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1.2A: Micelle e doppio strato - Biologia

1.2A: Micelle e doppio strato - Biologia


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Un post-dottorato una volta mi disse che per capire la biochimica e l'immunologia doveva fingere di essere una molecola. Prima di leggere la risposta, guarda l'immagine qui sotto e poniti la domanda: cosa farei se fossi un anfifilo a catena singola pronto a saltare in acqua?

Un anfifilo a catena singola salta in acqua!

Quando aggiunti all'acqua, gli anfifili a catena singola formano sia monostrati sulla superficie dell'acqua che micelle, mentre alcuni monomeri rimangono in soluzione. Gli anfifili a doppia catena formano doppi strati anziché micelle. (Nota: gli anfifili a catena singola e doppia possono formare anche altre strutture aggregate multimolecolari, ma queste sono le più comuni e sono le uniche che prenderemo in considerazione.)

Figura: Strutture di anfipili a catena singola e doppia in acqua - Micelle e Bilayers


Jmol Aggiornato Micelle Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Jmol: aggiornato il doppio strato non idratato Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

L'interno della micella è completamente apolare. I doppi strati sferici che racchiudono un compartimento acquoso sono chiamati vescicole o liposomi. Micelle e doppi strati, formati rispettivamente da anfifili a catena singola e doppia, rappresentano aggregati non covalenti e quindi sono formati da un processo interamente fisico. Non sono richiesti passaggi covalenti. La formazione di queste strutture può essere compresa dallo studio delle forze intermolecolari (IMF) coinvolte e dalla termodinamica. Per prima cosa esamineremo i FMI coinvolti. Considera le forze attrattive. Le catene aciliche sepolte possono interagire ed essere stabilizzate dalle forze di Londra. Sono sequestrati dall'acqua. Questa visione si adatta al nostro semplice assioma "il simile dissolve il simile". I gruppi di capi polari possono essere stabilizzati da legami ione-dipolo tra gruppi di capi carichi e acqua. Allo stesso modo, i legami H tra l'acqua e il gruppo di testa stabilizzano i gruppi di testa esposti nell'acqua. Possono essere coinvolte anche forze repulsive. I gruppi di testa possono respingersi a vicenda attraverso fattori sterici o repulsione ione-ione da gruppi di testa con carica simile. Le forze attrattive devono essere maggiori delle forze repulsive, che portano a questi aggregati molecolari. Un problema sorge con questa semplice spiegazione. Perché si formi una micella o un doppio strato, molti monomeri devono aggregarsi per formare un'unica micella o vescicola. Ciò suggerisce che la formazione di micelle e vescicole dovrebbe essere entropicamente sfavorevole!

I comuni anfifili a catena singola che formano le micelle sono detergenti (come sodio dodecil solfato - SDS) e acidi grassi, che a loro volta sono detergenti. NaOH si sente scivoloso sulla pelle poiché la base idrolizza gli acidi grassi esterificati ai lipidi della pelle. Gli acidi grassi liberi poi si aggregano spontaneamente per formare micelle che agiscono come detergenti.


Domande pre-classe: Struttura lipidica: B. Lipidi nell'acqua - Domanda


I liposomi prodotti in laboratorio possono essere unilamellari, costituiti da un singolo doppio strato che circonda il compartimento acquoso interno, o multilamellari, costituiti da più doppi strati che circondano la soluzione acquosa racchiusa. Puoi immaginare che le vescicole multilamellari assomiglino a una cipolla con i suoi molteplici strati. Di seguito sono mostrati cartoni di liposomi unilamellari e multilamellari, dove ogni cerchio concentrico rappresenta un doppio strato.

I liposomi variano di diametro. Possono essere generalmente classificati in piccoli (S, diametro < 25 nm), intermedi (I, diametro circa 100 nm) e grandi (L, diametro 250-1000 nm). Se queste vescicole sono unilamellari, vengono abbreviate rispettivamente come SUV, IUV e LUV. Le loro varie dimensioni sono mostrate di seguito, rispetto ad altre grandi strutture biologiche. In questo laboratorio, realizzeremo e caratterizzeremo LUV.

La composizione chimica dei liposomi può essere ampiamente variata. La maggior parte contiene fosfolipidi neutri come la fosfatidilcolina (PC), la fosfatidil etanolamina (PE) o la sfingomielina (SM), integrati, se lo si desidera, con fosfolipidi caricati negativamente, come la fosfatidilserina (PS) e il fosfatidilglicerolo (PG). Inoltre, gli anfifili a catena singola come il colesterolo (C) e i detergenti possono essere incorporati nella membrana a doppio strato, che modula la fluidità e la temperatura di transizione (Tm) del doppio strato. Se presenti in una concentrazione troppo elevata, gli anfifili a catena singola come i detergenti, che formano micelle, possono distruggere la membrana in modo così completo che gli anfifili a doppia catena vengono incorporati nelle micelle detergenti, ora chiamate micelle miste, in un processo che distrugge efficacemente il doppio strato di membrana.

In laboratorio (per chi lo assume) realizzerai liposomi contenenti solo PC naturale da tuorlo d'uovo fresco. Ricorda, i due acidi grassi nei fosfolipidi naturali possono essere di un multiplo di lunghezze e gradi di insaturazione. La composizione media in acidi grassi del tuorlo d'uovo PC (peso molecolare medio = 750) è riportata nella tabella sottostante, ottenuta da Liposomes: un approccio pratico, a cura di R.R.C. Nuovo.

Tabella 1
Acido grasso% di acidi grassi a C1% di acidi grassi a C2
16:068.81.8
18:025.81.2
18:14.748.9
18:20.211.1
18:30.5-
20:4-2.1
20:5-7.1
22:5-2.6
22:6-25.2
  • Avanti Polar Lipids (dove otteniamo il nostro uovo PC): distribuzione degli acidi grassi per diversi tessuti

Dato il grande grado di insaturazione a C2, quale ti aspetti che sia la temperatura di transizione di un liposoma composto solo da tuorlo d'uovo PC? (Le vescicole prodotte utilizzando PC più saturato da fonti di mammiferi hanno (T_m) di circa 40ºC.) Questo alto grado di insaturazione rende il PC del tuorlo d'uovo molto suscettibile all'ossidazione, che potrebbe alterare drasticamente le proprietà del liposoma. Il PC sintetico realizzato con acidi grassi saturi potrebbe alleviare questo problema.

Le proprietà dei liposomi (densità di carica, fluidità di membrana e permeabilità) sono determinate dalla composizione lipidica e dalle dimensioni della vescicola. Le proprietà desiderate saranno, a loro volta, determinate dall'uso del particolare liposoma. Le vescicole offrono modelli meravigliosi e semplici per studiare la biochimica e la biofisica delle membrane naturali. In effetti, le proteine ​​di membrana possono essere effettivamente incorporate nel doppio strato di liposomi utilizzando il metodo esatto che utilizzerai. Ma a parte questi scopi, i liposomi possono essere usati per incapsulare molecole idrosolubili come acidi nucleici, proteine ​​e farmaci tossici. Questi liposomi possono essere mirati a cellule specifiche se nel doppio strato della vescicola possono essere incorporati anticorpi o altre molecole che si legheranno specificamente alla cellula bersaglio. Il materiale intraliposomiale può quindi essere trasferito nella cellula sia per fusione della vescicola con la cellula, sia per endocitosi della vescicola.


Frontiere della chimica

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I ciclotidi sono una famiglia di proteine ​​circolari di origine vegetale con potenziali applicazioni terapeutiche derivanti dalla loro notevole stabilità, ampia diversità di sequenza e gamma di bioattività. Si ritiene che la loro attività di legame alla membrana sia una componente critica del loro meccanismo d'azione. Utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione, abbiamo studiato il legame dei ciclotidi prototipici kalata B1 e kalata B2 (e vari mutanti) alle micelle di dodecilfosfocolina e ai doppi strati lipidici contenenti fosfoetanolammina. Sebbene il legame sia prevalentemente un processo guidato dall'entropia, suggerendo che le forze idrofobe contribuiscono in modo significativo alla formazione del complesso ciclotide-lipidi, è richiesto anche un legame specifico al gruppo di testa fosfoetanolammina-lipidi, che è evidente dai cambiamenti entalpici nell'energia libera del legame. Inoltre, utilizzando una combinazione di misurazioni dissipative della microbilancia dei cristalli di quarzo e riflettometria neutronica, abbiamo chiarito il processo mediante il quale i ciclotidi interagiscono con le membrane a doppio strato. Inizialmente, un piccolo numero di ciclotidi si legano alla superficie della membrana e quindi si inseriscono prima nel foglietto della membrana esterna, seguito dalla penetrazione attraverso la membrana e dalla formazione di pori. A concentrazioni più elevate di ciclotidi, si verifica la destabilizzazione delle membrane. I nostri risultati forniscono una visione meccanicistica significativa di come i ciclotidi esercitano le loro bioattività.

Questo lavoro è stato in parte supportato dall'Australian Research Council Grant DP0984390. Il viaggio è stato sostenuto dall'Australian Nuclear Science and Technology Organization Grant 04/08-N-40 per la riflettometria di neutroni.

Entrambi gli autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro.

Un membro del National Health and Medical Research Council Early Career Fellow.

Indirizzo attuale: European Spallation Source ESS AB, P.O. Casella 176, SE 22100 Lund, Svezia.


Struttura e funzione del dominio di ancoraggio della membrana della proteina non strutturale 5A . del virus dell'epatite C

La proteina non strutturale 5A (NS5A) del virus dell'epatite C (HCV) è un componente essenziale associato alla membrana del complesso di replicazione virale. Riportiamo qui la struttura tridimensionale del dominio di ancoraggio della membrana di NS5A come determinato dalla spettroscopia NMR. È stata osservata un'alfa-elica che si estende dal residuo amminoacidico da 5 a 25 in presenza di diversi mezzi mimetici di membrana. Questa elica mostrava un lato idrofobo, Trprich, incorporato in micelle detergenti, mentre il lato carico polare era esposto al solvente. Pertanto, il dominio di ancoraggio della membrana NS5A forma un'alfa-elica anfipatica nel piano incorporata nel foglietto citosolico del doppio strato di membrana. È interessante notare che le mutazioni che influenzano il posizionamento dei residui completamente conservati situati sulla superficie citosolica dell'elica hanno compromesso la replicazione dell'RNA dell'HCV senza interferire con l'associazione di membrana di NS5A. In conclusione, il dominio di ancoraggio della membrana NS5A costituisce una piattaforma unica che è probabilmente coinvolta in interazioni specifiche essenziali per l'assemblaggio del complesso di replicazione dell'HCV e che può rappresentare un nuovo bersaglio per l'intervento antivirale.

Copyright 2004 Società americana di biochimica e biologia molecolare, Inc.


Materiali e metodi

Materiali

I lipidi utilizzati per preparare le NP studiate sono DOTAP, DOPC e DOPE-PEG2000 (di seguito indicati come PEG2K-lipid), che sono stati acquistati come soluzioni di cloroformio da Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Per gli esperimenti di fluorescenza sono stati preparati liposomi con 0,2 wt% Texas Red® - 1,2-diesadecanoil- sn-glicero-3-fosfoetanolammina, sale di trietilammonio (Texas Red® DHPE, eccitazione/emissione 595/615 nm) da Invitrogen (Carlsbad, CA). Quattro tipi distinti di DNA sono stati utilizzati per formare nanoparticelle UltraPure Salmon Sperm DNA Solution (S-DNA) (Invitrogen (Carlsbad, CA)), Lambda Phage DNA (λ-DNA) (Thermo Scientific (Waltham, MA)), pGL3 DNA plasmidico Luciferase Reporter (pGL3) (Promega (Fitchburg, Wisconsin)), che è stato propagato tramite Qiagen Plasmid Plus Mega Kit (Venlo, Limburg) e 11 bp DNA (acquistato come filamenti singoli da Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich (St. Louis, MI) e consegnato come film liofilizzato).I singoli filamenti complementari sono stati miscelati in un rapporto equimolare, diluiti a una concentrazione finale di 10 mg/mL, riscaldati a bagnomaria e tenuti a 90 ଌ per 15 minuti e lentamente raffreddato a temperatura ambiente per consentire l'ibridazione completa.Per gli studi di fluorescenza, il DNA è stato etichettato utilizzando YOYO-1 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) secondo il protocollo del produttore.

Preparazione dei liposomi

I liposomi sono stati preparati miscelando lipidi in soluzioni cloroformiche al rapporto molare desiderato in fiale di vetro. Il solvente è stato quindi evaporato utilizzando un flusso di azoto seguito da essiccamento sotto vuoto per 12 ore. La quantità appropriata di acqua ad alta resistività (18,2 MΩ·m 𢄡) è stata aggiunta al film lipidico secco e incubata a 37 ଌ durante la notte. Le soluzioni liposomiali sono state quindi sonicate con un sonicatore a punta per produrre piccole vescicole unilamellari.

Criomicroscopia elettronica

I campioni sono stati preparati miscelando soluzioni di lipidi e DNA a una concentrazione finale di 3 mg/ml o 30 mg/ml e incubando la soluzione CL𠄽NA per 20 minuti. Tutti i campioni crio-EM sono stati formati in acqua ad alta resistività ad eccezione di Fig. 2A e Fig. 3A che sono stati formati a 50 mM NaCl. Successivamente, 3 µL di sospensione del campione sono stati aggiunti a una griglia da 400 mesh appena pulita con plasma (pulitore al plasma Solarus (Gatan Inc. (Pleasanton, CA) 25% O2, 75% Ar) griglia Cflat, tamponata con carta da filtro per 9 secondi e immediatamente vetrificate in etano liquido utilizzando un Vitrobot (FEI Co. (Hillsboro, OR)). Le griglie sono state conservate sotto azoto liquido fino al trasferimento al microscopio elettronico per l'imaging. Le griglie di ghiaccio vitreo sono state trasferite al microscopio elettronico utilizzando un crio -stage che mantiene le griglie ad una temperatura di � ° C. Le immagini sono state acquisite utilizzando un Tecnai F20 TEM (FEI Co.) operante a 120 keV dotato di una camera CCD Gatan 4k x 4k (Gatan Inc. (Pleasanton, CA)) utilizzando il sistema software Leginon. 46 Le immagini ad alto ingrandimento sono state acquisite utilizzando una dimensione di pixel di 0,22 nm le condizioni di imaging nominali erano un sottofondo di

2,5 µm e una dose di elettroni di

20 e − /Å 2 . Le trasformate di Fourier e le integrazioni azimutali sono state generate utilizzando ImageJ.

Le NP del DNA di CL– sovraccaricate coesistono con liposomi e micelle filiformi per ρchg > 1 (rapporto molare di carica tra lipidi cationici e DNA anionico) (A, B) Micrografia Cryo-EM di CL𠄽NA NP formate con un rapporto molare di 80/15/5 DOTAP/DOPC/PEG2K-lipide a ρchg = 3 con S-DNA. In (A) il campione è stato preparato a 30 mg/mL che è la concentrazione comunemente usata negli esperimenti a raggi X a piccolo angolo. Il campione in (A) è stato ampiamente centrifugato per formare un pellet, risospeso e ripreso, ma mostra NP sub-200 nm ben definite. In ρchg= 3, CL𠄽NA NP (frecce solide), liposomi cationici (frecce tratteggiate) e piccole micelle filiformi ramificate (frecce tratteggiate) coesistono all'equilibrio. Alcune delle micelle filiformi sembrano essere sporgenze da CL𠄽NA NP (frecce rosse). In (B) il campione è stato preparato a 3 mg/mL. (C) Un campione preparato a ρchg = 10 e 3 mg/mL (rapporto molare lipidico di 80/15/5 DOTAP/DOPC/PEG2K-lipidi). Il rapporto tra liposomi (frecce tratteggiate) e CL𠄽NA NP (frecce solide) aumenta con ρchg come previsto. Si osservano anche piccole micelle sferiche (frecce tratteggiate). (D) Il potenziale zeta di CL𠄽NA NP a varie % moli di PEG2K-lipidi satura vicino a ρchg≈ 5. Le linee grigie tratteggiate orizzontali e verticali indicano ζ = 0 mV e ρchg = 1, rispettivamente. (E) Grafico del potenziale zeta massimo e minimo per CL𠄽NA NP. Questo potenziale dipende fortemente dalla % molare di lipidi cationici. (F) Un campione di controllo contenente solo liposomi (senza DNA). Anche a un minimo del 5% in moli di lipidi PEG2K, i liposomi unilamellari (freccia solida) coesistono con micelle sferiche (frecce tratteggiate). (G, H) Regioni ritagliate (caselle tratteggiate) da C, F). Sono visibili piccole micelle sotto i 5 nm (frecce tratteggiate) Il DNA di salmone è stato utilizzato in tutti i risultati mostrati.

CL𠄽NA NP coesistono con micelle filiformi ad alte concentrazioni. (UN) NP formati a ρchg = 3 con DOTAP/DOPC/PEG2K-lipidi con rapporto molare 80/15/5. con DNA di salmone. Vicino al bordo del foro di carbonio, coesistono CL𠄽NA NP (freccia continua), liposomi (freccia tratteggiata) e micelle (frecce tratteggiate). I liposomi deformati (frecce rosse) suggeriscono che lo spessore del film d'acqua sospeso è paragonabile al diametro dei liposomi. Ciò è ulteriormente corroborato dall'organizzazione spaziale di tutti gli oggetti in base alle dimensioni. Il centro del film d'acqua mostra micelle filiformi altamente ordinate con spaziatura uniforme. Le estremità delle micelle filiformi sono chiaramente visibili (frecce gialle). Alcune regioni presentano quelle che sembrano pile di micelle ordinate 2D (frecce arancioni). (B) Una trasformata di Fourier 2D della regione scatolata in (A), che mostra due anelli. (C) Un integrale radiale della trasformata di Fourier in (B) mostra due picchi di fattore di struttura sovrapposti a un fattore di forma debole. Le posizioni di picco corrispondono a qSu= n(2π/d) dove d = 14,3 nm (la distanza media tra il centro di due micelle). La variazione di pendenza a qm = 1.672 nm 𢄡 rappresenta un fattore di forma minimo corrispondente allo spessore delle micelle (δm= 3,727nm).

Dispersione della luce dinamica

Le misurazioni delle dimensioni e della carica effettiva dei complessi CL𠄽NA e delle nanoparticelle (NP) sono state eseguite utilizzando un Malvern Nanosizer ZS (Malvern Worcestershire, Regno Unito). Un totale di 2 µg di DNA e la quantità appropriata di liposoma (per ottenere il rapporto di carica lipide/DNA desiderato) sono stati miscelati in 1 mL del tampone appropriato (acqua ad alta resistività o DMEM come indicato nelle figure) e incubati a temperatura ambiente per 20 minuti. La soluzione è stata quindi trasferita in cuvette per la successiva misurazione. I grafici mostrano il diametro medio z Dz che è definito come Dz = 〈D 6 〉/ 〈D 5 〉. 47 Tutte le misurazioni del potenziale zeta sono state eseguite in acqua ad alta resistività. Tutti i punti dati per la diffusione dinamica della luce e il potenziale zeta sono la media di due misurazioni eseguite sullo stesso campione. Le barre di errore mostrano la deviazione standard.

Microscopia a fluorescenza

I campioni per la microscopia a fluorescenza sono stati preparati utilizzando i coloranti descritti in Materiali. È stato preparato un totale di 50 µL di campione alla stessa concentrazione del DLS (0,1 µg di DNA e la quantità appropriata di lipidi in base al rapporto di carica desiderato) e 2 µl di questa soluzione sono stati posti tra un vetrino coprioggetto e un vetrino e sigillato con grasso per vuoto. La soluzione è stata ripresa con un Nikon Diaphot 300 (Nikon (Tokyo, Giappone)) dotato di obiettivo Nikon 1.4 NA 60x Plan Apo DIC e CCD Sensicam QE (PCO (Kelheim, tedesco)).


Astratto

Le interazioni di spin anisotrope misurate per le proteine ​​di membrana nelle micelle debolmente orientate e nei doppi strati lipidici orientati forniscono vincoli ad alta risoluzione indipendenti e potenzialmente complementari per la determinazione della struttura. Qui mostriamo che la proteina di membrana CHIF adotta una struttura simile nelle micelle e nei doppi strati lipidici, consentendo di combinare in modo complementare le restrizioni dei campioni di micelle e doppio strato per migliorare le informazioni strutturali. Il calcolo retrogrado e l'assegnazione dello spettro NMR del CHIF nei doppi strati lipidici orientati, dalla struttura determinata nelle micelle, fornisce restrizioni aggiuntive per la determinazione della struttura e l'orientamento globale della proteina nella membrana. L'uso combinato di vincoli NMR in soluzione e allo stato solido offre anche una convalida incrociata per l'analisi strutturale.

Nei lavori con più autori, l'asterisco indica il nome dell'autore al quale devono essere indirizzate le richieste sul lavoro.


6. Studi di diffusione su bicelle

La diffusione molecolare, in particolare la diffusione traslazionale, è il processo di trasporto più fondamentale in natura. È importante sottolineare che il movimento browniano nei doppi strati lipidici governa una varietà di importanti processi biologici che vanno dalla trasduzione del segnale al trasporto di nutrienti attraverso le membrane cellulari, tanto che un corpo significativo di letteratura è dedicato a questo argomento. Tuttavia, il moto browniano nelle membrane lipidiche può essere estremamente complesso a causa dell'eterogeneità della maggior parte dei sistemi biologici solo un singolo coefficiente elegante, vale a dire il coefficiente di diffusione laterale, cioè la componente del tensore di diffusione che è perpendicolare alla normale del doppio strato, è richiesto per descrivere questo complicato processo. L'eleganza di questo coefficiente risiede nella profondità delle informazioni che contiene, in particolare il rapporto tra il diffusore e il suo ambiente. I coefficienti di diffusione laterale in una membrana cellulare variano per ordini di grandezza: dai fosfolipidi a rapida diffusione alle proteine ​​di membrana multi-elica che si muovono lentamente. Per specie le cui dimensioni sono paragonabili a quelle di un lipide, i loro coefficienti di diffusione sembrano seguire il modello del volume libero mentre le specie più grandi diffondono secondo il modello idrodinamico. Attualmente, la maggior parte dei coefficienti di diffusione sono ottenuti tramite il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP), mentre il tracciamento di singole molecole è sempre più utilizzato per studiare la diffusione delle molecole sul posto. Queste tecniche ottiche sono preziose nel fornire informazioni dettagliate sulla diffusione molecolare, tuttavia, queste tecniche funzionano solo se le molecole sono intrinsecamente fluorescenti. Pertanto, è necessario un approccio alternativo per le molecole prive di tale proprietà ottica e in cui l'introduzione di un tag fluorescente non è un'opzione.

La spettroscopia NMR fornisce un mezzo alternativo per misurare i coefficienti di diffusione in un sistema a membrana modello. In particolare, la tecnica NMR a gradiente di campo pulsato (PFG) introdotta da Stejskal e Tanner [66] si è evoluta in un potente strumento in grado di determinare i coefficienti di diffusione per un'ampia gamma di sistemi macromolecolari. PFG NMR consente la determinazione rapida e simultanea di più coefficienti di diffusione da specie diverse, a condizione che le loro risonanze siano risolvibili. L'uso dell'eco stimolato (STE) è stato successivamente ritenuto vantaggioso per la misura dei coefficienti di diffusione [170]. Le pubblicazioni seminali [66,170] forniscono il quadro teorico di base per le misurazioni della diffusione NMR PFG. Pertanto, qui verrà data solo una breve descrizione. Il coefficiente di diffusione di una specie, D, in condizioni isotrope, può essere estratto da un esperimento STE-PFG NMR misurando l'attenuazione del segnale in funzione della durata del gradiente (δ), ampiezza del gradiente (G) e tempo di diffusione (Δ) come indicato nella sequenza di impulsi di Fig. 9 . L'intensità NMR osservata è attenuata secondo

Sequenza di impulsi NMR STE-PFG composta da tre impulsi a radiofrequenza 90° e due impulsi gradiente di ampiezza e durata identiche. L'esperimento STE-PFG NMR è organizzato in modo tale che il decadimento dell'intensità dell'eco, in funzione di δ, G o Δ, è proporzionale al coefficiente di diffusione della specie di interesse.

dove γ è il rapporto giromagnetico del nucleo osservato e io e io0 sono rispettivamente l'intensità del segnale osservata e quella iniziale [66,170].

La diffusione laterale in un ambiente a doppio strato lipidico è anisotropa tale che il coefficiente di diffusione è rappresentato come un tensore di diffusione secondo

Esiste una simmetria uniassiale intorno alla normale a doppio strato e quindi sono necessarie solo due componenti principali per rappresentare il sistema. Queste due componenti corrispondono alla diffusione molecolare lungo la perpendicolare (D) e parallelo (D||) direzioni alla normale al doppio strato come illustrato in Fig. 8 .

In un sistema a doppio strato lipidico, sono necessari solo due componenti per descrivere il tensore di diffusione. L'orientamento relativo della normale al doppio strato e quindi le principali componenti della diffusione rispetto al campo magnetico esterno è descritto dall'angolo θ. Determina la componente D z z lab del tensore di diffusione che si allinea con il campo magnetico e può essere misurata.

Se il gradiente viene applicato lungo il laboratorio z-asse, scelto lungo la direzione del campo magnetico esterno B0 (vedi Fig. 8 ), allora solo il Dzz viene misurata la componente del tensore di diffusione nel frame di laboratorio. La relazione tra Dzz e le componenti principali della struttura molecolare, che si allineano parallelamente e perpendicolarmente alla normale del doppio strato come sopra descritto, sono date da

Se le molecole che formano la fase hanno una bassa concentrazione micellare critica (CMC), come è tipico per i lipidi in generale, allora non c'è diffusione rilevabile parallela alla normale del doppio strato, D|| = 0. Quindi, solo il termine Dzz = Dpeccato 2 θ rimane nell'eq. (3). È interessante notare che, nel caso in cui la normale al doppio strato sia perpendicolare al gradiente applicato, il coefficiente di diffusione osservato nel frame di laboratorio (Dzz) è uguale a quella della diffusione laterale (D) nel doppio strato lipidico. Pertanto, per misurare il coefficiente di diffusione di una molecola in un sistema a doppio strato lipidico, è necessario un campione allineato e le bicelle forniscono un mezzo adatto allo scopo. Recentemente, Soong e Macdonald [171] hanno dimostrato la fattibilità della misurazione della diffusione di un lipide innestato con polimero, vale a dire DMPEPEG2000, in bicelle allineate magneticamente utilizzando la tecnica NMR STE-PFG, la sequenza di impulsi è mostrata in Fig. 9.

Il coefficiente di diffusione viene misurato monitorando il decadimento dell'intensità del segnale 1 H dei lipidi innestati con polimero in funzione della durata del gradiente. Il rapido movimento interno del PEG produce una stretta risonanza di 1 H, che ha reso possibile la misurazione. Il coefficiente di diffusione misurato è risultato essere paragonabile in grandezza alle misurazioni FRAP di DMPC nella fase liquido cristallina [171]. Pertanto, questo illustra la fattibilità delle bicelle come mezzo per gli studi di diffusione laterale degli anfifili associati alla membrana in un ambiente a doppio strato. I risultati dimostrano anche la possibilità di estrarre il coefficiente di diffusione di una proteina di membrana tramite STE-PFG NMR, che è importante per la nostra comprensione del traffico di proteine ​​nei doppi strati lipidici. Pertanto, questo illustra che le bicelle sono più di un semplice mezzo di ricostituzione per le proteine ​​di membrana, infatti, possono essere utilizzate come piattaforma per studi di diffusione laterale tramite NMR. Anche in queste misurazioni di diffusione è stato ottenuto un risultato interessante per quanto riguarda la morfologia delle bicelle: i costituenti molecolari mostrano diffusione libera su distanze di micron. Questa osservazione è coerente con la morfologia delle lamelle perforate delle bicelle [172] e conferma anche i dati SANS [159] e gli studi sulla diffusione del tetrametilsilano in soluzioni bicelle diluite [156].

Gli studi di diffusione possono essere effettuati anche su bicelle con bassa Q rapporti (0,5 ≤ Q ≤ 1). A causa delle loro piccole dimensioni, queste bicelle rotolano isotropicamente, quindi sono adatte per studi ad alta risoluzione delle proteine ​​di membrana. È interessante notare che le bicilette con un basso Q ratio esistono come aggregati simili a dischi e sono relativamente monodispersi nel loro diametro e spessore. In Q = 0,5, il loro diametro stimato è di circa 8 nm, il doppio dello spessore del doppio strato ipotizzato [152]. Il diametro di queste bicelle a caduta rapida cambia in presenza di peptidi associati alla membrana. Recentemente, queste bicelle sono state utilizzate per la misurazione dei coefficienti di diffusione laterale di peptidi leganti la membrana ei risultati sono paragonabili ai valori di letteratura. Sebbene questi esperimenti dimostrino la fattibilità dell'uso di bicelle per studi di diffusione, è necessario prestare attenzione poiché il coefficiente di diffusione laterale viene misurato in senso relativo poiché tutti i componenti nel campione si diffondono a velocità diverse. In particolare, la bicella lipidica nel suo insieme non fornisce un quadro di riferimento stazionario, poiché essa stessa subisce una sostanziale diffusione laterale. Tuttavia, queste bicelle sono eccellenti sistemi di membrana modello per lo studio della cinetica di legame di peptidi e anfifili associati alla membrana.

Le misurazioni della diffusione mediante PFG NMR sono state utilizzate per studiare la morfologia di tre mezzi comunemente usati nello studio degli accoppiamenti dipolari residui, vale a dire le bicelle lipidiche orientate, il bromuro di cetilpiridinio e una miscela di PEG e n-esanolo [156]. Il raggio idrodinamico delle micelle e delle bicelle isotrope è stato misurato mediante gradienti pulsati bipolari [173]. In queste misurazioni, il lisozima è stato utilizzato come composto di riferimento per correggere le differenze di volume idrodinamico tra proteine, bicelle o micelle secche e idratate. Il movimento dei lipidi costituenti nelle bicelle isotrope è stato studiato mediante rilassamento del 13 C, PFG NMR ed EPR [174]. È stato riscontrato che la mobilità locale dipende molto più fortemente dal detersivo utilizzato che dalle dimensioni delle bicelle. È stato scoperto che diversi peptidi hanno un impatto sulla dinamica apparente. In uno studio successivo, le misurazioni della diffusione sono state utilizzate per studiare la dimensione e la forma delle bicelle di bassa Q rapporto che cade isotropicamente [175]. Tre diversi componenti lipidici a catena lunga, vale a dire dilauroilfosfatidilcolina (DLPC), DMPC e DPPC, sono stati utilizzati per studiare la dinamica dei lipidi in funzione dello spessore del doppio strato [176].

La diffusione rotazionale riguarda i gradi di libertà rotazionali di una molecola in contrasto con il movimento traslazionale discusso finora. I lipidi e le proteine ​​in un campione a doppio strato subiscono una diffusione rotazionale, che avviene più liberamente intorno al normale a doppio strato. Di solito è veloce sulla scala temporale NMR, purché vengano studiate proteine ​​e peptidi di dimensioni molecolari moderate. Negli spettri NMR, la diffusione rotazionale diventa evidente dalla forma della linea NMR osservata poiché la media delle interazioni di spin anisotrope lungo l'asse di rotazione altera la forma della linea spettrale e l'entità dell'interazione. Di conseguenza, le vescicole multilamellari (MLV) possono potenzialmente fornire le stesse informazioni dei campioni orientati macroscopicamente [6,7,177,178] e la scelta è principalmente determinata dalla facilità di preparazione e da problemi di sensibilità. Tuttavia, è stato riportato che le misurazioni strutturali per il peptide antimicrobico PGLa possono essere influenzate da diversi livelli di idratazione presenti nei MLV rispetto ai dati ottenuti da campioni macroscopicamente orientati costituiti da pile di lastre di vetro [7]. Per le bicelle a forma di disco, la diffusione rotazionale attorno al doppio strato normale è risultata abbastanza veloce da mediare la distribuzione cilindrica attorno a quell'asse, anche nei rari casi in cui la stessa proteina incorporata non subisce una diffusione rotazionale abbastanza veloce per la media richiesta [179 ]. Di conseguenza, anche proteine ​​e complessi proteici molto grandi sono suscettibili di studi su bicelle non capovolte.


Cosa sono le micelle? (con immagini)

Le micelle sono sfere di lipidi che si formano in soluzioni acquose. Negli esseri umani, si formano da sali biliari. Questi aggregati micellari aiutano a trasportare i prodotti digestivi dei lipidi all'intestino per essere assorbiti. Inoltre, sono usati come detersivi.

Una parte del cibo che mangiamo è composta da oli e grassi. Questi vengono degradati durante la digestione nello stomaco, da un enzima lipasi, in composti simili ai lipidi, inclusi gli acidi grassi. Un'ulteriore degradazione avviene nel pancreas utilizzando una lipasi diversa. Le lipasi sono solubili in acqua, a differenza dei composti che degradano. La degradazione richiede l'ausilio di detergenti biologici noti come sali biliari, secreti dalla cistifellea e dal fegato.

Le micelle sono prodotte dai sali biliari che aiutano a rendere gli acidi grassi e altri prodotti di degradazione dei lipidi disponibili per la degradazione da parte di una lipasi. Il principio della formazione delle micelle è come quello dell'olio che non si mescola con l'acqua. Molte classi di lipidi hanno un gruppo capo che è polare e interagisce bene con l'acqua. Hanno anche due gruppi di coda che sono idrofobici. Questi gruppi di coda non interagiscono bene con l'acqua e preferiscono essere in gruppi con altre molecole idrofobe, come una forma di olio.

A basse concentrazioni, i lipidi e gli acidi grassi sono solubili in acqua. Il fattore trainante per la formazione delle micelle è quando questi composti raggiungono una concentrazione più elevata, nota come concentrazione micellare critica (CMC). A concentrazioni maggiori del CMC, i gruppi della coda idrofoba si uniscono spontaneamente per evitare l'acqua. I gruppi di teste polari sporgono, rivolti verso l'acqua, mentre il centro è pieno di code idrofobiche che escludono l'acqua. This generally gives the miceller aggregates the structure of a sphere, although they can be shaped like a disk.

Mixed micelles can be composed of various compounds that are not very soluble in water. These compounds are dissolved in the center of the sphere where they can blend in with the hydrophobic tails. In this manner, they are transported by micellar aggregates of bile salts to the intestine to be further broken down. These structures are the major way in which lipids get to the cell surface of the intestine to be absorbed. The rate of transport can be increased 1,000 times over that of individual fatty acids.

Cholesterol secreted by the liver can also travel in bile, in micelles. It is virtually insoluble in aqueous solutions, but is soluble in mixed micelles. Sometimes the body produces super-saturated bile with a high ratio of cholesterol. This can lead to gallstone formation. Other types of compounds that travel in these micellar aggregates are lipid-soluble vitamins, such as A, D, E, and K.

The structure of micelles is very similar to the lipid bilayer of biological membranes. The bilayers have the same type of interactions. The lipids, however, face each other giving a double layer of lipids instead of a sphere. The principle is the same as the structure of micellar aggregates with a hydrophobic interior and a polar exterior. Some types of lipids can readily exchange into the cellular membrane, from the micellar aggregrate.

Lipid bilayers can join ends to form a circle known as a liposome. These structures have an internal compartment. Liposomes are being used medically as carriers for drugs and enzymes. This allows doctors to target particular organs. It helps to avoid side effects like tissue damage and drug breakdown that can happen as drugs are introduced into the body by normal methods.

The compounds that make up micelles are also known as surfactants. These are compounds that are soluble in both oil and water. They allow compounds that are barely soluble in water to accumulate to higher concentrations within the micellar aggregates. The surfactant properties of these aggregates make them useful as detergents. They can dissolve oily deposits on clothes that will not wash off in water.

There is another type of micelle that is the reverse of the oil-in-water type. It has water-soluble substances dissolved in an organic solution. In this case, however, the polar head groups are in the center of the micelles, while the hydrophobic groups are on the outside, interacting with the organic solvent.


Astratto

Cellular respiration, mediated by the passive diffusion of oxygen across lipid membranes, is key to many basic cellular processes. In this work, we report the detailed distribution of oxygen across lipid bilayers and examine the thermodynamics of oxygen partitioning via NMR studies of lipids in a small unilamellar vesicle (SUV) morphology. Dissolved oxygen gives rise to paramagnetic chemical shift perturbations and relaxation rate enhancements, both of which report on local oxygen concentration. From SUVs containing the phospholipid sn-2-perdeuterio-1-myristelaidoyl, 2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (MLMPC), an analogue of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), we deduced the complete trans-bilayer oxygen distribution by measuring 13 C paramagnetic chemical shifts perturbations for 18 different sites on MLMPC arising from oxygen at a partial pressure of 30 bar. The overall oxygen solubility at 45 °C spans a factor of 7 between the bulk water (23.7 mM) and the bilayer center (170 mM) and is lowest in the vicinity of the phosphocholine headgroup, suggesting that oxygen diffusion across the glycerol backbone should be the rate-limiting step in diffusion-mediated passive transport of oxygen across the lipid bilayer. Lowering of the temperature from 45 to 25 °C gave rise to a slight decrease of the oxygen solubility within the hydrocarbon interior of the membrane. An analysis of the temperature dependence of the oxygen solubility profile, as measured by 1 H paramagnetic relaxation rate enhancements, reveals that oxygen partitioning into the bilayer is entropically favored (ΔS° = 54 ± 3 J K −1 mol −1 ) and must overcome an enthalpic barrier (Δh° = 12.0 ± 0.9 kJ mol −1 ).


Department of Biology (M 694), University of Konstanz, 78457 Konstanz, Germany

Department of Biology (M 694), University of Konstanz, 78457 Konstanz, Germany

Professor of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia, PO Box 800736, Charlottesville, VA 22908-0736, USA

Riepilogo

Thermodynamic Stability of FepA in Detergent Micelles

Thermodynamic Stability of OmpA in Phospholipids Bilayers

Thermal Stability of FhuA in Detergent Micelles

Insertion and Folding of β-Barrel Membrane Proteins in Micelles

Oriented Insertion and Folding into Phospholipid Bilayers

Assemblies of Amphiphiles Induce Structure Formation in β-Barrel Membrane Proteins

Electrophoresis as a Tool to Monitor Insertion and Folding of β-Barrel Membrane Proteins

pH and Lipid Headgroup Dependence of the Folding of β-Barrel Membrane Proteins

Rate Law for β-Barrel Membrane Protein Folding and Lipid Acyl Chain Length Dependence

Synchronized Kinetics of Secondary and Tertiary Structure Formation of the β-Barrel OmpA

Interaction of OmpA with the Lipid Bilayer is Faster than the Formation of Folded OmpA

Multistep Folding Kinetics and Temperature Dependence of OmpA Folding

Characterization of Folding Intermediates by Fluorescence Quenching

The β-Barrel Domain of OmpA Folds and Inserts by a Concerted Mechanism

Stoichiometry of the Lipid–Protein Interface

Lipid Selectivity of β-Barrel Membrane Proteins

Lipid Dependence of the β-Barrel Orientation Relative to the Membrane

Inclination of the β-Strands Relative to the β-Barrel Axis in Lipid Bilayers