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Laboratorio 9: Conteggio su piastra standard - Biologia

Laboratorio 9: Conteggio su piastra standard - Biologia


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Come facciamo a sapere quanti batteri ci sono in un liquido?

I microbiologi usano una tecnica chiamata "conteggio su piastra standard" per stimare la densità di popolazione di batteri in un brodo placcando una porzione piccola e diluita del campione e contando il numero di colonie di batteri. Usiamo diluizioni seriali per creare concentrazioni decrescenti del campione originale che vengono poi piastrate in modo da creare una piastra con un numero sufficientemente basso di batteri da poter contare le singole colonie. Da quel numero, possiamo calcolare la densità cellulare originale nel brodo.

cosa diluiamo?

Un tubo di brodo torbido contiene milioni di batteri. Se ci trasferissimo direttamente da quel tubo, otterremmo un piatto con un prato di batteri. Questa piastra non sarebbe numerabile e non potremmo usarla per stimare il numero di cellule batteriche. Pertanto, dobbiamo diluire il nostro campione originale prima della placcatura.

Perché facciamo una serie di diluizioni?

Poiché non sappiamo quanti batteri ci sono nel nostro campione di brodo, non sappiamo quanto dobbiamo diluirlo per ottenere una piastra "contabile" (tra 30-300 batteri). Pertanto, eseguiamo una serie di diluizioni per creare un numero di piastre, con una gamma di diluizioni, nella speranza di produrre una piastra numerabile. Il numero di colonie che contiamo su una piastra ci dà le CFU o unità formanti colonia, quando dividiamo le CFU, per il volume che abbiamo piastrato otteniamo CFU/volume a CFU/mL. Ad esempio, se contassimo 32 batteri su una piastra che aveva ricevuto 200 μl di una diluizione 10-6, faremmo i seguenti calcoli:

[frac{32;CFUs}{0.2;mL}= 160;frac{CFU}{mL}]

Quindi dividiamo questo per quanto abbiamo diluito il campione originale per ottenere la concentrazione stimata di batteri nella provetta originale:

[frac{160;frac{CFU}{mL}}{10^{-6}}= 160*10^6;frac{CFU}{mL}]

Mettendo questo in una corretta notazione scientifica questo sarebbe:

[1.6*10^8 frac{CFU}{mL}]

NOTA

Calcola il CFU/mL per questo esperimento, mostra il tuo lavoro e chiedi all'istruttore di firmare prima di procedere.

Esercizio

Compila la tabella sottostante prima di procedere (non è necessario consegnarla).

Volume pipettato:

Volume totale (rapporto)

Volume del campione:

Volume totale (rapporto)

Diluizione individuale

Fattore

Diluizione totale

Fattore

Completa il seguente laboratorio individualmente:

1. Procurarsi 7 provette per microcentrifuga ed etichettarle n. 1-7.

2. Aggiungere in modo asettico 990 μL di acqua sterile alle provette n. 1 e n. 2.

3. Aggiungere in modo asettico 900 μL di acqua sterile alle provette n. 3-7.

4. Mescolare il brodo di coltura, quindi aggiungere in modo asettico 10 μL alla provetta n. 1 e agitare.

5. Trasferire in modo asettico 10 μL dalla provetta n. 1 alla provetta n. 2, chiudere il coperchio e agitare.

6. Trasferire in modo asettico 100 μL dalla provetta n. 2 alla provetta n. 3, chiudere il coperchio e agitare.

7. Trasferire in modo asettico 100 μL dalla provetta n. 3 alla provetta n. 4, chiudere il coperchio e agitare.

8. Trasferire in modo asettico 100 μL dalla provetta n. 4 alla provetta n. 5, chiudere il coperchio e agitare.

9. Trasferire asetticamente 100 μL dalla provetta n. 5 alla provetta n. 6, chiudere il coperchio e agitare.

10. Trasferire in modo asettico 100 μL dalla provetta n. 6 alla provetta n. 7, chiudere il coperchio e agitare.

CONGRATULAZIONI ADESSO HAI COMPLETATO LA TUA SERIE DI DILUIZIONI!

11. Procurati 4 piastre TSA ed etichettale.

12. Usando la magia del fuoco per piegare una pipetta Pasteur di vetro in uno spalmatore. Mettilo nel tuo bicchiere di alcol.

13. Fiamma la spatola di vetro, attendi che TUTTO l'alcol evapori e ripeti l'operazione 3 volte.

14. Pipettare in modo asettico 100 μL della provetta n. 4 al centro di una piastra TSA, assicurandosi che la punta non tocchi l'agar.

15. Posizionare lo spargitore sterilizzato al centro del piatto (NON PREMERE VERSO IL BASSO).

16. Girare la piastra almeno 5 volte mentre si sposta il divaricatore in vetro per distribuire i batteri sulla piastra. A questo punto il liquido è stato assorbito dalla piastra.

17. Rimetti il ​​divaricatore di vetro nel bicchiere di alcol.

18. Ripetere questa procedura per le provette n. 5-7, incubare a 37°C.


Guarda il video: video lezione ITP Agraria: Laboratorio Microbiologia 23 (Dicembre 2022).