so on.
00:14:0819 So, this experiment shows I think quite well that the pattern that's induced by
00:14:1423 that graded Activin/Nodal signaling is not enough to have any permanent effect on this tissue.
00:14:2021 And that you actually need the organizer signaling.
00:14:2226 So, that sort of loss of organizer function proves that you need organizer signaling
00:14:2901 in normal development.
00:14:3219 Another is a sort of descriptive view, where we've looked at gene expression at different phases.
00:14:3715 And here's a case where we see two. expression of two different genes.
00:14:4016 This is noggin expressed in the organizer -- we'll come back to that -- and this
00:14:4422 prospective muscle gene, myod, that's expressed in a complementary way, in the non-organizer tissue.
00:14:5020 When it's first turned on, it's turned on fairly uniformly around the rest of the marginal zone.
00:14:5508 Later on, this expression turns off, and this gets enhanced by signaling from the organizer.
00:15:0022 But when it first turns on, it looks like the marginal zone is organized in a binary way.
00:15:0513 Now, this very rapidly changes.
00:15:0625 So, we see expression of genes such as this one, lhx1, that's high in the dorsal marginal zone
00:15:1127 and then graded off to the side.
00:15:1408 So, that's a later stage.
00:15:1524 We also see that with this split, where the blue and the brown genes are expressed
00:15:2010 in complementary domains at the end of the blastula stage, but very quickly become elaborated
00:15:2600 so that the brown gene, Wnt8, is restricted away from the organizer and just in the marginal zone.
00:15:3027 So, things are very dynamic.
00:15:3228 And one really has to look at this early stage to see this binary difference.
00:15:3624 By this stage, this tissue has already been instructed by the organizer to make muscle.
00:15:4125 But anyway, this descriptive experiment does support the idea that initially the marginal zone
00:15:4715 is split in a binary way and is not graded in this induction.
00:15:5017 So again, arguing that you need a signal from the organizer and it's not enough to have
00:15:5500 that graded Nodal signaling.
00:15:5824 This just reinforces that.
00:16:0106 And as that slides up, I'll say that we need. need now to figure out, what are these other signals?
00:16:0801 And at the time, there were a lot of experiments that were done using both cell biology,
00:16:1223 using secreted signals from cells and assaying them in embryos, and many of these signals do have
00:16:1716 important embryonic functions: fibroblast growth factors Nodals, Activins, and so on.
00:16:2318 But the dorsalizing molecules that are made from the organizer were not understood.
00:16:2816 So, how do we find those?
00:16:3027 And here I give much credit to Bill Smith, who's now a professor at UC Santa Barbara,
00:16:3418 who in the early '90s joined me and decided to use an expression cloning approach
00:16:4013 to try to find these molecules.
00:16:4122 And again, he used this trick of ventralizing embryos.
00:16:4513 But at the four-cell stage, he then took synthetic messenger RNAs made from a library.
00:16:5112 This library was a library of gastrula-specific RNAs in a plasmid that could be transcribed
00:16:5618 with this synthetic phage polymerase, SP6 polymerase, so that we could get a library of,
00:17:0204 in the first instance, 100,000 colonies, extract the DNA, and then transcribe
00:17:0820 that whole library of plasmids to make a complex mixture of synthetic RNA that we hoped mimicked
00:17:1315 what was in the embryo.
00:17:1524 Remarkably, that first injection of the synthetic RNA, when it was injected back at the four-cell stage,
00:17:2107 instead of these embryos looking like this -- complete belly pieces as Spemann would
00:17:2525 have called them -- they looked more like this.
00:17:2723 They had some tail structures, some muscle, and spinal cord.
00:17:3107 So, that RNA conferred a morphological rescue.
00:17:3421 At that point, we knew there was an active ingredient in the library, and it was
00:17:3909 just a question of sub-selection, where we would split the library into smaller and smaller pools,
00:17:4400 assaying those pools as we go along, and ask, is there a pool in there that
00:17:4908 confers this ability to dorsalize embryos?
00:17:5219 And sure enough, we. he did this a couple of times.
00:17:5502 The first time, he isolated a Wnt signal, which I won't discuss but is thought to mimic
00:17:5907 that early Wnt signal in dorsalizing the embryos.
00:18:0128 But for the purposes of this presentation, the second one he isolated was really exciting
00:18:0623 because it was completely new.
00:18:0824 And as a single RNA, as you can see in this picture, with increasing dose of the gene
00:18:1324 we called noggin RNA, you get this progressive rescue of structures to the normal state.
00:18:1917 And then when one overdoses the embryo, ultimately you end up with these little noggins,
00:18:2420 these little heads alone.
00:18:2520 So, that. that single RNA is able to transform, from the four-cell stage, a ventralized embryo.
00:18:3023 And if it's put in at enough dose, you get just a big head.
00:18:3604 This has been a very useful assay to isolate a number of other embryological activities,
00:18:4006 but that's the one I want to concentrate on, noggin.
00:18:4310 And so this is an in situ hybridization where we're looking at the messenger RNA
00:18:4810 that's expressed from the noggin gene in early development.
00:18:5100 And so let's look at this stage.
00:18:5319 This is a late blastula.
00:18:5504 Noggin has already turned on.
00:18:5613 And as you can see, it's turned on in just one side of the embryo.
00:18:5909 And we know this is the dorsal side.
00:19:0109 So, this gene is expressed. it not only has the right activity in these messenger
00:19:0614 RNA injections, but it's also expressed in the right place -- here's a vegetal pole view,
00:19:1025 remarkably it's a 60-degree sector, just the same as the sector that Ron Stewart identified
00:19:1622 in his activity assay -- and then in the gastrula stage it continues to be expressed
00:19:2408 in the dorsal marginal zone, in this involuting dorsal mesoderm that is lying just underneath
00:19:2915 the neural plate, and in the right place to induce the neural plate.
00:19:3218 Now, here's a neural. neurula stage where it continues to be expressed in the head,
00:19:3626 mesoderm, and notochord, again, in the right place to continue inducing the neural plate.
00:19:4304 So, the activity is promising, the extra expression is promising, but could we show that it
00:19:4817 had the right properties?
00:19:4924 So, we initially used a protein that we made in CHO cells that Teresa Lamb had transformed
00:19:5523 with noggin plasmids.
00:19:5624 But later in the collaboration with Regeneron Pharmaceuticals, they made a human noggin,
00:20:0210 particularly, Aris Economides, and gave us that recombinant human noggin for our experiments.
00:20:0706 So we were able to ask, now, can noggin protein mimic what we know are the embryological effects
00:20:1317 of grafting this tissue?
00:20:1705 So, again, this is the normal case, where noggin is expressed in this red dorsal mesoderm,
00:20:2218 and potentially instructing this overlying ectoderm to become neural plate.
00:20:2606 But how do we assay that activity?
00:20:2809 Well, again, we turned to our animal cap assay.
00:20:3021 And actually, we can turn to that assay in the gastrula stage, where the sensitivity
00:20:3616 of these cells up here has changed, and they're no longer responsive to the Activin/Nodal signal.
00:20:4402 But we know from recombination experiments that if we graft an organizer onto here
00:20:4903 neural induction will occur.
00:20:5111 So now we can replace the graft of organizer by soaking this tissue in noggin protein.
00:20:5720 And so this is a schematic, which we can do in the late blastula or the gastrula,
00:21:0124 where we take this prospective ectoderm off into culture.
00:21:0503 Normally, just makes a hollow ball of epidermis when left alone.
00:21:0825 As I mentioned before, with. with Activin or Nodal, you get a complex induction of
00:21:1504 dorsal mesodermal cell types.
00:21:1717 And those in turn can secondarily induce neural tissue.
00:21:1926 But the induction is not direct.
00:21:2120 The important thing for our purposes is that, when we treat this just with recombinant noggin,
00:21:2707 we get a clean neural induction.
00:21:2820 There's a little epidermis that's on the outside and an epithelial layer that's not so responsive,
00:21:3405 but all of the underlying cells, here, are trans. transformed into neural cells.
00:21:3809 So, we get a cleaner. clean neural tissue, and that can't be induced by any mesoderm
00:21:4300 because there's no mesoderm in this explant.
00:21:4611 We can also do this as at a time when the mesoderm can no longer be induced.
00:21:5004 So, if we do this at the gastrula stage instead of the late blastula stage, this experiment
00:21:5511 wouldn't work.
00:21:5611 Activin would have no effect.
00:21:5714 And yet noggin can still induce neural tissue.
00:22:0002 So this, then, really identified noggin as an authentic neural inducer, that it's expressed
00:22:0421 in the right place and time, and has the right activity to be doing the job in the normal embryo.
00:22:1117 Here are some pictures of the kind of results that we get.
00:22:1417 These are the works of. these are done by Anne Knecht in the lab.
00:22:1722 And so, here we have a molecular assay for neural tissue.
00:22:2022 This is a gene that's expressed throughout the nervous system.
00:22:2413 And here are some of these explants, the explants that lack noggin, and they don't stain
00:22:2922 for this gene.
00:22:3022 But the parallel explants that were soaked in noggin protein, as you can see, are robustly
00:22:3514 induced to make this marker gene, and so we can say they're neural.
00:22:3805 And that contrasts. again, I'll draw the contrast with the Activin mesoderm inducer.
00:22:4413 Here, we're looking down on the top of the embryo with the muscle and notochord in the middle.
00:22:4819 These are mesodermal structures that we've lit up with this collagen probe.
00:22:5226 If we take explants just like these ones, but treat them with Activin at the late blastula stage,
00:22:5714 we get lots of this mesoderm induced.
00:22:5909 But down here, we see that noggin induces no mesoderm.
00:23:0220 So, we do get neural tissue in the absence of mesoderm, and hence a clean neural induction.
00:23:0804 Just as an interesting side point -- I won't be discussing this much today -- that we
00:23:1315 also have to account for production of the entire neural plate from brain to spinal cord.
00:23:1811 So, what kind of tissue does noggin induce?
00:23:2111 Here we can use regional markers like this cement gland, this very anterior marker,
00:23:2612 or this forebrain-midbrain marker, otx2, and then this engrailed-2 is expressed just
00:23:3123 at the border of the hindbrain.
00:23:3326 And the noggin-treated explants will make these very anterior marker genes.
00:23:3904 they'll turn them on, but they don't turn on the more posterior ones.
00:23:4304 And so noggin, exclusively in this explant situation, induces anterior brain-like tissue.
00:23:5114 So, we have a molecule that works very well, but of course we then had to figure out how it works.
00:23:5820 And so, for this experiment, we for a long time labored under the delusion that
00:24:0220 we may have invented a new kind of signal transducer.
00:24:0600 At the time, it wasn't really appreciated that development gets by with a remarkably
00:24:0914 limited number of pathways.
00:24:1125 And so, here, what eventually turned out, with some very useful information from
00:24:1627 Chip Ferguson's lab, it was suggested that it may be impacting the BMP pathway.
00:24:2201 And Lyle Zimmerman was able to show that, because we had all these reagents in the lab
00:24:2523 at the. al tempo.
00:24:2725 And the way that noggin actually works is not by activating any new signal transduction pathway,
00:24:3304 but rather by interfering with the BMP signaling pathway.
00:24:3611 Normally, BMP binds to its two receptors, brings them together, and that has the consequence
00:24:4117 of ventralizing the embryo.
00:24:4325 In this case, when noggin is present, it binds tightly to BMP, prevents this interaction,
00:24:5009 and then by default, instead of being ventralized, the embryo is dorsalized.
00:24:5513 So I'll stress that, that it's the absence of this BMP signal that is instructive to the embryo
00:25:0104 and allows the embryonic structures to make dorsal structures rather than BMP-induced
00:25:0712 ventral structures.
00:25:0901 And satisfyingly, this crystal structure from Jay Groppe shows that noggin, as a dimer,
00:25:1423 sort of embraces the dimer of BMP.
00:25:1626 So, it's not surprising that it, as Lyle Zimmerman showed, prevents the BMP from binding their receptors.
00:25:2606 It's a very high-affinity reaction, as was shown here by this competition experiment.
00:25:2913 And this was done again by Lyle Zimmerman.
00:25:3126 Here took iodinated BMP4 and was able to bind it to a chimeric human noggin, which has an
00:25:3926 immunoglobulin tail which makes it easy to precipitate.
00:25:4303 And so if one simply mixes these together, you get a very active binding and precipitation.
00:25:4916 But by mixing in different doses of different kinds of other TGF-betas, we could work out
00:25:5510 the affinity of this interaction.
00:25:5708 And so, notably, if we take BMP4, the red one, and plot how that interferes
00:26:0214 with binding of iodinated BMP4, we get this nice curve.
00:26:0714 And if we plot the half-maximal inhibition, it comes out that the interaction there is.
00:26:1202 it has a remarkably tight Kd of about 20 picomolar.
00:26:1626 Other BMPs, like BMP7, in blue here, have a lower affinity.
00:26:2305 And then yet other TGF-beta family members, like TGF-beta itself, have no measurable affinity.
00:26:2820 So, there is a variation in affinity, but very tight affinity for the BMP2 and -4 class.
00:26:3500 So, we come up with this general model that in normal development you set up the mesoderm
00:26:4026 with a special dorsal territory, this naive and fairly uniform ventral-lateral territory,
00:26:4626 and the rest of the patterning is mediated during gastrulation by dorsalizing signals
00:26:5128 like noggin that come from the dorsal-marginal zone, instruct the overlying epidermis
00:26:5713 to instead become nervous system, and instruct this ventral mesoderm to become things like muscle.
00:27:0222 So, is that it?
00:27:0420 Really, we've done this by add-back, but what about loss of function?
00:27:0900 And in the interim, a large number of other antagonists were discovered.
00:27:1213 And a lot of these were discovered by Eddy De Robertis' lab, so chordin and cerberus.
00:27:1916 Noggin, we discovered, Bill Smith discovered, as well as this Nodal-3 molecule.
00:27:2422 And follistatin had already been known about, but its activity as a dorsalizing molecule
00:27:2928 was worked out by Ali Brivanlou in Doug Melton's lab.
00:27:3302 So, looking at all these, they're all expressed in the organizer, and they all have some similar
00:27:3911 anti-BMP activities.
00:27:4113 You can see that they turn on at different times.
00:27:4316 This is the early stage, so some are turned on very early.
00:27:4718 And then some are turned on in slightly different territories.
00:27:5004 And perhaps that's important in how they work in detail, but so far, as far as we can tell,
00:27:5424 they all work essentially the same way.
00:27:5617 But there are a lot of them, and they probably have overlapping activity.
00:28:0108 And so if we try to knock down their activity, do we. can we knock down one and get a result,
00:28:0517 or do we have to knock down many?
00:28:0824 To do this experiment, we use morpholino oligonucleotides.
00:28:1114 These are synthetic, uncharged, and very stable oligonucleotides that can hybridize
00:28:1526 to the messenger RNA and interfere with translation, in this case.
00:28:2000 So, we can specifically use the information from base pairing to specifically knock down
00:28:2602 these individual RNAs.
00:28:2720 So, Mustafa Khokha, when he was in the lab, did this experiment using mixtures of morpholinos
00:28:3227 against follistatin, chordin, and noggin.
00:28:3517 And just as a side note, to make this simpler, we did it in the related species to Xenopus laevis,
00:28:4020 Xenopus tropicalis, which now had a sequenced genome, and so we could identify
00:28:4514 and design these oligonucleotides easily to target just single genes rather than two genes
00:28:5003 in the paleotetraploid, Xenopus laevis, genome.
00:28:5419 So, we can inject these morpholinos and then ask what happens.
00:28:5925 And we're going to use, for example, in the neurula stage, this neural marker, which at
00:29:0323 the mid-neurula stage has this nice ability to light up the neural plate.
00:29:1008 Because of worries about specificity of these reagents, which always become toxic if you
00:29:1404 put enough of them in, we do a specificity assay of rescuing.
00:29:1716 So, by cloning the pufferfish noggin, we could use that different sequence to put back BMP-antagonist activity,
00:29:2417 as we'll find out, and rescue the whole process.
00:29:2728 So, these are the kinds of results.
00:29:3009 So, we're going to do single, double, and triple knockdowns.
00:29:3410 And the results are pretty simple.
00:29:3527 When comparing the uninjected to the morpholino-injected, when we knocked down noggin we see no effect.
00:29:4203 Essentially no effect with follistatin.
00:29:4402 Some mild effect, as reported by De Robertis' group, for chordin.
00:29:4716 But then, when we knocked down two -- follistatin/noggin, chordin/noggin, chordin/follistatin --
00:29:5220 we see a more extreme effect.
00:29:5324 There's a smaller neural plate.
00:29:5511 Well, when we knocked down all three, there's a spectacular result, where now, instead of
00:29:5919 making the neural plate, the neural plate is eliminate. eliminated.
00:30:0328 Not only is the neural plate eliminated, but the underlying muscle is almost completely gone.
00:30:0908 And by this hedgehog control, the notochord and the floor plate are also gone.
00:30:1428 So, this is important to rescue.
00:30:1627 We can rescue it with this mixture of morpholinos, rescuing it with the pufferfish noggin.
00:30:2303 And as you see, we get back all of these tissues, demonstrating specificity.
00:30:2817 We can also rescue it by knocking down additional BMPs.
00:30:3206 So, instead of this horrendously high mixture of morpholinos, we're putting in
00:30:3614 even more morpholinos, but also knocking down BMPs.
00:30:3925 And again, you can see that rescue.
00:30:4102 So, we're pretty satisfied that this is a specific manipulation.
00:30:4421 So, knocking down the BMP antagonists eliminates the neural plate.
00:30:4921 You need the antagonists to make the neural plate.
00:30:5327 As we would expect, as you can see on the right of this picture, the loss of those
00:30:5814 dorsal structures is accompanied by a gain in ventrolateral structures.
00:31:0302 So here, for instance, let's. let's look at msx1.
00:31:0522 It's expressed just in the flank.
00:31:0802 But in this manipulated embryo, there's just a narrow stripe left of nonexpressing tissue.
00:31:1306 So, all these ventral tissues are expanded.
00:31:1708 We can also ask, when does this dorsal identity fail?
00:31:2010 When we knock down those antagonists, we clearly lose dorsal structures, but at what step does
00:31:2417 this happen?
00:31:2517 And of course, we would predict that it should fail at the time that normal genes are expressed,
00:31:2906 at the late blastula stage.
00:31:3128 We can start to look at that, and contrast the situation where we interfere with antagonist function
00:31:3802 in normal development, with what happens when we ventralize the embryo from
00:31:4212 the get-go, either with UV light or by depleting beta-catenin, actually also with a beta-catenin
00:31:4727 specific morpholino.
00:31:4902 So, in that case, we lose the beta-catenin purple signal, and we get just this ventralized embryo.
00:31:5611 Okay.
00:31:5711 So, in looking at those, we can see that in the. in the. in the morpholino-knockdown cases,
00:32:0515 where we've knocked down follistatin, chordin, and noggin, we have normal mesoderm,
00:32:0905 as marked by this brachyury gene, but in the case where we look for dorsal identity
00:32:1521 with the goosecoid marker -- here's the control, here's the follistatin/chordin/noggin knockdown --
00:32:2013 there's still dorsal identity.
00:32:2322 Whereas if we contrast that with the beta-catenin knockdown, where we've knocked down
00:32:2705 the early dorsal signal, then of course we never get a dorsal identity.
00:32:3023 So, there's a contrast here, showing that in the absence of the antagonists
00:32:3528 we still get a dorsal identity.
00:32:3713 But then that dorsal identity fails to execute. execute its function.
00:32:4404 And indeed, we can also look at these embryos to ask what happens to BMP signaling.
00:32:4818 And in particular, we can use this useful mark, vent2, because that's normally expressed
00:32:5313 everywhere except the organizer.
00:32:5515 And we also know it's a direct target of BMP signaling.
00:32:5921 So again, when we knock down the follistatin, chordin, and noggin, we see that that gap
00:33:0323 is filled in.
00:33:0508 So in other words, in the absence of the antagonists, there's a sign pretty early on of excess BMP signaling,
00:33:1100 which is going to mess up dorsal developments and lead to a ventralized embryo.
00:33:1519 And again, we get the similar effect, as we would expect, if we eliminate the organizer
00:33:2000 completely with beta-catenin.
00:33:2104 The same result is found with this early muscle marker, which.
00:33:2528 muscle development used to be thought to be development mostly on the graded signal
00:33:2911 from Nodal.
00:33:3011 But you can see here, clearly, that we need that BMP antagonist in order to amplify the
00:33:3506 expression of this muscle determinant in the early embryo.
00:33:3928 So overall, we conclude now that this pathway, of knockdown of BMP activity by these BMP antagonists,
00:33:4726 by a cocktail of BMP antagonists, is crucial to get dorsal development,
00:33:5224 and in order to get neural induction to occur.
00:33:5508 We can show that these molecules by themselves, as protein, induce neural tissue.
00:33:5826 We can show that the combination is essential.
00:34:0127 And they are expressed in the right time and the right place to be ex. executing this function.
00:34:0704 So all in all, it's a comprehensive statement that these are crucial for neural induction
00:34:1303 and dorsal development.
00:34:1513 We can add on the additional observation from the end, that even in the absence of.
00:34:2200 well, in the absence of these antagonists, the early events go by perfectly normal. normally,
00:34:2725 and we get dorsal specification in the marginal zone.
00:34:3108 But in the absence of the antagonists, that organizer can no longer execute its function.
00:34:3621 So all in all, we can conclude then that BMP antagonists are essential for
00:34:4202 the Spemann organizer phenomenon.
00:34:4327 Thank you.

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