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Quando e perché si verifica la fase G0?

Quando e perché si verifica la fase G0?


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Ho fatto questa domanda, in particolare perché ho visto questa domanda.

Come vediamo in questo diagramma, la fase G0 si verifica dopo la fase M e in un punto specifico all'interno della fase G1.

C'è un significato nel dire "fine" in questo caso?

Qual è il punto di controllo per far sì che una cellula entri in G0 invece di continuare con il ciclo cellulare, in caso di cellule cardiache e neuroni? (che cosa è esattamente "controllato"?).


G0 fase

Il G0 fase descrive uno stato cellulare al di fuori del ciclo cellulare replicativo. Classicamente, si pensava che le cellule entrassero in G0 principalmente a causa di fattori ambientali, come la privazione dei nutrienti, che limitavano le risorse necessarie per la proliferazione. Quindi è stato pensato come un fase di riposo. G0 è ora noto per assumere forme diverse e si verificano per molteplici ragioni. Ad esempio, la maggior parte delle cellule neuronali adulte, tra le cellule metabolicamente più attive del corpo, sono completamente differenziate e risiedono in un terminale G0 fase. I neuroni risiedono in questo stato, non a causa dell'apporto stocastico o limitato di nutrienti, ma come parte del loro programma di sviluppo.

G0 è stato inizialmente suggerito come stato cellulare sulla base di studi sul ciclo cellulare precoce. Quando i primi studi hanno definito le quattro fasi del ciclo cellulare utilizzando tecniche di marcatura radioattiva, si è scoperto che non tutte le cellule di una popolazione proliferano a velocità simili. [1] La “frazione di crescita” di una popolazione – o la frazione della popolazione che stava crescendo – stava attivamente proliferando, ma altre cellule esistevano in uno stato non proliferativo. Alcune di queste cellule non proliferanti potrebbero rispondere a stimoli estrinseci e proliferare rientrando nel ciclo cellulare. [2] Le prime visioni contrastanti consideravano le cellule non proliferanti semplicemente come in un esteso G1 fase o in una fase del ciclo cellulare distinta da G1 – chiamato G0. [3] Ricerche successive hanno indicato un punto di restrizione (punto R) in G1 dove le cellule possono entrare in G0 prima del punto R ma sono impegnati nella mitosi dopo il punto R. [4] Questi primi studi hanno fornito prove dell'esistenza di un G0 stato a cui è limitato l'accesso. Queste cellule che non si dividono ulteriormente escono dalla fase G1 per entrare in una fase inattiva chiamata fase di riposo.


Fase G0

Fase G0
Non tutte le cellule aderiscono al classico schema del ciclo cellulare in cui una cellula figlia appena formata entra immediatamente nell'interfase, seguita da vicino dalla fase mitotica. Le cellule nella fase G0 non si stanno preparando attivamente a dividersi. La cellula è in uno stadio quiescente (inattivo), essendo uscita dal ciclo cellulare.

Fase G0
(fase di crescita 0) Fase durante l'interfase del ciclo cellulare quando la cellula si è ritirata dal normale ciclo cellulare e non si replica. Conferenza - Ciclo cellulare
fase G1.

La fase G0 è vista come una fase G1 estesa in cui la cellula non si divide né si prepara a dividersi e o come una fase di riposo distinta che si verifica al di fuori del ciclo cellulare.[5]
Interfase e altri processi cellulari[modifica] .

Riposo (fase G0)
Il termine "post-mitotico" è talvolta usato per riferirsi a cellule sia quiescenti che senescenti. Le cellule non proliferative negli eucarioti multicellulari generalmente entrano nello stato di quiescenza G0 da G1 e possono rimanere quiescenti per lunghi periodi di tempo, forse indefinitamente (come spesso accade per i neuroni).

Tuttavia, mentre si riproducono anche quando la cellula è a riposo in fase G0, hanno bisogno di importare la maggior parte dei macchinari di duplicazione dal citoplasma, rendendoli così intimamente legati ai bisogni della cellula.

Attenzione: divisione cellulare, membrana cellulare, fase G0
Espandi: Segnalazione del calcio, Embriogenesi, Gameti, Ematopoesi, Segnalazione lipidica
Unisci: strato di germi
Pulizia: cellula, DNA
Richieste: DNA chimerico, protocaderina, RuBisCO attivasi, PEP carbossilasi altro.

quiescente (agg.) - di una cellula, non in divisione, in fase G0 (essendo uscita dal ciclo cellulare).
Radiata - gruppo di animali semplici a simmetria radiale, comprendenti gli cnidari (o celenterati) e gli ctenofori.

Se la cellula riceve un segnale di via libera al checkpoint G1, di solito completa il ciclo cellulare e si divide.
Se non riceve un segnale di via libera, la cellula esce dal ciclo e passa a uno stato di non divisione, la fase G0.


Il meccanismo della ricombinazione V(D)J

Alicia J. Little, . David G. Schatz, in Biologia molecolare delle cellule B (Seconda edizione), 2015

18.2 Limitare l'attività RAG a una fase appropriata del ciclo cellulare

La ricombinazione V(D)J si verifica normalmente durante la fase G0 del ciclo cellulare. Questa restrizione richiede la presenza di un motivo di degradazione situato nel C-terminale non core di RAG2, la cui ablazione determina una persistenza anormale dei DSB indotti da RAG durante tutto il ciclo cellulare [129]. I topi portatori di una mutazione puntiforme che disabilita questa funzione sperimentano una linfomagenesi accelerata in uno sfondo carente di p53, con traslocazioni cromosomiche che forniscono prove di instabilità genomica [221]. I meccanismi alla base della linfomagenesi accelerata rimangono poco chiari. La persistenza delle estremità del segnale durante tutto il ciclo cellulare è stata osservata anche in topi privi del C-terminale di RAG2 [60], con integrazione aberrante di frammenti di DNA contenenti estremità del segnale o articolazione del segnale nel DNA cromosomico [216]. Infatti, i topi privi dell'intero C-terminale superfluo di RAG2 sperimentano un'accelerazione molto più forte della linfomagenesi, suggerendo che i meccanismi soppressivi oltre alla regolazione del ciclo cellulare possono essere disabilitati [99,211].


Profase

Durante la profase, la "prima fase", l'involucro nucleare inizia a dissociarsi in piccole vescicole e gli organelli membranosi (come l'apparato di Golgi e il reticolo endoplasmatico), si frammentano e si disperdono verso i bordi della cellula. Il nucleolo scompare. I centrosomi iniziano a spostarsi ai poli opposti della cellula. I microtubuli che formeranno il fuso mitotico si estendono tra i centrosomi, spingendoli più lontano man mano che le fibre dei microtubuli si allungano. I cromatidi fratelli iniziano ad avvolgersi più strettamente con l'aiuto delle proteine ​​​​condensine e diventano visibili al microscopio ottico.

Figura 6 profase. Credito fotografico Kelvin13 Wikimedia.


Modelli di neuropatologia e introduzione

Arie Perry, Daniel J. Brat, in Neuropatologia chirurgica pratica, 2010

Marcatori di proliferazione

La maggior parte degli antigeni di proliferazione sono proteine ​​nucleari che sono attivamente espresse durante uno o più non-G0 fasi del ciclo cellulare. Questi marcatori sono comunemente usati come sussidi ausiliari per semplici conte mitotiche. Ad esempio, l'anticorpo monoclonale murino Ki-67 si lega a una proteina nucleare umana espressa durante il G1, S, G2, e M fasi del ciclo cellulare. Il Anticorpo MIB-1 contro Ki-67 funziona in sezioni di paraffina ed è un popolare marker ausiliario per quantificare la proliferazione nei tumori cerebrali. 9 Tuttavia, l'OMS ha resistito all'assegnazione di specifici limiti di indice di etichettatura nella classificazione dei singoli tipi di tumore perché c'è troppa variabilità interlaboratorio. In altre parole, le differenze ad ampio raggio nei risultati di colorazione e nei metodi di conteggio rendono difficile l'estrapolazione dei risultati da un centro medico all'altro. Tenendo presente che ogni tipo di tumore è diverso, un approccio utile, anche se grossolanamente semplificato, consiste nel considerare indici di proliferazione bassi, moderati e alti rispettivamente inferiori al 5%, dal 5% al ​​10% e superiori al 10%.

Un altro approccio utile recentemente applicato sia ai gliomi che ai meningiomi è fosfoistone-H3 (PPH3) immunoistochimica, in cui l'anticorpo marca specificamente solo le figure mitotiche. 9 Questa è un'alternativa interessante, poiché molti schemi di classificazione utilizzano i cutoff dell'indice mitotico. Come tutti i patologi praticanti ammettono rapidamente, il conteggio delle figure mitotiche nelle sezioni di ematossilina ed eosina (H&E) può essere estremamente complicato e dispendioso in termini di tempo, in particolare se il campione è grande o la conservazione dei tessuti è scarsa, così che è difficile distinguere le cellule degenerate da mitosi. Con l'immunoistochimica PPH3, gli hotspot mitotici vengono identificati in modo rapido e affidabile. Sfortunatamente, però, i cutoff mitotici tradizionali dovrebbero essere ristabiliti per ciascun tipo di tumore, poiché la sensibilità per la raccolta delle mitosi e quindi gli indici mitotici stessi è notevolmente più elevata utilizzando l'approccio immunoistochimico. Un'ulteriore trappola è che i campioni archiviati possono perdere parte della loro antigenicità nel tempo utilizzando gli anticorpi MIB-1 o PPH3.


Quando e perché si verifica la fase G0? - Biologia

Il ciclo cellulare ha due fasi principali: l'interfase (G0, G1, S, G2) e la fase mitotica (M).

Il ciclo cellulare è una serie ordinata di eventi che coinvolgono la crescita cellulare e la divisione cellulare che produce due nuove cellule figlie. Le cellule in fase di divisione cellulare procedono attraverso una serie di fasi di crescita, replicazione del DNA e divisione accuratamente sincronizzate e attentamente regolate che producono due cellule identiche (clone).

Durante interfase, la cellula cresce e il DNA si replica. Nella fase mitotica, il DNA replicato e il contenuto citoplasmatico si separano e la cellula si divide.

Le fasi dell'interfase e del ciclo cellulare: Il ciclo cellulare è costituito dall'interfase e dalla fase mitotica. Durante l'interfase, la cellula cresce e il DNA nucleare viene duplicato. L'interfase è seguita dalla fase mitotica. Durante la fase mitotica, i cromosomi duplicati vengono segregati e distribuiti nei nuclei figli. Anche il citoplasma è solitamente diviso, dando luogo a due cellule figlie

G0 Fase

Non tutte le cellule subiscono la fase mitotica. Cellule nel G0 fase non si stanno preparando attivamente a dividersi. La cellula è in uno stadio quiescente (inattivo) che si verifica quando le cellule escono dal ciclo cellulare. Alcune cellule entrano in G0 temporaneamente fino a quando un segnale esterno non attiva l'inizio di G 1 . In questa fase non avviene più la replicazione del DNA o la divisione cellulare. Le cellule che non si dividono mai o raramente includono il muscolo cardiaco maturo e le cellule nervose e rimangono in G0 permanentemente.

G1 Fase (primo intervallo)

La prima fase dell'interfase è la fase G 1 (primo gap), la fase di crescita. Tutte le cellule subiscono G 1 . Qui, la cellula è abbastanza attiva a livello biochimico. La cellula cresce e accumula i mattoni del DNA cromosomico e le proteine ​​associate, nonché riserve energetiche sufficienti per completare il compito di replicare ciascun cromosoma nel nucleo. Le cellule aumentano di dimensioni e producono organelli.

La cellula ha due scelte a questo punto: dividere o non dividere. Tra la fase G 1 e la fase S, la cellula decide se vuole crescere.

Alcune cellule che non si dividono includono cellule ossee e cellule del sangue (non subiscono mitosi). Queste cellule non passano attraverso S o G 2 . Si fermano a G 1 o G 0 .

Fase S (Sintesi del DNA)

La fase di sintesi dell'interfase richiede più tempo a causa della complessità del materiale genetico duplicato. La fase S è dove si verifica la replicazione del DNA e i centrioli si replicano. Il due centrosomi dare origine al fuso mitotico, l'apparato che orchestra il movimento dei cromosomi durante la mitosi. Al centro di ogni cellula animale, i centrosomi delle cellule animali si associano a una coppia di oggetti simili a bastoncelli, il centrioli, che sono ad angolo retto tra loro. I centrioli aiutano a organizzare la divisione cellulare.

G2 Fase (seconda distanza)

Nel G2 fase, la cellula reintegra le sue riserve di energia e sintetizza le proteine ​​necessarie per la manipolazione dei cromosomi. Questa fase è quella in cui la cellula si prepara per la divisione. Qui, la cellula ha il doppio del DNA e di nuovo aumenta di dimensioni. Alcuni organelli cellulari vengono duplicati e il citoscheletro viene smantellato per fornire risorse per la fase mitotica. Potrebbe esserci un'ulteriore crescita cellulare durante G2.

Fase M

Dopo l'interfase, la cellula entra nella fase mitotica multistep, dove il nucleo cellulare si divide e i componenti cellulari si dividono in due cellule figlie identiche.


Domande di pratica


Preparazione ufficiale MCAT (AAMC)

Pacchetto di domande sulla biologia, vol. 1 Passaggio 4 Domanda 22

Pacchetto di domande sulla biologia, Vol 2. Domanda 41

Pacchetto di domande sulla biologia, Vol 2. Passaggio 17 Domanda 111

Prova pratica 1 Sezione B/B Passaggio 8 Domanda 40

Prova pratica 4 B/B Sezione Domanda 59


Punti chiave

• Ci sono tre fasi di interfase: G1 (primo gap), S (sintesi di nuovo DNA), e G2 (seconda lacuna).

• Le cellule trascorrono la maggior parte della loro vita in interfase, in particolare nella fase S in cui il materiale genetico deve essere copiato.

• Alcune cellule che non si dividono o non replicano si fermano a G1 o G0 G0 e G1 a volte sono la stessa cosa.

• La cellula cresce e svolge funzioni biochimiche, come la sintesi proteica, nel G1 fase.

• Durante la fase S, vengono replicati sia il DNA che i centrioli.

• Nel Sol2 fase, l'energia viene reintegrata, vengono sintetizzate nuove proteine ​​e si verifica un'ulteriore crescita.

• Dopo l'interfase, segue la mitosi.

interfase: la fase del ciclo di vita di una cellula in cui la cellula cresce e il DNA viene replicato

centrosoma: un organello vicino al nucleo di una cellula che contiene i centrioli (nelle cellule animali) e da cui si sviluppano le fibre del fuso nella divisione cellulare.

fuso mitotico: l'apparato che orchestra il movimento dei cromosomi durante la mitosi

quiescente: in stato o periodo di inattività o dormienza

centrioli: i principali centri che aiutano nella formazione della fibra dei microtubuli


Regolamento ai posti di controllo interni

È essenziale che le cellule figlie siano duplicati esatti della cellula madre. Errori nella duplicazione o distribuzione dei cromosomi portano a mutazioni che possono essere trasmesse a ogni nuova cellula prodotta dalla cellula anormale. Per evitare che una cellula compromessa continui a dividersi, esistono meccanismi di controllo interni che operano in tre punti di controllo principali del ciclo cellulare in corrispondenza dei quali il ciclo cellulare può essere interrotto fino a quando le condizioni non sono favorevoli. Questi checkpoint si verificano verso la fine di G1, al G2–M transizione e durante la metafase (Figura 6.7).

Figura 6.7 Il ciclo cellulare è controllato in tre punti di controllo. L'integrità del DNA viene valutata al checkpoint G1. La corretta duplicazione dei cromosomi viene valutata al checkpoint G2. L'attaccamento di ciascun cinetocore a una fibra del fuso viene valutato al checkpoint M.


1. Diversità degli stati G 0

Esistono tre stati G 0 e possono essere classificati come quiescenti reversibili o senescenti e differenziati irreversibili. Ciascuno di questi tre stati può essere inserito dalla fase G 1 prima che la cellula si impegni al ciclo successivo del ciclo cellulare. La quiescenza si riferisce a uno stato G 0 reversibile in cui sottopopolazioni di cellule risiedono in uno stato di quiescenza prima di entrare nel ciclo cellulare dopo l'attivazione in risposta a segnali estrinseci. Le cellule quiescenti sono spesso identificate da un basso contenuto di RNA, mancanza di marcatori di proliferazione cellulare e maggiore ritenzione dell'etichetta che indica un basso turnover cellulare. La senescenza è distinta dalla quiescenza perché la senescenza è uno stato irreversibile in cui le cellule entrano in risposta al danno o alla degradazione del DNA che renderebbe non vitale una progenie cellulare. Tale danno al DNA può verificarsi dall'accorciamento dei telomeri su molte divisioni cellulari, nonché dall'esposizione a ROS di specie reattive dell'ossigeno, dall'attivazione dell'oncogene e dalla fusione cellula-cellula. Sebbene le cellule senescenti non possano più replicarsi, rimangono in grado di svolgere molte normali funzioni cellulari. La senescenza è spesso un'alternativa biochimica all'autodistruzione di una cellula così danneggiata per apoptosi. Contrariamente alla senescenza cellulare, la quiescenza non è un evento reattivo ma fa parte della programmazione centrale di diversi tipi cellulari. Infine, le cellule differenziate sono cellule staminali che hanno progredito attraverso un programma di differenziazione per raggiungere uno stato maturo - differenziato terminale. Le cellule differenziate continuano a rimanere in G 0 e svolgono le loro funzioni principali indefinitamente.

2.1. Caratteristiche delle cellule staminali quiescenti trascrittomi

I trascrittomi di diversi tipi di cellule staminali quiescenti, come quelle ematopoietiche, muscolari e del follicolo pilifero, sono stati caratterizzati attraverso tecniche ad alto rendimento, come il microarray e il sequenziamento dell'RNA. Sebbene esistano variazioni nei loro singoli trascrittomi, la maggior parte delle cellule staminali dei tessuti quiescenti condivide un modello comune di espressione genica che coinvolge la sottoregolazione dei geni di progressione del ciclo cellulare, come la ciclina A2, la ciclina B1, la ciclina E2 e la sopravvivenza, e la sovraregolazione dei geni coinvolti nella regolazione della trascrizione e del destino delle cellule staminali, come FOXO3 ed EZH1. La downregulation del citocromo C mitocondriale riflette anche il basso stato metabolico delle cellule staminali quiescenti.

2.2. Caratteristiche delle cellule staminali quiescenti epigenetico

Molte cellule staminali quiescenti, in particolare le cellule staminali adulte, condividono anche modelli epigenetici simili. Ad esempio, H3K4me3 e H3K27me3, sono due principali modelli di metilazione dell'istone che formano un dominio bivalente e si trovano vicino ai siti di inizio della trascrizione. È stato scoperto che questi marcatori epigenetici regolano le decisioni sul lignaggio nelle cellule staminali embrionali e controllano la quiescenza nel follicolo pilifero e nelle cellule staminali muscolari attraverso la modifica della cromatina.

3.1. Regolazione della quiescenza Regolatori del ciclo cellulare

I geni oncosoppressori funzionali, in particolare il gene p53 e Rb, sono necessari per mantenere la quiescenza delle cellule staminali e prevenire l'esaurimento del pool di cellule progenitrici attraverso divisioni eccessive. Ad esempio, è stato dimostrato che la delezione di tutti e tre i componenti della famiglia di proteine ​​Rb arresta la quiescenza nelle cellule staminali ematopoietiche. È stato dimostrato che la mancanza di p53 impedisce la differenziazione di queste cellule staminali a causa dell'incapacità delle cellule di uscire dal ciclo cellulare nella fase G 0. Oltre a p53 e Rb, anche gli inibitori della chinasi ciclina-dipendenti CKI, come p21, p27 e p57, sono importanti per mantenere la quiescenza. Nelle cellule staminali ematopoietiche di topo, il knockout di p57 e p27 porta all'uscita di G 0 attraverso l'importazione nucleare della ciclina D1 e la successiva fosforilazione di Rb. Infine, è stato dimostrato che la via di segnalazione di Notch svolge un ruolo importante nel mantenimento della quiescenza.

3.2. Regolazione della quiescenza Regolazione post-trascrizionale

È stato dimostrato che la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica tramite la sintesi dei miRNA svolge un ruolo altrettanto importante nel mantenimento della quiescenza delle cellule staminali. I filamenti di miRNA si legano alla regione 3' non tradotta 3' UTR degli mRNA bersaglio, impedendo la loro traduzione in proteine ​​funzionali. La lunghezza del 3' UTR di un gene determina la sua capacità di legarsi ai filamenti di miRNA, consentendo così la regolazione della quiescenza. Alcuni esempi di miRNA nelle cellule staminali includono miR-126, che controlla la via PI3K/AKT/mTOR nelle cellule staminali ematopoietiche, miR-489, che sopprime l'oncogene DEK nelle cellule staminali muscolari e miR-31, che regola Myf5 nel muscolo cellule staminali. Il sequestro di miRNA dell'mRNA all'interno dei complessi ribonucleoproteici consente alle cellule quiescenti di immagazzinare l'mRNA necessario per un rapido ingresso nella fase G1.

3.3. Regolazione della quiescenza Risposta allo stress

Le cellule staminali che sono state quiescenti per lungo tempo spesso affrontano vari fattori di stress ambientale, come lo stress ossidativo. Tuttavia, diversi meccanismi consentono a queste cellule di rispondere a tali fattori di stress. Ad esempio, i fattori di trascrizione FOXO rispondono alla presenza di specie reattive dell'ossigeno ROS mentre HIF1A e LKB1 rispondono a condizioni ipossiche. Nelle cellule staminali ematopoietiche, l'autofagia è indotta a rispondere allo stress metabolico.

4.1. Esempi di fase G 0 reversibile Cellule staminali tissutali

Le cellule staminali sono cellule con la capacità unica di produrre cellule figlie differenziate e di preservare la loro identità di cellule staminali attraverso l'auto-rinnovamento. Nei mammiferi, la maggior parte dei tessuti adulti contiene cellule staminali tessuto-specifiche che risiedono nel tessuto e proliferano per mantenere l'omeostasi per tutta la durata della vita dell'organismo. Queste cellule possono subire un'immensa proliferazione in risposta al danno tissutale prima di differenziarsi e impegnarsi nella rigenerazione. Alcune cellule staminali dei tessuti esistono in uno stato reversibile e quiescente indefinitamente fino a quando non vengono attivate da stimoli esterni. Esistono molti tipi diversi di cellule staminali tissutali, comprese le cellule staminali muscolari MuSC, le cellule staminali neurali NSC, le cellule staminali intestinali ISC e molte altre.

È stato recentemente suggerito che la quiescenza delle cellule staminali sia composta da due fasi funzionali distinte, G 0 e una fase di allerta denominata G Alert. Si ritiene che le cellule staminali effettuino una transizione attiva e reversibile tra queste fasi per rispondere agli stimoli di lesione e sembrano ottenere una maggiore funzione rigenerativa dei tessuti in G Alert. Pertanto, la transizione in G Alert è stata proposta come una risposta adattativa che consente alle cellule staminali di rispondere rapidamente a lesioni o stress innescandole per l'ingresso nel ciclo cellulare. Nelle cellule staminali muscolari, è stata identificata l'attività di mTORC1 per controllare la transizione da G 0 a G Alert insieme alla segnalazione attraverso il recettore HGF cMet.

4.2. Esempi di fase G 0 reversibile Epatociti maturi

Mentre uno stato di quiescenza reversibile è forse più importante per le cellule staminali dei tessuti per rispondere rapidamente agli stimoli e mantenere un'adeguata omeostasi e rigenerazione, le fasi G 0 reversibili possono essere trovate in cellule non staminali come gli epatociti maturi. Gli epatociti sono tipicamente quiescenti nei fegati normali, ma subiscono una replicazione limitata a meno di 2 divisioni cellulari durante la rigenerazione epatica dopo epatectomia parziale. Tuttavia, in alcuni casi, gli epatociti possono sperimentare un'immensa proliferazione di oltre 70 divisioni cellulari, indicando che la loro capacità di proliferazione non è ostacolata dall'esistenza in uno stato di quiescenza reversibile.

5.1. Esempi di fase G 0 irreversibile Cellule senescenti

Spesso associate all'invecchiamento e alle malattie legate all'età in vivo, le cellule senescenti possono essere trovate in molti tessuti rinnovabili, inclusi lo stroma, il sistema vascolare, il sistema ematopoietico e molti organi epiteliali. Derivante dall'accumulo in molte divisioni cellulari, la senescenza è spesso osservata nei fenotipi degenerativi associati all'età. È stato scoperto che i fibroblasti senescenti in modelli di funzione delle cellule epiteliali del seno interrompono la produzione di proteine ​​del latte a causa della secrezione di metalloproteinasi della matrice. Allo stesso modo, le cellule muscolari lisce senescenti dell'arteria polmonare hanno causato la proliferazione e la migrazione delle cellule muscolari lisce vicine, forse contribuendo all'ipertrofia delle arterie polmonari e infine all'ipertensione polmonare.

5.2. Esempi di fase G 0 irreversibile Muscolo differenziato

Durante la miogenesi scheletrica, le cellule progenitrici cicliche note come mioblasti si differenziano e si fondono in cellule muscolari non cicliche chiamate miociti che rimangono in una fase terminale G 0. Di conseguenza, le fibre che compongono le miofibre del muscolo scheletrico sono cellule con più nuclei, chiamate mionuclei, poiché ogni mionucleo ha avuto origine da un singolo mioblasto. Le cellule muscolari scheletriche continuano indefinitamente a fornire forza contrattile attraverso contrazioni simultanee di strutture cellulari chiamate sarcomeri. È importante sottolineare che queste cellule sono mantenute in una fase G0 terminale poiché l'interruzione della struttura delle fibre muscolari dopo la formazione delle miofibre impedirebbe la corretta trasmissione della forza attraverso la lunghezza del muscolo. La crescita muscolare può essere stimolata dalla crescita o da lesioni e comporta il reclutamento di cellule staminali muscolari – note anche come cellule satelliti – da uno stato di quiescenza reversibile. Queste cellule staminali si differenziano e si fondono per generare nuove fibre muscolari sia in parallelo che in serie per aumentare la capacità di generazione di forza.

Anche il muscolo cardiaco si forma attraverso la miogenesi, ma invece di reclutare cellule staminali per fondersi e formare nuove cellule, le cellule del muscolo cardiaco - note come cardiomiociti - aumentano semplicemente di dimensioni man mano che il cuore diventa più grande. Analogamente al muscolo scheletrico, se i cardiomiociti dovessero continuare a dividersi per aggiungere tessuto muscolare, le strutture contrattili necessarie per la funzione cardiaca verrebbero distrutte.

5.3. Esempi di fase G 0 irreversibile Osso differenziato

Dei quattro principali tipi di cellule ossee, gli osteociti sono i più comuni ed esistono anche in una fase terminale G 0. Gli osteociti derivano da osteoblasti che sono intrappolati all'interno di una matrice auto-secreta. Sebbene gli osteociti abbiano anche una ridotta attività sintetica, svolgono ancora funzioni ossee oltre a generare struttura. Gli osteociti lavorano attraverso vari meccanismi meccanosensoriali per assistere nel ricambio di routine sulla matrice ossea.

5.4. Esempi di fase G 0 irreversibile Nervo differenziato

Al di fuori di alcune nicchie neurogene nel cervello, la maggior parte dei neuroni è completamente differenziata e risiede in una fase G0 terminale. Questi neuroni completamente differenziati formano sinapsi in cui i segnali elettrici vengono trasmessi dagli assoni ai dendriti dei neuroni vicini. In questo stato G 0, i neuroni continuano a funzionare fino alla senescenza o all'apoptosi. Numerosi studi hanno riportato l'accumulo di danni al DNA con l'età, in particolare danni ossidativi, nel cervello dei mammiferi.

6.1. Meccanismo di ingresso G 0 Ruolo di Rim15

Rim15 è stato scoperto per la prima volta per svolgere un ruolo fondamentale nell'iniziare la meiosi nelle cellule di lievito diploidi. In condizioni di basso glucosio e azoto, che sono nutrienti chiave per la sopravvivenza del lievito, le cellule di lievito diploidi iniziano la meiosi attraverso l'attivazione dei primi geni EMG specifici della meiotica. L'espressione degli EMG è regolata da Ume6. Ume6 recluta le deacetilasi istoniche, Rpd3 e Sin3, per reprimere l'espressione EMG quando i livelli di glucosio e azoto sono alti e recluta il fattore di trascrizione EMG Ime1 quando i livelli di glucosio e azoto sono bassi. Rim15, chiamato per il suo ruolo nella regolazione di un EMG chiamato IME2, sposta Rpd3 e Sin3, permettendo così a Ume6 di portare Ime1 ai promotori di EMG per l'inizio della meiosi.

Oltre a svolgere un ruolo nell'inizio della meiosi, Rim15 ha anche dimostrato di essere un effettore critico per l'ingresso delle cellule di lievito in G 0 in presenza di stress. I segnali provenienti da diverse vie di segnalazione dei nutrienti convergono su Rim15, che attiva i fattori di trascrizione, Gis1, Msn2 e Msn4. Gis1 si lega e attiva i promotori contenenti elementi PDS post-diauxic growth shift mentre Msn2 e Msn4 si legano e attivano promotori contenenti elementi di risposta allo stress STRE. Sebbene non sia chiaro come Rim15 attivi Gis1 e Msn2/4, si ipotizza che possa fosforili direttamente o essere coinvolto nel rimodellamento della cromatina. È stato anche scoperto che Rim15 contiene un dominio PAS nel suo terminale N, il che lo rende un membro appena scoperto della famiglia delle chinasi PAS. Il dominio PAS è un'unità di regolazione della proteina Rim15 che può svolgere un ruolo nel rilevamento dello stress ossidativo nel lievito.

6.2. Meccanismo di ingresso G 0 Glucosio

Il lievito cresce esponenzialmente attraverso la fermentazione del glucosio. Quando i livelli di glucosio diminuiscono, il lievito passa dalla fermentazione alla respirazione cellulare, metabolizzando i prodotti fermentativi dalla loro fase di crescita esponenziale. Questo spostamento è noto come spostamento diauxico dopo il quale il lievito entra in G 0. Quando i livelli di glucosio nell'ambiente circostante sono elevati, la produzione di cAMP attraverso la via RAS-cAMP-PKA, una via dipendente dal cAMP, è elevata, causando l'aumento della proteina chinasi A PKA. inibire il suo bersaglio a valle Rim15 e consentire la proliferazione cellulare. Quando i livelli di glucosio diminuiscono, la produzione di cAMP diminuisce, sollevando l'inibizione dei PKA di Rim15 e consentendo alla cellula di lievito di entrare in G 0.

6.3. Meccanismo di ingresso G 0 Azoto

Oltre al glucosio, la presenza di azoto è fondamentale per la proliferazione dei lieviti. In condizioni di basso azoto, Rim15 viene attivato per promuovere l'arresto del ciclo cellulare attraverso l'inattivazione delle protein chinasi TORC1 e Sch9. Mentre TORC1 e Sch9 appartengono a due percorsi separati, rispettivamente i percorsi indotti da TOR e Fermentable Growth Medium, entrambe le protein chinasi agiscono per promuovere la ritenzione citoplasmatica di Rim15. In condizioni normali, Rim15 è ancorato alla proteina citoplasmatica 14-3-3, Bmh2, tramite la fosforilazione del suo Thr1075. TORC1 inattiva alcune fosfatasi nel citoplasma, mantenendo Rim15 ancorato a Bmh2, mentre si pensa che Sch9 promuova la ritenzione citoplasmatica di Rim15 attraverso la fosforilazione di un altro sito di legame 14-3-3 vicino a Thr1075. Quando l'azoto extracellulare è basso, TORC1 e Sch9 vengono inattivati, consentendo la defosforilazione di Rim15 e il suo successivo trasporto al nucleo, dove può attivare fattori di trascrizione coinvolti nel promuovere l'ingresso delle cellule in G 0. È stato anche riscontrato che Rim15 promuove la propria esportazione dal nucleo attraverso l'autofosforilazione.

6.4. Meccanismo di ingresso G 0 Fosfato

Le cellule di lievito rispondono a bassi livelli di fosfato extracellulare attivando geni coinvolti nella produzione e nella sovraregolazione del fosfato inorganico. La via PHO è coinvolta nella regolazione dei livelli di fosfato. In condizioni normali, il complesso della chinasi ciclina-dipendente del lievito, Pho80-Pho85, inattiva il fattore di trascrizione Pho4 attraverso la fosforilazione. Tuttavia, quando i livelli di fosfato diminuiscono, Pho81 inibisce Pho80-Pho85, consentendo a Pho4 di essere attivo. Quando il fosfato è abbondante, Pho80-Pho85 inibisce anche il pool nucleare di Rim 15 promuovendo la fosforilazione del suo sito di legame Thr1075 Bmh2. Pertanto, Pho80-Pho85 agisce di concerto con Sch9 e TORC1 per promuovere la ritenzione citoplasmatica di Rim15 in condizioni normali.

7.1. Meccanismo di uscita G 0 Ciclina C/Cdk3 e Rb

La transizione dalla fase G 1 alla fase S è promossa dall'inattivazione di Rb attraverso la sua progressiva iperfosforilazione da parte dei complessi Cyclin D/Cdk4 e Cyclin E/Cdk2 nella tarda G 1. Una prima osservazione che la perdita di Rb ha favorito il rientro nel ciclo cellulare in Le cellule G 0 hanno suggerito che Rb è anche essenziale nella regolazione della transizione da G 0 a G 1 nelle cellule quiescenti. Ulteriori osservazioni hanno rivelato che i livelli di mRNA della ciclina C sono più alti quando le cellule umane escono da G 0, suggerendo che la ciclina C può essere coinvolta nella fosforilazione di Rb per promuovere il rientro nel ciclo cellulare delle cellule arrestate con G 0. I test di immunoprecipitazione della chinasi hanno rivelato che la ciclina C ha un'attività della chinasi Rb. Inoltre, a differenza delle cicline D ed E, l'attività della chinasi della ciclina Cs Rb è massima durante le prime fasi di G1 e minima durante le fasi tardive di G1 e S, suggerendo che potrebbe essere coinvolta nella transizione da G0 a G1. L'uso del cell sorting attivato dalla fluorescenza per identificare le cellule G 0, che sono caratterizzate da un elevato rapporto DNA/RNA rispetto alle cellule G 1, ha confermato il sospetto che la ciclina C promuova l'uscita G 0 come repressione della ciclina C endogena da parte dell'RNAi nei mammiferi le cellule hanno aumentato la proporzione di cellule arrestate in G 0. Ulteriori esperimenti che coinvolgono la mutazione di Rb in siti di fosforilazione specifici hanno mostrato che la fosforilazione della ciclina C di Rb a S807/811 è necessaria per l'uscita di G 0. Non è chiaro, tuttavia, se questo modello di fosforilazione sia sufficiente per l'uscita di G0. Infine, i test di co-immunoprecipitazione hanno rivelato che la chinasi 3 cdk3 ciclina-dipendente promuove l'uscita di G 0 formando un complesso con la ciclina C per fosforilare Rb a S807/811. È interessante notare che S807/811 sono anche bersagli della fosforilazione della ciclina D/cdk4 durante la transizione da G 1 a S. Ciò potrebbe suggerire una possibile compensazione dell'attività di cdk3 da parte di cdk4, soprattutto alla luce dell'osservazione che l'uscita di G 0 è solo ritardata, e non permanentemente inibita, nelle cellule prive di cdk3 ma funzionali in cdk4. Nonostante la sovrapposizione degli obiettivi di fosforilazione, sembra che cdk3 sia ancora necessario per la transizione più efficace da G 0 a G 1.

7.2. Meccanismo di uscita G 0 Rb e G 0 escono

Gli studi suggeriscono che la repressione Rb della famiglia di fattori di trascrizione E2F regola la transizione da G 0 a G 1 proprio come fa la transizione da G 1 a S. L'attivazione dei complessi E2F è associata al reclutamento di istone acetiltransferasi, che attivano l'espressione genica necessaria per l'ingresso in G1, mentre i complessi E2F4 reclutano istone deacetilasi, che reprimono l'espressione genica. La fosforilazione di Rb da parte dei complessi Cdk permette la sua dissociazione dai fattori di trascrizione E2F e la successiva espressione di geni necessari per l'uscita di G 0. Anche altri membri della famiglia delle proteine ​​tascabili Rb, come p107 e p130, sono stati trovati coinvolti nell'arresto di G0. i livelli di p130 sono elevati in G 0 e si è scoperto che si associano ai complessi E2F-4 per reprimere la trascrizione dei geni bersaglio E2F. Nel frattempo, è stato scoperto che p107 salva il fenotipo dell'arresto cellulare dopo la perdita di Rb anche se p107 è espresso a livelli relativamente bassi nelle cellule G 0. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che la repressione da parte di Rb dei fattori di trascrizione E2F promuove l'arresto cellulare mentre la fosforilazione di Rb porta all'uscita di G 0 tramite la derepressione dei geni bersaglio E2F. In addition to its regulation of E2F, Rb has also been shown to suppress RNA polymerase I and RNA polymerase III, which are involved in rRNA synthesis. Thus, phosphorylation of Rb also allows activation of rRNA synthesis, which is crucial for protein synthesis upon entry into G 1.


Meiosi I

La meiosi è preceduta da un'interfase costituita dal G1, S e G2 fasi, che sono quasi identiche alle fasi che precedono la mitosi. La G1 fase, che è anche chiamata la prima fase gap, è la prima fase dell'interfase ed è focalizzata sulla crescita cellulare. La fase S è la seconda fase dell'interfase, durante la quale viene replicato il DNA dei cromosomi. Infine, il G2 fase, chiamata anche la seconda fase gap, è la terza e ultima fase dell'interfase in questa fase, la cellula subisce i preparativi finali per la meiosi.

During DNA duplication in the S phase, each chromosome is replicated to produce two identical copies, called sister chromatids, that are held together at the centromere by coesione proteine. La coesione tiene insieme i cromatidi fino all'anafase II. Si replicano anche i centrosomi, che sono le strutture che organizzano i microtubuli del fuso meiotico. Questo prepara la cellula ad entrare in profase I, la prima fase meiotica.

Profase I

All'inizio della profase I, prima che i cromosomi possano essere visti chiaramente al microscopio, i cromosomi omologhi sono attaccati alle loro estremità all'involucro nucleare da proteine. Quando l'involucro nucleare inizia a rompersi, le proteine ​​associate ai cromosomi omologhi avvicinano la coppia l'una all'altra. (Recall that, in mitosis, homologous chromosomes do not pair together. In mitosis, homologous chromosomes line up end-to-end so that when they divide, each daughter cell receives a sister chromatid from both members of the homologous pair.) The complesso sinaptonemico, a lattice of proteins between the homologous chromosomes, first forms at specific locations and then spreads to cover the entire length of the chromosomes. Viene chiamato lo stretto accoppiamento dei cromosomi omologhi sinapsi. Nella sinapsi, i geni sui cromatidi dei cromosomi omologhi sono allineati con precisione tra loro. Il complesso sinaptonemico supporta lo scambio di segmenti cromosomici tra cromatidi omologhi non fratelli, un processo chiamato crossing over. L'attraversamento può essere osservato visivamente dopo lo scambio come chiasmata (singolare = chiasma) (Figure 2).

Figure 2. Early in prophase I, homologous chromosomes come together to form a synapse. The chromosomes are bound tightly together and in perfect alignment by a protein lattice called a synaptonemal complex and by cohesin proteins at the centromere.

In specie come gli esseri umani, anche se i cromosomi sessuali X e Y non sono omologhi (la maggior parte dei loro geni differisce), hanno una piccola regione di omologia che consente ai cromosomi X e Y di accoppiarsi durante la profase I. Un complesso sinaptonemico parziale si sviluppa solo tra le regioni di omologia.

Located at intervals along the synaptonemal complex are large protein assemblies called recombination nodules. These assemblies mark the points of later chiasmata and mediate the multistep process of crossover—or genetic recombination—between the non-sister chromatids. Vicino al nodulo di ricombinazione su ciascun cromatide, il DNA a doppio filamento viene scisso, le estremità tagliate vengono modificate e viene creata una nuova connessione tra i cromatidi non fratelli. Man mano che la profase I progredisce, il complesso sinaptonemico inizia a rompersi e i cromosomi iniziano a condensarsi. Quando il complesso sinaptonemico è scomparso, i cromosomi omologhi rimangono attaccati l'uno all'altro al centromero e ai chiasmi. I chiasmi rimangono fino all'anafase I. Il numero dei chiasmi varia a seconda della specie e della lunghezza del cromosoma. Ci deve essere almeno un chiasma per cromosoma per una corretta separazione dei cromosomi omologhi durante la meiosi I, ma possono essercene fino a 25. Dopo il crossover, il complesso sinaptonemico si rompe e viene rimossa anche la connessione di coesione tra le coppie omologhe. At the end of prophase I, the pairs are held together only at the chiasmata (Figure 3) and are called tetrads because the four sister chromatids of each pair of homologous chromosomes are now visible.

Figure 3. Crossover occurs between non-sister chromatids of homologous chromosomes. The result is an exchange of genetic material between homologous chromosomes.

Gli eventi crossover sono la prima fonte di variazione genetica nei nuclei prodotti dalla meiosi. Un singolo evento di crossover tra cromatidi omologhi non fratelli porta ad uno scambio reciproco di DNA equivalente tra un cromosoma materno e un cromosoma paterno. Ora, quando quel cromatide fratello viene spostato in una cellula gamete, trasporterà del DNA da un genitore dell'individuo e del DNA dall'altro genitore. Il cromatide ricombinante fratello ha una combinazione di geni materni e paterni che non esistevano prima del crossover. Più crossover in un braccio del cromosoma hanno lo stesso effetto, scambiando segmenti di DNA per creare cromosomi ricombinanti.

Prometafase I

L'evento chiave nella prometafase I è l'attaccamento dei microtubuli della fibra del fuso alle proteine ​​del cinetocore ai centromeri. Le proteine ​​cinetocore sono complessi multiproteici che legano i centromeri di un cromosoma ai microtubuli del fuso mitotico. I microtubuli crescono da centrosomi posti ai poli opposti della cellula. I microtubuli si spostano verso il centro della cellula e si attaccano a uno dei due cromosomi omologhi fusi. The microtubules attach at each chromosomes’ kinetochores. Con ogni membro della coppia omologa attaccato ai poli opposti della cellula, nella fase successiva, i microtubuli possono separare la coppia omologa. Una fibra del fuso che si è attaccata a un cinetocore è chiamata microtubulo del cinetocore. Alla fine della prometafase I, ogni tetrade è attaccata ai microtubuli di entrambi i poli, con un cromosoma omologo rivolto verso ciascun polo. I cromosomi omologhi sono ancora tenuti insieme ai chiasmi. Inoltre, la membrana nucleare si è completamente rotta.

Metafase I

Durante la metafase I, i cromosomi omologhi sono disposti al centro della cellula con i cinetocori rivolti verso i poli opposti. Le coppie omologhe si orientano casualmente all'equatore. Ad esempio, se i due membri omologhi del cromosoma 1 sono etichettati a e b, i cromosomi potrebbero allinearsi a-b o b-a. Questo è importante per determinare i geni portati da un gamete, poiché ciascuno riceverà solo uno dei due cromosomi omologhi. Ricordiamo che i cromosomi omologhi non sono identici. Contengono lievi differenze nelle loro informazioni genetiche, facendo sì che ogni gamete abbia un corredo genetico unico.

Questa casualità è la base fisica per la creazione della seconda forma di variazione genetica nella prole. Considera che i cromosomi omologhi di un organismo che si riproduce sessualmente sono originariamente ereditati come due insiemi separati, uno da ciascun genitore. Usando l'uomo come esempio, nell'ovulo donato dalla madre è presente un set di 23 cromosomi. Il padre fornisce l'altro set di 23 cromosomi nello sperma che feconda l'uovo. Ogni cellula della progenie multicellulare ha copie dei due set originali di cromosomi omologhi. Nella profase I della meiosi, i cromosomi omologhi formano le tetradi. Nella metafase I, queste coppie si allineano nel punto intermedio tra i due poli della cellula per formare la piastra metafase. Poiché c'è la stessa possibilità che una fibra di microtubuli incontri un cromosoma ereditato dalla madre o dal padre, la disposizione delle tetradi sulla piastra metafase è casuale. Qualsiasi cromosoma ereditato dalla madre può affrontare entrambi i poli. Qualsiasi cromosoma ereditato paternamente può anche affrontare uno dei due poli. L'orientamento di ciascuna tetrade è indipendente dall'orientamento delle altre 22 tetradi.

Questo evento, l'assortimento casuale (o indipendente) di cromosomi omologhi sulla piastra metafase, è il secondo meccanismo che introduce la variazione nei gameti o nelle spore. In ogni cellula che subisce la meiosi, la disposizione delle tetradi è diversa. Il numero di variazioni dipende dal numero di cromosomi che compongono un insieme. Ci sono due possibilità di orientamento alla piastra metafase il numero possibile di allineamenti è quindi uguale a 2 n , dove n è il numero di cromosomi per set. Humans have 23 chromosome pairs, which results in over eight million (2 23 ) possible genetically-distinct gametes. Questo numero non include la variabilità che è stata precedentemente creata nei cromatidi fratelli dal crossover. Given these two mechanisms, it is highly unlikely that any two haploid cells resulting from meiosis will have the same genetic composition (Figure 4).

Figure 4. Random, independent assortment during metaphase I can be demonstrated by considering a cell with a set of two chromosomes (n = 2). In this case, there are two possible arrangements at the equatorial plane in metaphase I. The total possible number of different gametes is 2n, dove n equals the number of chromosomes in a set. In this example, there are four possible genetic combinations for the gametes. Insieme a n = 23 in human cells, there are over 8 million possible combinations of paternal and maternal chromosomes.

Per riassumere le conseguenze genetiche della meiosi I, i geni materni e paterni sono ricombinati da eventi crossover che si verificano tra ciascuna coppia omologa durante la profase I. Inoltre, l'assortimento casuale di tetradi sulla piastra metafase produce una combinazione unica di cromosomi materni e paterni che si farà strada nei gameti.

Anafase I

Nell'anafase I, i microtubuli separano i cromosomi collegati. The sister chromatids remain tightly bound together a the centromere. The chiasmata are broken in anaphase I as the microtubules attached to the fused kinetochores pull the homologous chromosomes apart (Figure 5).

Figure 5. The process of chromosome alignment differs between meiosis I and meiosis II. In prometaphase I, microtubules attach to the fused kinetochores of homologous chromosomes, and the homologous chromosomes are arranged at the midpoint of the cell in metaphase I. In anaphase I, the homologous chromosomes are separated. In prometaphase II, microtubules attach to the kinetochores of sister chromatids, and the sister chromatids are arranged at the midpoint of the cells in metaphase II. In anafase II, i cromatidi fratelli sono separati.

Telofase I e citochinesi

Nella telofase, i cromosomi separati arrivano ai poli opposti. Il resto degli eventi tipici della telofase può verificarsi o meno, a seconda della specie. In alcuni organismi, i cromosomi si decondensano e gli involucri nucleari si formano attorno ai cromatidi nella telofase I. In altri organismi, la citochinesi, la separazione fisica dei componenti citoplasmatici in due cellule figlie, avviene senza riformazione dei nuclei. In quasi tutte le specie animali e in alcuni funghi, la citochinesi separa il contenuto cellulare tramite un solco di scissione (costrizione dell'anello di actina che porta alla divisione citoplasmatica). Nelle piante, una piastra cellulare si forma durante la citochinesi cellulare dalle vescicole di Golgi che si fondono alla piastra metafase. Questa piastra cellulare alla fine porterà alla formazione di pareti cellulari che separano le due cellule figlie.

Due cellule aploidi sono il risultato finale della prima divisione meiotica. Le cellule sono aploidi perché ad ogni polo c'è solo uno di ogni coppia di cromosomi omologhi. Pertanto, è presente solo un set completo di cromosomi. Questo è il motivo per cui le cellule sono considerate aploidi: esiste un solo set di cromosomi, anche se ogni omologo è ancora costituito da due cromatidi fratelli. Ricordiamo che i cromatidi fratelli sono semplicemente duplicati di uno dei due cromosomi omologhi (ad eccezione dei cambiamenti avvenuti durante l'incrocio). Nella meiosi II, questi due cromatidi fratelli si separeranno, creando quattro cellule figlie aploidi.


6. Consider multiplexing for more information

If you are going to the trouble of performing a cell cycle analysis, why not expand the assay a bit and get that much more information about the cells?

  1. BrDU for S-phaseBrDU and the related EdU are thymidine analogs that can be used to better identify the S-phase. The assay is relatively straightforward: by pulsing the culture for some period of time with BrDU, it will get incorporated into the actively synthesizing cells. The BrDU is measured with an antibody, while EdU uses “Click-iT” technology to reveal the labeled cells. The resulting data is shown in Figure 8.Figura 8: Using BrDU to reveal the S-phase of the cell cycle. Figure from Tonbo LiteratureThe BrDU pulls out the S-phase cells, making it easier to identify this phase of the cell cycle.
  2. Ki-67 for proliferationAntibodies against Ki-67 are useful, as they are a marker of proliferation and can be used to differentiate quiescent cells from cycling cells.Figura 9: Separating quiescent cells from cycling cells. From Kim and Sederstrom (2015).
  3. Phospho-H3 for M phase determination Histone H3 is phosphorylated during mitosis at the Ser-10 and Ser-28, thus serves as an excellent tool to separate the G2 from the M phases, as shown in Figure 10.Figura 10: Use of pH3 to separate M phase from G2 phase. Figure from ThermoFisher websiteConsider the possibilities. Using these tools in combination with traditional cell cycle staining can really dissect this important biological process. The caveat when moving into multiplexing cell cycle measurements is that the fixation conditions need to be optimized to ensure good staining of each component. For example, fixation with formaldehyde may be necessary to ensure good antibody staining, but this might need to be followed up with alcohol fixation to improve the cell cycle staining. Optimization is the key here.

Cell cycle seems like such a straightforward assay. At its heart, it is a one-color assay and should be a simple protocol to follow. However, as discussed before, fixation and dye concentrations are critical. Once those are optimized, it becomes important to run the cells low and slow to get the best quality histograms for analysis — the topic of another blog. Adding the critical CEN and TEN controls will help standardize the assay, and ensure consistency and reproducibility between runs, while helping identify non-standard (aneuploid, polyploid) populations from normal ploidy. Trying to isolate and focus on specific components of the cell cycle can be done by addition of specific antibodies, or using thymidine analogs. In the end, cell cycle analysis is a simple assay that has a great deal of potential. With work and optimization, a great deal of information about the life of a cell can be extracted.

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Tim Bushnell ha conseguito un dottorato di ricerca in biologia presso il Rensselaer Polytechnic Institute. È co-fondatore e mente didattica dietro ExCyte, la principale società di formazione sulla citometria a flusso del mondo, la cui organizzazione vanta una vera e propria libreria di risorse in laboratorio su sequenziamento, microscopia e argomenti correlati nelle scienze della vita.