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Perché sono necessarie le colture batteriche?

Perché sono necessarie le colture batteriche?


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Noto che in molte procedure di analisi dei batteri il campione deve essere coltivato. Si posiziona il campione in agar o in un altro mezzo di crescita e si attende la proliferazione dei batteri prima di esaminarli.

Perché è necessario? Se i batteri sono presenti nel campione, non puoi semplicemente esaminare il campione direttamente con un microscopio per trovarli? È un problema di un ago in un pagliaio?

Ad esempio, un batterio listeria ha una dimensione di circa 1 micrometro e ha una colorazione di Gram positiva. Quindi, con un ingrandimento 1000x, l'organismo avrebbe una dimensione di 1 mm nell'obiettivo che è altamente visibile. Anche con un ingrandimento di 100x dovresti essere ancora in grado di vedere un piccolo punto ed essere in grado di ingrandire il punto.


Con solo un microscopio, potresti essere in grado di trovare i batteri, ma come fai a sapere che tipo di batterio è?

Prendendo Listeria, al microscopio, sembra una piccola bacchetta. Bene, così fanno molti altri batteri. Se vedi solo quel batterio, non puoi prenderlo e fare ulteriori test con esso, puoi solo vederlo.

Quindi facciamo colture, dove i batteri si moltiplicano e formano colonie. Che crescano anche in queste condizioni ti dice già molto: molte specie batteriche non creeranno colonie su Il tipo di colonia è un altro fattore nel determinare quale batterio stiamo guardando: ha bordi sfocati o chiari, di che colore è, è "lucido"?

E poi, con quella coltura, si possono fare ulteriori test, come quali sostanze chimiche il batterio in questa colonia può scomporre, cosa producono, se possono essere macchiati con determinati coloranti, ecc. Molte volte questo è necessario perché i batteri sembrano molto allo stesso modo (rotondo o con aste).

Per Listeria in particolare, ci sono piastre speciali utilizzate come mezzo di crescita a cui sono state aggiunte alcune sostanze chimiche che fanno apparire le loro colonie rosso-viola. Altre specie batteriche non mostreranno questo colore anche se crescono sui piatti.


Le linee cellulari e i microrganismi non possono essere mantenuti in coltura indefinitamente a causa del graduale aumento dei metaboliti tossici, dell'uso di nutrienti e dell'aumento del numero di cellule dovuto alla crescita. Una volta che i nutrienti sono esauriti e i livelli di sottoprodotti tossici aumentano, i batteri nella coltura notturna entrano nel fase stazionaria, dove la proliferazione è notevolmente ridotta o cessata (il valore della densità cellulare si stabilizza). Quando i microrganismi di questa coltura notturna vengono trasferiti nel terreno fresco, i nutrienti innescano la crescita del microrganismo e questo passa attraverso il terreno fase di latenza, un periodo di lenta crescita e adattamento al nuovo ambiente, e poi il fase di registro, un periodo in cui le cellule crescono in modo esponenziale. [1]

La subcoltura viene quindi utilizzata per produrre una nuova coltura con una densità di cellule inferiore rispetto alla coltura originaria, nutrienti freschi e nessun metabolita tossico che consente una crescita continua delle cellule senza rischio di morte cellulare. La subcoltura è importante sia per la proliferazione (ad esempio un microrganismo come E. coli) e non proliferanti (ad es. globuli bianchi differenziati in modo terminale). La subcoltura può essere utilizzata anche per i calcoli della curva di crescita (es. tempo di generazione) [2] e ottenere microrganismi in fase logaritmica per esperimenti (es. Trasformazione batterica). [3]

Tipicamente, la sottocoltura proviene da una coltura di un certo volume in un terreno di crescita fresco di uguale volume, questo consente il mantenimento a lungo termine della linea cellulare. La subcoltura in un volume maggiore di terreno di coltura viene utilizzata quando si desidera aumentare il numero di cellule per, ad esempio, l'uso in un processo industriale o in un esperimento scientifico.

Spesso è importante registrare il numero approssimativo di divisioni che le cellule hanno avuto in coltura registrando il numero di passaggi o sottoculture. Nel caso delle cellule dei tessuti vegetali, la variazione somaclonale può manifestarsi per lunghi periodi in coltura. Allo stesso modo nelle linee cellulari di mammifero le aberrazioni cromosomiche hanno la tendenza ad aumentare nel tempo. Per i microrganismi c'è una tendenza ad adattarsi alle condizioni di coltura, che raramente sono esattamente come l'ambiente naturale del microrganismo, che può alterare la loro biologia.

Il protocollo per la subcoltura delle cellule dipende fortemente dalle proprietà delle cellule coinvolte.

Celle non aderenti Modifica

Molti tipi di cellule, in particolare molti microrganismi, crescono in soluzione e non sono attaccati a una superficie. Questi tipi di cellule possono essere subcoltivati ​​semplicemente prelevando un piccolo volume della coltura madre e diluendolo in un terreno di coltura fresco. La densità cellulare in queste colture viene normalmente misurata in cellule per millilitro per cellule eucariotiche di grandi dimensioni o come densità ottica per luce a 600 nm per cellule più piccole come i batteri. Le cellule avranno spesso un intervallo preferito di densità per una crescita ottimale e la subcoltura normalmente cercherà di mantenere le cellule in questo intervallo.

Cellule aderenti Modifica

Le cellule aderenti, ad esempio molte linee cellulari di mammiferi, crescono attaccate a una superficie come il fondo del pallone di coltura. Questi tipi di cellule devono essere staccati dalla superficie prima di poter essere subcoltivati. Per le cellule aderenti la densità cellulare viene normalmente misurata in termini di confluenza, la percentuale della superficie di crescita coperta dalle cellule. Le cellule avranno spesso un intervallo preferito di confluenze per una crescita ottimale, ad esempio una linea cellulare di mammifero come HeLa o Raw 264,7 generalmente preferisce confluenze superiori al 10% ma inferiori al 100% e la sottocoltura normalmente cercherà di mantenere le cellule in questo intervallo. Per le sottoculture le cellule possono essere staccate con uno dei diversi metodi, incluso il trattamento con tripsina per abbattere le proteine ​​responsabili dell'adesione superficiale, chelando gli ioni calcio con EDTA che interrompe alcuni meccanismi di adesione proteica o metodi meccanici come il lavaggio ripetuto o l'uso di un raschietto cellulare. Le cellule distaccate vengono quindi risospese in un terreno di crescita fresco e lasciate che si stabilizzino nuovamente sulla loro superficie di crescita.


L'importanza dei batteri per l'uomo

Il latte di una mucca sana inizialmente contiene pochissimi batteri, che provengono principalmente dalla pelle della mucca e dalle procedure di manipolazione del latte. Il latte è un eccellente mezzo di crescita per numerosi batteri e i batteri possono aumentare rapidamente di numero a meno che il latte non venga lavorato correttamente. La crescita batterica può rovinare il latte o addirittura rappresentare un serio rischio per la salute se sono presenti batteri patogeni. Le malattie che possono essere trasmesse da una mucca infetta includono la tubercolosi (Mycobacterium tuberculosis), febbre ondulante (Brucella aborto), e la febbre Q (Coxiella burnetii). Inoltre, la febbre tifoide (Salmonella typhi) può essere trasmessa attraverso il latte di un allevatore di latte infetto. Le procedure di pastorizzazione aumentano la temperatura del latte a 63 °C (145 °F) per 30 minuti o a 71 °C (160 °F) per 15 secondi, uccidendo qualsiasi batterio patogeno che potrebbe essere presente, sebbene queste procedure non uccidere tutti i microrganismi.

Alcuni batteri convertono il latte in latticini utili, come latticello, yogurt e formaggio. Il latticello coltivato commercialmente è preparato da latte inoculato con una coltura starter di lattococco (generalmente L. lactis o L. lactis cremoris). Yogurt e altri prodotti a base di latte fermentato sono prodotti in modo simile utilizzando diverse colture di batteri. Molti formaggi sono prodotti anche attraverso l'azione dei batteri. Crescita nel latte di un batterio acidogeno come L. lactis fa precipitare la caseina sotto forma di cagliata. Dopo la rimozione dell'umidità e l'aggiunta di sale, la cagliata viene lasciata maturare per azione di altri microrganismi. Batteri diversi conferiscono agli alimenti sapori e caratteristiche differenti, ad esempio la miscela di Lactobacillus casei, Streptococcus thermophilus, e Propionibacterium shermanii è responsabile della stagionatura del formaggio svizzero e della produzione del suo gusto caratteristico e delle grandi bolle di gas. Inoltre, Biancheria Brevibacterium è responsabile del sapore del formaggio Limburger e delle muffe (Penicillium specie) sono utilizzati nella produzione di formaggi Roquefort e Camembert. Altri tipi di batteri sono stati a lungo utilizzati nella preparazione e conservazione di vari alimenti prodotti attraverso la fermentazione batterica, inclusi prodotti in salamoia, crauti e olive.

Le tossine di molti batteri patogeni che vengono trasmesse negli alimenti possono causare intossicazione alimentare se ingerite. Questi includono una tossina prodotta da Staphylococcus aureus, che provoca un disturbo gastrointestinale rapido, grave, ma limitato, o la tossina di Clostridium botulinum, che è spesso letale. La produzione di tossina botulinica può verificarsi in cibi in scatola non acidi che sono stati cotti in modo incompleto prima della sigillatura. C. botulinum forma spore resistenti al calore che possono germinare in cellule batteriche vegetative che prosperano nell'ambiente anaerobico, che è favorevole alla produzione della loro tossina estremamente potente. Altre infezioni di origine alimentare sono effettivamente trasmesse da un manipolatore di alimenti infetto, tra cui febbre tifoide, salmonellosi (Salmonella specie) e shigellosi (Shigella dysenteriae).


Guardiani della Galassia Microbica

Nel 1986, Yiu-Kwok Chan di Agriculture Canada ha identificato una nuova specie batterica. Seguendo il protocollo standard, lo ha depositato nell'American Type Culture Collection (ATCC), un archivio in cui gli scienziati conservano nuovi ceppi microbici. È rimasto lì per decenni fino al 2020 quando è stato notato da Roland Wilhelm, un ricercatore post-dottorato presso la Cornell University, per la sorprendente somiglianza con un diverso gruppo di batteri. Wilhelm ha ottenuto una fiala del ceppo di Chan dall'ATCC e ha utilizzato una nuova tecnologia di sequenziamento del DNA per confermare che il ceppo del 1986 era in realtà una specie del Paraburkholderia batteri che stava attualmente studiando. Questa rivelazione è stata possibile solo grazie all'archivio batterico, che è servito da collegamento fondamentale tra questi due ricercatori in diverse epoche della scienza.

Tenere traccia dell'evoluzione microbica globale è un compito impegnativo. I microbi formano nuove specie più velocemente degli umani e di molti altri animali che si riproducono sessualmente e il numero di specie microbiche scoperte dagli scienziati è cresciuto costantemente nel corso degli anni. Tuttavia, alcune stime suggeriscono che i tassi di estinzione batterica sono così vicini al tasso di formazione di nuove specie che la maggior parte dei lignaggi batterici che siano mai esistiti è ora estinta. I microbi sono noti per essere essenziali per il ciclo dei nutrienti, la produttività agricola e la salute del suolo, la produzione di antibiotici e composti antitumorali e la protezione della salute dell'intestino e del sistema immunitario. Tuttavia, stiamo ancora esplorando e imparando a conoscere il mondo microbico, il che rende ancora più importante pensare alla conservazione microbica.

Le raccolte di colture preservano la diversità microbica, proprio come una banca di semi preserva la diversità genetica delle piante. Il World Data Center for Microorganisms riporta una raccolta di colture microbiche in quasi ogni parte del mondo e, insieme, contengono oltre due milioni di colture batteriche, fungine e virali. Questo numero non è che una piccola frazione della prolifica diversità microbica della Terra.

Le collezioni di colture microbiche possono ricevere campioni da qualsiasi parte del mondo, ma alcune località producono più microbi di altre. La Jena Microbial Resource Collection riceve culture da tutto il mondo, ma in particolare dai paesi asiatici, secondo Michael Ramm, membro dello staff del JMRC. Alcuni paesi o istituzioni sono attualmente hotspot di scoperta microbica e ospitano sforzi di isolamento su larga scala. Sentiamo spesso parlare di hotspot di biodiversità e storie di estinzione cautelativa come l'uccello dodo, ma la conservazione microbica è raramente parte della conversazione pubblica.

Uno dei motivi per cui non pensiamo alla conservazione microbica è che la maggior parte dei microbi sono invisibili a occhio nudo e difficili da coltivare al di fuori dei loro habitat naturali, meno del 2% dei batteri ambientali può essere coltivato in laboratorio. Ciò rende la conservazione e la coltura dei microbi un processo complicato che richiede la ricerca di una combinazione sfuggente di nutrienti, sali e condizioni atmosferiche. Possono volerci mesi o addirittura anni prima che gli scienziati estraggano un microbo dal suo habitat.

I ricercatori hanno bisogno di archivi come le collezioni di cultura globale per garantire la conservazione a lungo termine delle preziose culture che possono essere coltivate. Kirk Broders, curatore della NRRL Culture Collection a Peoria, Illinois, è entusiasta del potenziale di tali collezioni. &ldquoConnettersi e fornire risorse ai ricercatori di tutto il mondo che stanno conducendo ricerche interessanti . è la parte più eccitante del mio lavoro. C'è anche la semplice gioia di coltivare, coltivare e ammirare il colorato serraglio di bellissimi funghi e batteri.&rdquo

In superficie, potrebbe sembrare che queste collezioni stiano catalogando le culture in modo molto simile a un museo microbico. Tuttavia, il vero valore di questi depositi risiede nel loro potenziale per la scienza: il prossimo nuovo antibiotico, un composto che cura il cancro o un microbo che riduce le emissioni di gas serra potrebbe nascondersi in quelle fiale. "Nella scienza, può essere difficile prevedere quali ceppi biologici possono diventare clinicamente significativi", afferma Sarah Alexander, curatrice della National Collection of Type Cultures (NCTC). &ldquoQuando uno scienziato deposita ceppi, questo materiale è disponibile per la prossima generazione di scienziati e sarà sempre recuperabile.&rdquo

Le raccolte consentono agli scienziati di assicurarsi che il ceppo con cui stanno lavorando oggi sia lo stesso utilizzato in uno studio 30 anni fa, come nella storia di Wilhelm. Questo è il motivo per cui molte collezioni culturali stanno iniziando a rafforzare le restrizioni affinché un ceppo presentato venga riconosciuto come membro ufficiale della collezione. In passato, l'esame microscopico di una coltura potrebbe essersi dimostrato sufficiente, ma i depositi come l'NRRL stanno iniziando a richiedere un'ulteriore misura di sicurezza che prevenga la contaminazione: la sequenza genica del ceppo presentato deve corrispondere a ciò che lo scienziato ha trovato in laboratorio. Molti microbi possono anche evolversi molto rapidamente e anche pochi mesi di vita in laboratorio possono far sembrare un ceppo diverso da quando è stato identificato per la prima volta. Una volta che un microbiologo verifica che le sequenze geniche corrispondano, i ceppi vengono conservati mediante crioconservazione, il processo di conservazione a lungo termine utilizzando temperature ultrafredde o congelamento rapido con azoto liquido.

Le collezioni culturali sono chiaramente entità critiche che aiutano a rendere la scienza più aperta, collaborativa e riproducibile. Preservano l'attuale diversità microbica della Terra e possono contenere le chiavi microscopiche per risolvere molte sfide globali urgenti. Sono anche le biblioteche del mondo microbico e ogni ceppo ha una storia unica il primo isolato batterico nel NCTC è stato isolato da un soldato della prima guerra mondiale e viene utilizzato per combattere la dissenteria. Alexander è a conoscenza della storia e della promessa dei ceppi. &ldquoMantenere, preservare e far crescere la collezione che contiene oltre 6.000 ceppi di oltre 900 diverse specie batteriche è un privilegio. Una collezione di culture è un deposito biologico. per cui possiamo preservare queste mostre viventi per assicurarci che siano disponibili per la ricerca.&rdquo


È un fattore ambientale essenziale che può influenzare la crescita degli organismi. La maggior parte degli agenti patogeni cresce a 37 ° C (temperatura corporea). I batteri sono classificati in tre gruppi in base all'intervallo di temperatura ottimale

  • mesofilo: L'intervallo di temperatura ottimale per i mesofili è compreso tra 25 0 C e 40 0 ​​La maggior parte dei batteri patogeni rientra in questo gruppo.
  • Psicrofilo: La temperatura ottimale per gli psicrofili è inferiore a 20 0
  • Termofilo: L'intervallo di temperatura ottimale per i termofili è da 55 0 C a 80 0 Ad esempio: Bacillus stearothermophilus.

Il pH è un fattore essenziale per la crescita dei microbi. I batteri di maggio sono in grado di produrre diversi acidi organici che riducono il pH del terreno e limitano anche la crescita di altri batteri. A parte questo, alcuni costituenti dei mezzi possono essere influenzati da un pH basso. Pertanto, mantenere il pH ottimale è molto importante per ottenere una crescita adeguata degli organismi. Gli agenti patogeni richiedono per lo più un pH neutro (7,2). Tuttavia, batteri industrialmente importanti come Lactobacillus lactis richiede un pH più basso per una crescita ottimale.


Cos'è la Cultura?

La coltura microbica è un metodo per coltivare e mantenere i microrganismi in condizioni di laboratorio per scopi diversi. Le colture vengono coltivate in terreni solidi, semisolidi e liquidi in base al tipo e allo scopo della coltura del microrganismo. Le colture sono fornite dei nutrienti necessari e delle condizioni di crescita richieste dai microrganismi. Ci sono diversi componenti di un mezzo di coltura come fonte di energia, fonte di carbonio, fonte di azoto, minerali, micronutrienti, acqua, agente solidificante, ecc. La temperatura ottimale, l'ossigeno e il pH dovrebbero essere regolati in base al tipo di microrganismo coltivato.

Esistono diversi tipi di colture microbiche, ad esempio, coltura in batch, coltura continua, coltura stab, coltura su piastra di agar, coltura in brodo, ecc. A seconda della composizione del terreno di coltura, esistono diversi tipi di terreni di coltura noti come terreni sintetici, semi -mezzi sintetici e mezzi naturali. Le colture microbiche vengono preparate in condizioni sterili all'interno di una camera speciale chiamata flusso d'aria laminare. Il terreno di coltura e la vetreria vengono sterilizzati prima dell'inoculazione del microrganismo desiderato. In condizioni sterili adeguate, il microrganismo bersaglio viene trasferito nel mezzo nutritivo sterilizzato e incubato alla temperatura ottimale. All'interno del terreno, il microrganismo crescerà e si moltiplicherà utilizzando i nutrienti forniti.

Figura 3: Una coltura batterica su piastra


Focus dello scienziato della creazione 3.1

Carl Fliermans e la sua ricerca su Legionella

Il Dr. Carl B. Fliermans è un ecologista microbico con DuPont e fa parte del comitato consultivo tecnico presso l'Institute for Creation Research. Ha conseguito un dottorato di ricerca. in microbiologia presso l'Università dell'Indiana e una borsa di studio post-dottorato presso il National Institutes of Health. Il Dr. Fliermans è lo scienziato che per primo ha isolato il batterio "Malattia del legionario". Ha pubblicato oltre 60 lavori ed è membro, tra gli altri, dell'American Society for the Advancement of Science, dell'American Institute for the Biological Sciences e dell'American Society for Microbiology. Il dottor Fliermans è un cristiano che crede che il Creatore lo abbia guidato nella sua scoperta di Legionella.

Agosto 1976 Titolo di giornale: "La malattia misteriosa colpisce i legionari"

In uno degli ingressi più drammatici di qualsiasi malattia nell'arena della sanità pubblica, la malattia del legionario è apparsa alla Convenzione del bicentenario degli Stati Uniti della Legione americana, dal 21 al 23 luglio 1976, a Filadelfia. Quasi 5.000 legionari hanno partecipato all'incontro di tre giorni, con oltre 600 che hanno soggiornato presso l'elegante ma datato Bellevue Stratford Hotel. Anche prima di lasciare l'hotel, diversi legionari hanno iniziato a sentirsi male con sintomi simil-influenzali. Martedì 27 luglio, solo quattro giorni dopo aver lasciato Filadelfia, un veterano dell'Air Force che era rimasto al Bellevue Stratford durante la convention è morto in un ospedale di Sayre, in Pennsylvania. Fu il primo di oltre 30 legionari a soccombere alla fine a una polmonite letale che i media chiamarono rapidamente "malattia del legionario". Qual è stata la causa di questa nuova malattia?

  • Era biologico o chimico?
  • Da dove veniva l'agente patogeno, se ce n'era uno?
  • Come si è diffusa la malattia?
  • Come si potrebbe prevenire la malattia?

Queste domande chiave e altre sono diventate il fulcro di un'intensa indagine che ha portato alla scoperta nel gennaio 1977 che un batterio Gram-negativo a forma di bastoncino ha causato la malattia. Il batterio è stato chiamato Legionella pneumophila. I bravi microbiologi come il Dr. Joseph McDade e più tardi il Dr. Fliermans hanno considerato le fonti patogene in natura, le vie di trasmissione alle persone suscettibili e i mezzi per prevenire la diffusione di agenti patogeni. Il loro processo illustra come vengono utilizzate le tecniche classiche per dimostrare la causa di una specifica malattia.

Indagine sull'eziologia della malattia del legionario e riassume i postulati di Koch.

L'illustrazione sopra traccia l'indagine sull'eziologia della malattia del legionario e riassume i postulati di Koch. La malattia del legionario è stata riconosciuta per la prima volta nell'agosto 1976. Ci sono voluti più di sei mesi prima che i postulati di Koch fossero soddisfatti e Legionella pneumophila è stato dichiarato l'agente eziologico della malattia. In primo luogo, se l'agente eziologico fosse biologico, allora si doveva riscontrare che l'agente era regolarmente associato alla malattia. I tessuti delle biopsie polmonari e dei campioni di espettorato sono stati esaminati per un microrganismo ricorrente. Nei campioni è stato costantemente rilevato un bastoncino Gram-negativo con la tendenza a formare lunghi filamenti ad anello. In secondo luogo, il batterio appena scoperto è stato isolato in coltura pura in laboratorio. Questo ha richiesto l'apprendimento L. pneumophilaesigenze nutrizionali e la progettazione di terreni di crescita speciali che soddisfino questi requisiti, supportando la crescita del batterio. Terzo, era necessario un animale suscettibile per dimostrarlo L. pneumophila potrebbe produrre malattie, in particolare una malattia respiratoria simile alla malattia del legionario negli esseri umani. La cavia si è rivelata il modello animale preferito. Finalmente, L. pneumophila è stato recuperato da cavie infette per verificare che avesse stabilito un'infezione.

Isolamento iniziale dell'agente causale

Attraverso una serie di esperimenti, il dottor McDade e il suo team hanno scoperto per la prima volta da campioni clinici nel gennaio 1977 le prove dell'esistenza e della patogenesi del batterio che causa la malattia del legionario. Il primo passo è stato quello di rimuovere campioni di polmone da un legionario deceduto. Queste cellule sono state macinate, iniettate nelle uova di gallina e incubate. Dopo il periodo di incubazione, le uova sono state rotte e il sacco vitellino estratto e iniettato nelle zampe delle cavie. Questi animali hanno poi sviluppato i sintomi tipici della malattia del legionario. McDade ha quindi prelevato campioni di sangue dai sopravvissuti alla malattia, supponendo che contenessero anticorpi contro l'agente eziologico. Ha quindi mescolato i campioni con gli isolati del sacco vitellino e hanno reagito, confermando che l'agente nel sacco vitellino era lo stesso agente che causava la malattia nelle 33 persone.

McDade ha spiegato che la sua squadra era stata perplessa per mesi da diverse caratteristiche insolite dei batteri: i batteri non crescevano in condizioni tipiche. Gli scienziati hanno cercato di coltivare il batterio dai campioni di sangue e tessuto dei legionari in una soluzione riempita con fluido standard utilizzato per coltivare altre varietà batteriche. Tuttavia, nulla è cresciuto. Questa mancanza di crescita ha portato il team a pensare che l'agente fosse un virus o un "ceppo di Andromeda" mai visto prima. Solo quando i campioni non trattati con antibiotici sono stati iniettati nelle uova è stata determinata la prova dell'attività biologica.

Un altro ritardo è stato causato dall'uso di topi negli esperimenti. Non è stato fino a quando il team è passato alle cavie che i loro sforzi sono stati produttivi. Sebbene i topi siano spesso usati come modelli animali, si è scoperto che la Legionella si replica principalmente all'interno dei macrofagi. I macrofagi dei topi sono molto inefficienti nell'ingerire questo batterio, quindi non sono mai stati infettati dai campioni dei Legionari. Al contrario, le cavie erano suscettibili a Legionella e si è infettato.

Il passo successivo per McDade è stato determinare perché questo batterio fosse così difficile da coltivare. Presto scoprirono che il Legionella il batterio ha esigenze fisiologiche. I terreni di coltura standard non promuovono la crescita perché richiedono alti livelli dell'aminoacido cisteina, integratori di ferro inorganico, basse concentrazioni di sodio, carbone attivo e temperature elevate. Il dottor Fliermans è stato il primo a riconoscere che i lipidi di Legionella erano molto simili ai batteri termofili che scoprì nelle aree termali del Parco Nazionale di Yellowstone. Inoltre, il batterio tende a vivere in un ambiente ricco di sostanze nutritive e buio come un biofilm (schiuma) associato a specie di alghe selezionate. Queste condizioni hanno contribuito alla difficoltà di visualizzare l'organismo nel suo ambiente utilizzando la microscopia standard e altre tecniche.

McDade ha chiesto a Fliermans di aiutare a completare i postulati di Koch per la malattia del legionario. Dal 1969, Fliermans conduce ricerche sui microrganismi associati agli habitat termali naturali come quelli di Yellowstone e sugli habitat artificiali provenienti da correnti termiche vicino a impianti elettrici e nucleari. I microrganismi associati a questi habitat erano spesso mesofili e termofili nella loro risposta fisiologica in quanto la loro temperatura di crescita ottimale era compresa tra 30° e 90°C (86° e 194°F). La seconda caratteristica insolita per questi termofili era il gran numero di acidi grassi a catena ramificata che contenevano, proprio come gli isolati clinici di Legionella. Forte di queste informazioni, Fliermans iniziò a cercare negli habitat acquatici, sia naturali che artificiali, sia ambientali che termali, la presenza di Legionella. Il lavoro seminale di Fliermans ha dimostrato che Legionella potrebbero essere isolati da habitat naturali non associati a un focolaio della malattia. Questi risultati hanno aperto una nuova area per il pensiero, la sperimentazione e la comprensione. Per Fliermans, la domanda ora diventava: come e dove? Legionella adattarsi al contesto ecologico?

Sebbene molti presso i Centers for Disease Control fossero perplessi sull'origine di Legionella, i dati epidemiologici portano Fliermans a concentrarsi sulle nicchie acquatiche come habitat naturali del batterio. Questa ipotesi è nata dall'esame del fatto che le presentazioni cliniche iniziali hanno dimostrato una stagionalità dell'infezione. Tale schema ciclico era molto simile a quello osservato per la crescita dei batteri acquatici. Le teorie sulla causa delle malattie andavano dall'intossicazione da nichel carbonile e polmonite virale a una cospirazione farmaceutica contro i veterani americani. Al CDC molti hanno ipotizzato che Legionella potrebbe essere stato geneticamente modificato come un "ceppo di Andromeda" dai sovietici o come qualche altro complotto comunista. Dopotutto, aveva colpito principalmente i veterani. Leggendo la sua Bibbia un giorno, il dottor Fliermans osservò Ecclesiaste 1:9: “Ciò che è stato, è ciò che sarà e ciò che è fatto, è ciò che sarà fatto: e non c'è cosa nuova sotto il sole .” Il Dr. Fliermans credeva che fosse vero e presto modificò il modo in cui il suo laboratorio cercava l'organismo, poiché il batterio probabilmente non era nuovo sotto il sole. Dopo aver pregato, pianificato ed esplorato, il Dr. Fliermans ha trovato il batterio nelle acque termali (inizialmente isolate a 45 ° C [113 ° F] al Savannah River Laboratory) scaricate da un reattore nucleare e successivamente da sorgenti termali naturali sia negli Stati Uniti orientali che occidentali. Stati. Una volta isolato dall'ambiente, il compito successivo era quello di coltivarlo. All'inizio, cresceva solo nelle cavie. I postulati di Koch furono inizialmente realizzati nella cavia della figlia del Dr. Fliermans nell'estate del 1977 con campioni prelevati da torri di raffreddamento. È stato in grado di sviluppare e distribuire un test anticorpale fluorescente per rilevare Legionella.

Questa micrografia elettronica raffigura un'ameba, Hartmannella vermiformis (in basso a sinistra) mentre intrappola a Legionella pneumophila batterio (in alto a destra) con uno pseudopodo esteso

Legionella è stato ora facilmente identificato in situ, in vivo e in vitro. Conoscere le basi molecolari ed ecologiche di una patogenesi aiuta a sviluppare nuovi modi per prevenire e curare le malattie. Per prima cosa, si possono prevedere le condizioni in cui è probabile che gli agenti patogeni prosperino, si diffondano e causino malattie. Con tecniche e strumenti molecolari migliorati, gli anticorpi fluorescenti aiutano nella diagnosi. Una storia poliziesca simile vale anche per la scoperta e la diagnosi dell'agente che causa la malattia di Lyme. (Vedere Corpo dal design, 2002, pag. 145, per i dettagli.) Essere uno Sherlock Holmes medico aiuta a sintetizzare la diversità dei fatti in un'unità.


Definizione di cultura sincrona

La coltura sincrona si riferisce al processo di crescita della popolazione microbica, in cui le singole cellule mostrano sincronia con le altre cellule nello stesso terreno di coltura crescendo al stessa fase di crescita per il tempo di generazione dato.

La caratteristica principale della crescita sincrona è che tutte le cellule microbiche sono fisiologicamente identiche crescendo allo stesso ciclo di divisione e allo stesso tempo di generazione. Pertanto, possiamo dire che l'intera popolazione microbica rimane uniforme per quanto riguarda la crescita e la divisione cellulare.

Scopo

  • Usando la cultura sincrona, possiamo avere l'idea del intero raccolto cellulare nella particolare fase del loro ciclo di vita e delle loro interrelazioni.
  • La misurazione della crescita microbica nella coltura sincrona è più accessibile rispetto alle altre tecniche di coltura in accrescimento, in quanto i risultati ottenuti su tale coltura di massa sono analoghi alle misurazioni effettuate su una singola cellula batterica.
  • Nella cultura sincrona, possiamo chiarire il comportamento di crescita delle cellule batteriche nello stesso stadio di crescita.

Punti chiave

  1. L'intera popolazione microbica tende a mostrare sincronia alterando le condizioni fisiche e i costituenti chimici dei terreni di coltura.
  2. È una specie di sistema di coltivazione aperto.
  3. Nella coltura sincrona, le cellule microbiche sono fisiologicamente simile.
  4. Tutte le cellule microbiche in coltura sincrona crescono allo stesso tempo di generazione e allo stesso ciclo divisionale.

L'efficienza della cultura sincrona

Le cellule batteriche mostrano una crescita asincrona nel mezzo di coltura casuale. Tuttavia, le cellule microbiche mostrano sincronia attraverso i metodi di selezione e induzione. Potremmo determinare l'efficienza della crescita sincrona confrontando i seguenti due parametri:

Vediamo il modello di crescita delle cellule tracciando un grafico tra il tempo di raddoppio rispetto a un numero logaritmico di cellule e il tempo rispetto agli indici mitotici corrispondenti per una crescita sincrona e casuale, rispettivamente.


Selezione di microrganismi

Per la selezione dei microrganismi e per mantenerli in sincronia, sono stati impiegati due approcci basati sui metodi di selezione meccanica e ad induzione.

Selezione per metodo meccanico

Si riferisce ad a separazione fisica metodo, in cui la selezione della popolazione sincrona viene effettuata secondo il età e dimensione.

Per eseguire questo metodo, è necessario filtrare le cellule microbiche per separare le cellule piccole e giovani che sono metabolicamente attive. Un filtro trattiene le celle di grandi dimensioni pronte a dividersi.

In questo modo, le celle grandi vengono raccolte dal filtro per ottenere una crescita sincrona con una tecnica standard nota come "Tecnica del Cumming del timoniere”.

In questo metodo, è necessario far passare l'intera popolazione cellulare attraverso un filtro la cui dimensione delle particelle è piccola, sufficiente per intrappolare i batteri. Questo metodo fa uso di filtro a membrana in nitrato di cellulosa.

Quindi, capovolgere la carta da filtro e passarci sopra il mezzo nutritivo fresco. In questo modo, i batteri vagamente associati verranno lavati via attraverso il filtro. I batteri di grosse dimensioni rimarranno sulla carta da filtro e tenderanno a dividersi.

Quindi, raccogliere il campione di questo flusso, che contiene tutti i nuovi formati e cellule che dividono in modo sincrono. Il metodo ha una limitazione che la dimensione della popolazione è piccola.

Oggigiorno, invece della filtrazione, viene utilizzata anche la centrifugazione in gradiente di densità, per selezionare cellule microbiche della stessa dimensione e densità e che possono dividersi nello stesso stadio del loro ciclo di vita.

Selezione per metodo di induzione

L'altro metodo, ad es. trattamento d'urto can also maintain cell synchrony and it includes temperature variation, starvation, light exposure, lethal doses of radiation etc.

All these factors can maintain synchrony in the cell population for several generations. Let us discuss some of the factors that can induce synchrony in the cell culture.

Temperature variation: It is the most common factor that induces the cell maturation to the same point of fission.

We could observe the change in culture medium by growing the microbial culture under 37 degrees Celsius and later subjecting the culture medium to 20 degrees Celsius for about 30 minutes.

During this interval, the cells go through maturazione to undergo cell division. At 20 degrees Celsius temperature, no bacteria will undergo fission.

But, if you transfer the culture at a temperature of 37 degrees Celsius, all the cells start dividing synchronously. Therefore, the repeated temperature variation can maintain synchrony for a few generations.

Alternations in the media composition: Other than shock treatment, the synchrony can also be induced by changing the media composition of the culture medium.

The microorganisms grown in the culture medium deficient or containing the essential growth factor may either promote or inhibit the cell division, which eventually withheld the fission.

Let us suppose, the bacterial cells are grown in a culture medium that lacks thymine (an essential element). As a result, the process of fission halts for some time. However, the bacterial cells will divide once you transfer the cells to a complete nutrient medium.

Allo stesso modo, colchicine is a growth factor inhibiting the cell division in culture medium for a certain period. But the effect can be reversed once you transfer the cells to the culture medium free of colchicine.

Conclusione

Therefore, we can conclude that the synchronous culture are of two kinds, namely induction and selection synchrony. Il induction synchrony induces the bacterial cell population to undergo fission synchronously via physical or chemical treatment.

Oppositely, the selection synchrony selects cells at a particular stage of the cycle, and later the fractions of bacterial cells grow through their natural cycle.


Why are bacterial cultures necessary? - Biologia

In many distinct areas of microbiology, the ability to identify microorganisms has important application. For example, in food microbiology it is important to be able to accurately identify food spoilage contaminants. In microbial ecology, the identification of microorganisms helps us characterize biodiversity. In the field of medical microbiology, a branch of microbiology that investigates pathogenic microorganisms, the primary focus is to isolate, identify, and study microorganisms responsible for infectious disease.

Many microorganisms are permanent residents, or normal flora, of the human body. Bacteria that are normal flora are important symbionts of the human body, most of which cause no ill effects and some, which are actually beneficial to human health. Only a small percentage, less than 10%, of all known bacteria are pathogenic, or able to cause disease in a susceptible host. In order to identify an unknown in the clinical laboratory, a sample must be collected from the patient. This could be a sample of urine, feces, saliva, or a swab of the throat or skin. Because the clinical samples will most likely contain many microorganisms, both normal flora and pathogens, it is important to isolate the pathogen in a cultura pura using various types of selective and differential media. Following isolation, one of the first steps in identifying a bacterial isolate is the colorazione di Gram, which allows for the determination of the Gram reaction, morphology, and arrangement of the organism. Although this information provides a few good clues, it does not allow us to determine the species or even genus of the organism with certainty. Thus, microbiologists use characteristic biochemicalattività to more specifically identify bacterial species. A Few Biochemical/Physiological Properties Used for identification of bacteria include: nutrient utilization (carbohydrate utilization, amino acid degradation, lipid degradation), resistance to inhibitory substances (high salt, antibiotics, etc.), enzyme production (catalase, coagulase, hemolysins, etc.) and motility.

This series of lab exercises will introduce many of the physiological characteristics/biochemical activities of bacteria commonly encountered in a clinical microbiology laboratory. Knowledge of these key characteristics will enable the identification of unknown bacterial isolates. It is important to thoroughly understand the basis for each biochemical test and know the key physiological characteristics of the bacterial genera and species presented in these labs.

Nota: Labs 15-17 will utilize a number of different media and tests that are described in the ATLAS and on the course web page (Summary of Biochemical Tests). Please use these as references for all of these labs and for the investigation of unknowns in Labs 18-21.


Supporting information

S1 Fig. Impaired metabolism leads to an increase in antibiotics survival.

(UN) E. coli MG1655 WT, ΔaceA, and Δicd strains were grown 2 hours to 2.5 hours in LB at 37°C to exponential phase and challenged with ciprofloxacin (1 μg/mL). Survival has been assessed by culture plating and CFU counting. Data are the average results from 3 independent experiments performed with 3 biological replicates (n = 8 or 9). Error bars represent standard deviations. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell measured by microscopy in exponential cultures of MG1655, ΔaceA, and Δicd strains grown in LB at 37°C. Thick lanes represent the median, and secondary lanes the quartiles. Significance was determined using Kruskal–Wallis and Dunn’s multiple comparison tests. Observations were performed with a confocal microscope. (C) Bulk ATP levels were measured in MG1655, ΔaceA, and Δicd strains grown in LB 37°C with firefly luciferase assay and normalized with OD600. Data are the average results from 3 independent experiments performed with 3 biological replicates (n = 9). Error bars represent standard deviations. Significance was determined using one-way ANOVA and Tukey’s multiple comparison tests. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S2 Fig. Growth of the fluorescent reporter strains.

MG1655 Krebs cycle KO strains and W3110D Krebs cycle mVenus fusion strains were grown in LB (A), in MOPS minimum medium with 0.4% sodium pyruvate (B), or 0.4% sodium acetate (C) as sole carbon source at 37°C. (D) MG1655-SB1 strains expressing or not iATPSnFr 1.0 were grown in LB at 37°C. In (A), (B), (C), and (D), each lane represents a biological replicate coming from experiments performed 3 times (n > 6). The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S3 Fig. Fluorescence analysis of the mVenus fusions.

Representative histogram of fluorescence of the mVenus fusions before (A) and after (B) ciprofloxacin treatment of W3110D: black lane, aceA-mVenus: red-lane, icd-mVenus: blue lane, gltA-mVenus: green lane, sucA-mVenus: orange lane. For each of those fusions, (C), (D), (E), (F), respectively, show the histogram of fluorescence before (black lane) and after (red lane) ciprofloxacin treatment for each fusion (left panel), and the post-sorting purity analysis of the Dim (light grey), Middle (grey), and Bright (dark grey) sorted fractions (right panel). The number of events represented in the axis is normalized for each graph. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S4 Fig. Reporting ATP in exponential and stationary phase cultures at the single-cell level.

(A) Representative images of exponential (upper panel) and stationary (lower panel) phase cultures of MG1655_iATPSnFr 1.0 cultured in LB at 37°C. The fluorescent signals 405ex and 488ex are false colored in magenta and green, respectively. In the ratiometric 488ex/405ex panel, orange/yellow cells correspond to cells with higher ATP, and blue cells with lower ATP. Scale bar, 5 μm. White arrow shows the presence of a low 488ex/405ex ratio cell within exponential culture. Observations were performed with a confocal microscope. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio in exponential and stationary phase cultures. Thick lanes represent the median, and secondary lanes the quartiles. Significance was determined using two-tailed unpaired Mann–Whitney tu test. Data are representative of experiments made twice giving similar results. (C) Bulk ATP levels were measured in MG1655 strain grown in the same conditions as in (A) with firefly luciferase assay and normalized with OD600. Data are the average results from 2 independent experiments performed with 3 biological replicates (n = 6). Error bars represent standard deviations. Significance was determined by using two-tailed unpaired Student T test. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S5 Fig. Kymographs of the different phenotypes observed.

The fluorescent panels represent the addition of iATPSnFr 1.0 405ex and 488ex intensities. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope.

S6 Fig. Kymographs of the persisters analyzed.

(A) Left panel: ATP value at the beginning of the experiment in persisters. Data represent the single-cell 488ex/405ex ratio values analyzed for each of the 16 persisters at the first time frame in Fig 3D histogram. The black horizontal dashed line represents the mean 488ex/405ex ratio of the normal cells (0.6303). Right panel: Kymographs of the 16 persisters analyzed in Fig 3C. The iATPSnFr 1.0 ratiometric 488ex/405ex panels represent ATP level. The color code has been scaled individually for each of the 16 kymographs. Persister number 2 harbors a slow growth pattern different than the others which don’t grow in presence of ampicillin. The white rectangles indicate the time frame where the first septal invagination of each persister is observed (time before first division). Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. (B) For each persister, time before first division is plotted over the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio at the first time frame of the time lapse (t = 1). Correlation was examined by Pearson’s correlation. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S7 Fig. iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio in the mother machine.

(A) Each data point represents the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell over time frames (frames interval is 30 minutes) for normal cells (in black) and persister cells (in red). (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell for normal cells (in black) and persister cells (in red) according to their position in the mother machine, at the first time frame of the time lapse (t = 1), and (C) immediately before the antibiotic is added (t = 5). Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S8 Fig. Persisters, cell size, and ATP.

(A) Distribution of cell size area. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio. A mother machine experiment using the same setup as in Fig 3 was performed. The light grey bars represent all non-persister cells (23,766 cells) at the first time frame, immediately after loading in the mother machine from a stationary phase culture. Dark grey corresponds to non-persister cells with sizes smaller than the average persister cells (5,596 cells). The 5 persisters found in this experiment are plotted in red. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S9 Fig. General schematic of the construction of in-frame chromosomal mVenus fusions.

Schematic of the construction of the translational mVenus fusions. Two-round PCRs were performed. The template used was the pKDN31 plasmid (a gift from Barry Wanner), and the polymerase used was the KOD. Final PCRs were precipitated with ethanol, dried up, then dissolved in H2O, before to be used to electrotransform W3110D/pKD46. Electrocompetent cells of W3110D/pKD46 were prepared according to the standard protocol for λ Red recombination with a higher concentration of L-arabinose (10 mM) [59,60]. The double selection was done using resistance to chloramphenicol (25 μg/mL) and sensitivity to ampicillin (100 μg/mL at 30°C), and clones were PCR checked using Left and Down primers (S3 Table). Finally, bar code sequencing was performed after amplification with Left and NYP244 primers (S3 Table).

S10 Fig. Evaluation of photobleaching and photoactivation effects for the iATPSnFr 1.0 sensor.

Stationary phase cells were concentrated and loaded in the device, and fresh EZRDM was flowed until cells are in balanced growth (from time frame 7 to the end of the experiment). Frames were taken 30 minutes apart. Changes in the 405ex and 488ex signals of the iATPSnFr 1.0 sensor (on the right axis) and in the 488ex/405ex ratio (on the left axis) were monitored over time. Data represented are the mean of the iATPSnFr 1.0 488ex, 405ex, and 488ex/405ex ratio per single cell over time frames (n = 2,670). Error bars represent standard errors. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.


Guarda il video: Coltura batterica su piastra Petri tratto da Dal carbonio agli OGM (Febbraio 2023).