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1.14: Separazione delle fosfatidilcoline mediante HPLC in fase inversa - Biologia

1.14: Separazione delle fosfatidilcoline mediante HPLC in fase inversa - Biologia


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14.1 Obiettivo di apprendimento

Questo laboratorio ha 2 obiettivi, (1) apprendere di più sulle strutture lipidiche di membrana lavorando con le fosfatidilcoline e (2) apprendere le basi di una tecnica di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) particolarmente importante, HPLC in fase inversa. Dovresti usare la tua conoscenza delle strutture della fosfatidilcolina per razionalizzare il modello di eluizione dall'HPLC.

14.2 Fosfatidilcoline

La fosfatidilcolina è un'importante classe di lipidi (biochimici idrofobici). Questa classe è uno dei costituenti primari della membrana biologica. Le fosfatidilcoline hanno una struttura comune. Per creare una fosfatidilcolina, inizia con il glicerolo. Altri componenti sono collegati al glicerolo mediante legami esteri. Due acidi grassi (acidi carbossilici a catena lunga) sono esterificati nelle prime due posizioni del glicerolo. La terza posizione contiene un fosfato e una colina. Ogni fosfatidilcolina differisce dalle altre della sua classe in base alle caratteristiche molecolari delle catene degli acidi grassi (Figura 14.1).

14.3 Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

La separazione delle fosfatidilcoline è difficile, ma può essere eseguita utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Questa tecnica di separazione consiste nel far passare una soluzione (la fase mobile) attraverso una colonna piena di particelle molto piccole (la fase stazionaria). Alcuni soluti sono fortemente attratti da queste particelle e viaggiano lentamente attraverso la colonna. Questi soluti si attaccano a una particella per un certo periodo di tempo e poi "saltano" alla particella successiva. Rispetto al moto della fase mobile, questi soluti sono ritardati. Altri soluti sono attratti solo debolmente dalle particelle e quindi possono viaggiare rapidamente attraverso la colonna.

Il movimento differenziale dei soluti porta alla separazione del soluto. Questo è spesso mostrato come un cromatogramma (Figura 14.2).

userai HPLC a fase inversa. Le particelle in questa tecnica sono fatte di silice (sabbia) che è stata rivestita con catene di alcani. I soluti che sono più idrofobici sono più fortemente attratti dalla fase stazionaria e si muovono più lentamente attraverso la colonna. Separerai cinque composti della fosfatidilcolina con strutture molto simili (Fig. 14.3).

Le fosfatidilcoline con le catene di acidi grassi più lunghe sono più fortemente attratte dalla fase stazionaria. La lunghezza delle catene di acidi grassi dipende da:

– il numero di atomi di carbonio,

– la presenza di doppi legami cis. Ogni doppio legame cis fa agire la catena come se fosse più corta di uno o due atomi di carbonio (meno idrofoba).

Quale delle cinque fosfatidilcoline prevedi che sia maggiormente attratta dalla fase stazionaria? Quale prevedi sarà attratto di meno? In base alla struttura del PC, prevedere l'ordine di eluizione dalla colonna.

14.4 Cromatografia di quantificazione

Il successo di una separazione può essere misurato in diversi modi. Primo, una separazione più rapida tende ad essere migliore, perché lo sperimentatore non deve aspettare troppo a lungo i suoi risultati. Per ogni soluto viene misurato un tempo di ritenzione. Questo è il tempo trascorso dall'inizio a quando il picco di soluto lascia la colonna. Tipicamente, questo tempo viene riportato in relazione al tempo di eluizione più rapido (il tempo impiegato dal solvente per passare attraverso la colonna, il tempo di vuoto). Quindi, la rapidità di separazione è misurata dalla ritenzione relativa o dal fattore di capacità (k´).

Utilizzando il cromatogramma in Fig. 14.2, il Picco A ha un tempo di ritenzione di 9,3 min. Il tempo di vuoto per questo cromatogramma è di 2,0 min.

Il picco A è trattenuto sulla colonna 3,6 volte più a lungo della fase mobile.

Un'altra misura del successo è monitorare la forma di ogni picco. Picchi acuti significano una migliore separazione. Questo viene misurato determinando la larghezza del picco rispetto a quanto a lungo il picco viene trattenuto sulla colonna.

Il Picco A della Fig. 14.2 ha un tempo di ritenzione di 9,3 min con un'ampiezza del picco di 0,8 min.

[mathrm{N}=16left(frac{9.3 mathrm{~min}}{0.8 mathrm{~min}} ight)^{2}=2162]

Una separazione ben fatta darà efficienze a migliaia.

Una terza misura del successo è quantificare quanta separazione si verifica tra picchi vicini. Questa selettività è calcolata come il rapporto dei fattori di capacità

Il picco A ha k´= 3.6 mentre il picco B ha k´= 4.3. Ciò significa che questa separazione tra il picco A e il picco B ha una selettività di 1.2. Il picco B viene mantenuto il 20% più lungo del picco A. Una buona separazione darà valori di selettività maggiori di 1,1.

PROCEDURE

I reagenti e le attrezzature necessarie sono calcolate per sei squadre di studenti. È inclusa una franchigia del 20% circa.

Attrezzatura/vetreria necessaria:

  1. Sistema HPLC standard 1 per 2 squadre di studenti
  2. Colonna HPLC a fase inversa C-18

Reagenti necessari:

  1. 98% metanolo
  2. 100 µl di miscela di fosfatidilcoline sciolte in metanolo. Di seguito sono elencate le concentrazioni di riserva per ciascuna fosfatidilcolina nella miscela
    1. DMPC 10 mg/ml
    2. DPoPC 5 mg/ml
    3. DLPC 1 mg/ml
    4. POPC 5 mg/ml
    5. DOPC 5 mg/ml

Procedura sperimentale:

  1. Una colonna HPLC analitica standard in fase inversa (C-18) è equilibrata con 98% di metanolo - 2% di acqua. È conveniente una portata di 1 ml/min.
  2. Ogni separazione utilizza 10 μl di un campione di fosfatidilcolina mista.
  3. Il campione contiene 10 mg/ml DMPC, 5 mg/ml DPoPC, 1 mg/ml DLPC, 5 mg/ml POPC, 5 mg/ml DOPC in metanolo.
  4. Ogni separazione richiede circa quaranta minuti.
  5. Segui le istruzioni del tuo istruttore riguardo al funzionamento del cromatografo HPLC.

Analisi dei dati:

  1. Calcolare il fattore di capacità (ritenzione relativa) per ogni fosfatidilcolina.
  2. Determinare l'efficienza della colonna (N) calcolata utilizzando il picco DLPC.
  3. Calcolare la selettività (α) tra (a) DMPC rispetto a DPoPC, (b) DPoPC rispetto a DLPC, (c) DLPC rispetto a POPC e (d) POPC rispetto a DOPC.

Note per l'istruttore

Questo laboratorio è programmato per massimizzare l'uso di un numero limitato di cromatografi. Presso l'istituto degli autori, utilizziamo contemporaneamente tre macchine HPLC. Ad ogni cromatografo sono assegnate due squadre di studenti (ogni squadra composta da una coppia di studenti). Mentre un team esegue la cromatografia, l'altro team sta completando una serie di problemi HPLC in laboratorio. Pertanto, entro la fine del periodo, tutte le squadre hanno completato una prova cromatografica e hanno praticato i calcoli comuni necessari per analizzare un cromatogramma.

HPLC dei lipidi Prelab

1. Disegna la struttura di ciascuna fosfatidilcolina che separerai durante il laboratorio (ce ne sono cinque)!

2. Cerchia la parte idrofoba di ogni molecola!

3. Classifica queste molecole in base all'idrofobicità dal minimo (5) al più idrofobo (1)!

4. Quale dei cinque PG prevedi di essere più attratto dalla fase stazionaria? Quale prevedi sarà attratto di meno?

5. In base alla struttura del PC, prevedere l'ordine di eluizione dalla colonna.

HPLC di fosfatidilcolineStruttura del rapporto di laboratorio e distribuzione dei punti

introduzione

1. Diverse frasi che definiscono l'obiettivo/scopo di questo esperimento. (3 punti)

Dati

  1. Una copia del cromatogramma con ogni picco etichettato con una fosfatidilcolina specifica. (10 punti)

Risultati (mostra tutti i calcoli)

  1. Il fattore di capacità (ritenzione relativa) per ogni fosfatidilcolina. (10 punti)
  2. L'efficienza della colonna (N) calcolata utilizzando il picco DLPC. (4 punti)
  3. La selettività (α) tra (a) DMPC vs POPC e (d) POPC vs DOPC. (8 punti)

Analisi

  1. Quali fosfatidilcoline sono nettamente separabili su questa colonna. Spiega brevemente. (5 punti)
  2. Problemi (10 punti)

HPLC Problema Set

(Per gentile concessione di Dikma Technologies. Chromatorex è un marchio registrato di Fuji Silysia Chemical Ltd. Dikma Technologies Inc. non è affiliato con la suddetta società.

1. (5 pt.) Il cromatogramma di Chromatorex-SMB non sembra buono come quello di Inspire. Calcolare l'efficienza della colonna (N) in base al picco 3. (Utilizzare un righello e la conversione, 1 minuto/6 mm.) È d'accordo con la conclusione della prima frase? Spiega brevemente.

(Per gentile concessione di SIELC Technologies)

2. (5 pt.) Basta guardare i cromatogrammi, classificarli dalla migliore separazione alla peggiore separazione. Utilizzando i due cromatogrammi misurabili, determinare i tempi di ritenzione per ciascun picco. (Stima i tempi con l'approssimazione di 0,1 minuti.) Calcola i fattori di capacità per ciascun picco utilizzando 1,1 min come tempo di vuoto. Quindi, calcola i fattori di selettività (α) per Picco 1 rispetto a Picco 2 e per Picco 2 rispetto a Picco 3. I fattori di selettività concordano con la tua classifica? Spiega brevemente.


1.14: Separazione delle fosfatidilcoline mediante HPLC in fase inversa - Biologia

Sono stati stabiliti metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni per la separazione di alchenilacile, alchilacile e diacil acetilgliceroli derivati ​​da etanolammina glicerofosfolipidi (EGP) e per la separazione delle singole specie molecolari da ciascuna delle classi separate. Gli EGP sono stati isolati da cervello bovino, idrolizzati con fosfolipasi C e acetilati con anidride acetica. Le tre classi di diradylacetilgliceroli sono state separate quantitativamente su una colonna di silice mu Porasil. Le singole classi sono state ulteriormente frazionate su una colonna a fase inversa Zorbax ODS. Mediante quantificazione gas-liquido cromatografica di ciascun picco, sono state identificate 29-33 specie molecolari diverse all'interno di ciascuna classe. Per l'alchenilacil-GPE, le specie principali erano 18:1-18:1, 21,8% e 16:0-18:1, 14,8%. Gli acidi grassi polienoici predominavano nella posizione 2 del diacil-GPE. Le specie principali erano 18:0-22:6 (n-3), 25,5% e 18:0-20:4 (n-6), 15,8%. Tre specie di alchilacil-GPE, 18:0-20:6 (n-3), 16:0-22:4 (n-6) e 18:0-22:4 (n-6), ciascuna rappresentava 10%.


Riepilogo

L'applicazione della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando un C30 la matrice stazionaria a fase inversa ha consentito la separazione simultanea di caroteni, xantofille, ubichinoni, tocoferoli e plastochinoni in un singolo cromatogramma. Il rilevamento continuo dell'array di fotodiodi (PDA) ha garantito l'identificazione e la quantificazione dei composti al momento dell'eluizione. Applicazioni del metodo alla caratterizzazione di varietà di pomodoro transgeniche e mutanti con contenuto di isoprenoidi alterato, screening biochimico di Arabidopsis thaliana, e vengono descritte le modalità di azione degli erbicidi sbiancanti per illustrare la versatilità della procedura.


Determinazione RP-hPLC/ESI MS delle posizioni della catena acilica nei fosfolipidi

Dipartimento di spettrometria di massa biomolecolare, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences (UIPS) e Bijvoet Center for Biomolecular Research, Università di Utrecht, PO Box 80 082, 3508 TB Utrecht, Paesi Bassi

OctoPlus B.V., Zernikedreef 12, 2333 CL Leiden, Paesi Bassi

Laboratorio di biochimica veterinaria e Istituto di biomembrane, Università di Utrecht, PO Box 80 176, 3508 TD Utrecht, Paesi Bassi

Dipartimento di spettrometria di massa biomolecolare, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences (UIPS) e Bijvoet Center for Biomolecular Research, Università di Utrecht, PO Box 80 082, 3508 TB Utrecht, Paesi Bassi

OctoPlus B.V., Zernikedreef 12, 2333 CL Leiden, Paesi Bassi

Astratto

Poiché i fosfolipidi sono utilizzati come eccipienti in molti prodotti farmaceutici, sono necessarie strategie convalidate per caratterizzare i costituenti fosfolipidici. Descriviamo un metodo di spettrometria di massa a ionizzazione HPLC/elettrospray a fase inversa che è un'alternativa al laborioso trattamento con fosfolipasi A2 comunemente usato per determinare le posizioni della catena acilica nei fosfolipidi. Questo sistema di spettrometria di massa HPLC/elettrospray a fase inversa (a) mostra una buona risoluzione cromatografica per le specie molecolari di fosfatidilcolina, (b) consente la determinazione della composizione di miscele complesse di fosfatidilcoline e, cosa più importante, (c) consente l'assegnazione univoca delle posizioni di le catene aciliche sullo scheletro del glicerolo in miscele di POPC e OPPC e in miscele di POPE e OPPE.


HPLC a fase inversa combinata, spettrometria di massa e spettroscopia NMR per una separazione rapida e un'identificazione efficiente delle fosfatidilcoline

Per quanto riguarda il molteplice coinvolgimento dei lipidi nei processi biochimici, l'analisi dei lipidi intatti e non derivati ​​dei fluidi corporei e degli estratti cellulari e tissutali è ancora un compito impegnativo, se sono necessarie informazioni molecolari dettagliate. Pertanto, il vantaggio dell'uso combinato di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), spettrometria di massa (MS) e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) verrà mostrato analizzando tre diversi tipi di estratti della fosfatidilcolina, componente onnipresente della membrana. Inizialmente, sono state testate diverse modificazioni della fase inversa su fosfatidilcoline (PC) con lo stesso numero di carbonio effettivo (ECN) per la loro applicabilità nell'analisi dei lipidi. I risultati sono stati presi per migliorare la separazione di tre tipi di estratti di PC naturali ed è stato sviluppato un nuovo metodo HPLC a fase inversa (RP). Le singole specie sono state caratterizzate da NMR mono e bidimensionale e modalità ionica positiva o negativa quadrupolo time of flight (q-TOF)-MS e tecniche MS/MS. Inoltre, vengono affrontati gli effetti di soppressione ionica durante la ionizzazione elettrospray (ESI), le difficoltà, i limiti e i vantaggi delle singole tecniche analitiche.

1. Introduzione

L'analisi dei lipidi nativi e non derivati ​​all'interno dei fluidi corporei e degli estratti cellulari e tissutali è ancora un compito impegnativo, in particolare, se la struttura molecolare dei singoli componenti deve essere identificata in tempi abbastanza brevi. La composizione lipidica è costituita da diverse classi principali come acidi grassi, lipidi neutri e lipidi con gruppi di testa caricati positivamente o negativamente con molteplici sottoclassi di diversità strutturale. Le variazioni all'interno della composizione lipidica sono state attribuite a diverse patologie come malattie neoplastiche e neurodegenerative, diabete mellito e molte altre. Inoltre, alcune classi lipidiche sono coinvolte nella morte cellulare (apoptosi, necrosi), nella segnalazione cellulare e sono precursori di lisofosfolipidi (cioè lisofosfatidilcolina), diacilgliceroli e acido fosfatico e arachidonico [1-25].

La 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (PC) rappresenta un importante costituente delle membrane cellulari. È costituito dal gruppo di testa polare fosforilcolina attaccato alla posizione sn-3 del glicerolo e diversi acidi grassi saturi e insaturi esterificati alla posizione sn-1 e sn-2, per cui gli acidi grassi in posizione sn-1 sono di regola saturi di preferenza . Numerosi studi si sono occupati in passato dei PC per la loro estrema importanza biochimica e clinica e sono state proposte molte diverse tecniche analitiche per approfondire il turnover metabolico o per caratterizzare deviazioni fisiopatologiche della composizione lipidica nativa. La maggior parte di queste tecniche soffre di vari inconvenienti in quanto richiede tempo, è insensibile, distruttiva o non è correlata alle singole sottostrutture. La gascromatografia (GC) [26-28], la cromatografia su strato sottile (TLC) [29-31] e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) [32-37] sono comunemente utilizzate per l'analisi dei lipidi. Le tecniche basate su GC sono quantitative ma richiedono tecniche di preparazione del campione che richiedono tempo. GC viene spesso utilizzato in combinazione con TLC per la separazione della classe dei lipidi. Le macchie su una piastra TLC vengono graffiate e i loro residui di acidi grassi vengono analizzati dopo la derivatizzazione in un substrato volatile e registrati mediante GC. Tuttavia, la precisa struttura molecolare di un singolo lipide viene persa a causa della precedente idrolisi dei lipidi. La scissione enzimatica del legame estere mediante fosfolipasi consente una successiva idrolisi dell'acido grasso sn-2 e sn-1, ma richiede molto tempo a causa dell'intenso lavoro di laboratorio e già una piccola contaminazione dell'enzima porta a risultati falsi. HPLC offre la separazione delle classi lipidiche utilizzando la modalità di fase normale (NP) e inoltre la separazione in base ai diversi residui di acidi grassi di un singolo lipide nella modalità di fase inversa (RP). In questo caso, una separazione riuscita dipende nettamente dalla scelta appropriata della fase stazionaria. In alternativa, le tecniche basate su MS sono ampiamente utilizzate, in quanto sono veloci, sensibili e richiedono solo una minore preparazione del campione [38]. L'uso di sistemi MS ad alta risoluzione dà accesso alla formula molecolare. Inoltre, le caratteristiche frammentazioni identificano la classe lipidica e la struttura molecolare. Quando accoppiati con un sistema HPLC, la loro selettività è molto più elevata e beneficia di entrambe le tecniche. La spettroscopia NMR è in grado di misurare biomateriali intatti in modo non distruttivo senza alcuna precedente derivatizzazione. Soprattutto il 31 P-NMR è adatto per quantificare l'analisi della classe dei fosfolipidi e richiede solo una minore preparazione del campione [39-44]. Anche in questo caso si ottengono solo informazioni minori rispetto ai residui di acidi grassi. 1 Anche le misurazioni H-NMR sono ampiamente utilizzate, in quanto contengono più informazioni sugli acidi grassi in generale, ma manca la connessione alla spina dorsale del glicerolo a causa della massiccia sovrapposizione del segnale. La 2D-NMR che coinvolge il nucleo 13 C fornisce molta più risoluzione e più informazioni sulle singole specie, ma la bassa sensibilità NMR dell'isotopo 13 C impedisce un'applicazione rapida e ampia di questa tecnica in un'analisi di routine [44-48].

Questo documento presenta un'efficiente configurazione RP-HPLC per separare le fosfatidilcoline, che alla fine sarà estensibile per separare altri fosfolipidi polari. Successivamente lo strumento HPLC è combinato con i potenziali di assegnazione molecolare altamente informativi di MS e NMR [49]. Sono stati testati cinque diversi tipi di modificazioni in fase inversa a base di silice rispetto alla loro capacità di separare i lipidi contenenti acidi grassi con un numero di carbonio equivalente (ECN), che è il numero di atomi di carbonio all'interno di una catena di acidi grassi meno il doppio del numero di doppi obbligazioni. L'estensione di un lipide da un doppio legame C=C non cambierà l'idrofobicità. Le prestazioni di tutte le colonne sono state testate su una miscela di cinque PC con lo stesso ECN, mentre due di esse sono addirittura isomeri costituzionali relativi alle posizioni 1,2 del glicerolo, il che ostacola ulteriormente la separazione.

Quindi, la colonna HPLC con le migliori prestazioni è stata utilizzata per ottenere un'efficiente separazione di base di tre estratti di PC nativi (fagiolo di soia, cervello bovino e tuorlo d'uovo). Inoltre, viene studiato il comportamento di frammentazione della MS nella modalità a ioni positivi e negativi per i singoli PC per identificare modelli di frammentazione caratteristici per questa classe di lipidi e i suoi residui di acidi grassi. Sono stati acquisiti anche spettri NMR ad alta risoluzione 1D e 2D per confermare la struttura molecolare.

2. Materiale e metodi

2.1. Sostanze chimiche

Metanolo-d4 e cloroformio deuterato, metanolo (grado LC-MS), tutti gli acidi grassi, la miscela in esame è composta da dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC), oleoil-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dioleoil- la fosfatidilcolina (DOPC), la stearoil-linoleoil-fosfatidilcolina (SLPC) e anche gli estratti di soia, cervello bovino e tuorlo d'uovo sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germania). L'acqua bidistillata è stata prelevata dal sistema interno.

2.2. Cromatografia liquida ad alta prestazione

È stato utilizzato un sistema HPLC serie HP 1100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania). Il volume di iniezione era 3

L dello standard preparato in metanolo. Sono state testate cinque colonne con diverse fasi stazionarie rispetto alle loro prestazioni di separazione per l'analisi dei lipidi: (1) C con endcapped a base di silice di tipo A18 (Nucleosil 100-5 C18, 250

3 mm), (2) fenile a base di silice di tipo A (Nucleosil 100-5 C6h5, 250 4 mm), (3) tipo B a base di silice ad alta densità C18 (Nucleodur C18 Gravity, 5 m, 250 3 mm), (4) polimero a base di silice di tipo B/reticolato C18 (Nucleodur C18 Isis, 5 m, 250 3 mm), (5) fenile/C modalità mista a base di silice di tipo B18 (Nucleodur Sphinx RP, 5 m, 250 3 mm).

Tutte le colonne e i materiali HPLC sono stati un gentile dono di Macherey-Nagel (Düren, Germania).

Le colonne da 3 mm sono state fatte funzionare a una velocità di flusso di 0,6 mL/min e la colonna da 4 mm a 1 mL/min. La fase mobile è stata ottimizzata adattando il contenuto di metanolo in diverse prove tra il 90% e il 100% per le fasi alchiliche e tra l'80% e il 100% per la fase fenile rispetto all'interazione idrofobica degli analiti con l'impaccamento RP.

Un Nucleodur Sphinx RP da 8 mm è stato utilizzato in condizioni isocratiche a un flusso di 4,1 mL/min con una fase mobile costituita da metanolo e acqua (90: 10) per l'approccio semi-preparativo. Per raccogliere le singole specie per le misurazioni NMR è stato utilizzato un manipolatore di liquidi Gilson 215 (Gilson International B.V., Bad Camberg, Germania). La temperatura della colonna è stata mantenuta a 4

2.3. Spettrometria di massa

Un sistema esquire LC iontrap (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) è stato utilizzato per il rilevamento spettrometrico di massa per la massa in modalità ionica positiva e negativa e sono stati registrati gli spettri MS/MS di ciascun composto PC. La tensione capillare è stata impostata su

3800 V e la piastra terminale è sfalsata a 500 V in modalità ioni positivi. Per l'HPLC il gas del nebulizzatore è stato impostato a 40 psi, il gas secco e il calore secco sono stati impostati rispettivamente a 10 L/min e 30°C. In caso di infusione diretta tramite una pompa a siringa, i gas secchi e nebulizzatori sono stati ridotti rispettivamente a 5 L/min e 5 psi. L'energia di collisione per gli esperimenti MS/MS è stata ottimizzata rispetto alla stabilità dello ione precursore.

Un microOTOF-Q equipaggiato con la sorgente ionica Apollo ESI (Bruker Daltonik GmbH, Brema, Germania) è stato utilizzato per il rilevamento di massa di precisione. La tensione capillare è stata impostata su 4500 V e l'offset della piastra terminale a 500 V in modalità ioni negativi. Il gas del nebulizzatore è stato impostato a 0,4 bar, il gas secco e il calore secco sono stati impostati rispettivamente a 4 L/min e 20 °C. Per gli esperimenti MS/MS l'energia di collisione del quadrupolo era 42 eV/z. La formula molecolare è stata generata abbinando un'elevata precisione di massa e un modello isotopico (SigmaFit, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germania).

2.4. Risonanza magnetica nucleare

Tutti i campioni sono stati conservati a 8 C prima delle misurazioni. In caso di campioni disciolti, i solventi sono stati evaporati da una leggera corrente di azoto e ridisciolti in CDCl3/ CD3OD (2 : 1). Gli spettri NMR 1D ( 1 H, 13 C) e 2D ad alta risoluzione (HSQC, HSQC-TOCSY, HMBC) con una risoluzione digitale di 1k punti dati in F1 e 4k punti dati nella dimensione F2 di ciascuna specie di PC sono stati acquisiti su un Bruker Spettrometro DRX 600 MHz NMR dotato di sonda TXI da 5 mm (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten/Karlsruhe, Germania).

3. Risultati

3.1. Cromatografia liquida ad alta prestazione

Un confronto di cinque diverse colonne in fase inversa ha rivelato il seguente comportamento: La separazione della miscela di prova su materiali a base di silice di tipo A ha mostrato solo risultati scarsi per tutti i composti di PC. Sebbene sembri che il materiale Nucleosil separi molto bene tutti i picchi (vedi Tabella 1), l'estremo allargamento del picco e un distinto tailing rovinano la presunta separazione dei picchi. Al contrario, i materiali a base di silice di tipo B separavano molto bene DPPC, DOPC, SLPC e POPC o OPPC. Tuttavia, i due isomeri lipidici POPC e OPPC erano ben separati solo (Tabella 1) sull'imballaggio RP con reticolazione polimerica (ISIS). Con tutti i materiali RP è stato possibile separare i lipidi contenenti due acidi grassi monoinsaturi dai lipidi con uno o due acidi grassi saturi o un polinsaturo. I tempi di separazione più brevi con picchi cromatografici acuti sono stati ottenuti dalla fase stazionaria in modalità mista (Sfinge). Pertanto, questa fase stazionaria è stata selezionata per separare i singoli composti all'interno degli estratti lipidici di fonti naturali.


Astratto

Le sfingomieline sono state caratterizzate utilizzando una combinazione di un nuovo metodo HPLC isocratico a fase inversa con rilevamento spettrometrico di massa a tempo di volo con elettrospray e MS/MS online opzionale. La costituzione delle sfingomieline è determinata da esperimenti MS/MS. La separazione di base di 17 composti di un estratto di cervello bovino (2 composti principali e 15 composti minori o in tracce) è stata ottenuta con una fase mobile costituita da metanolo, 2-propanolo, THF e acqua su una colonna RP-18-fenile. In parallelo, la frazione HPLC è stata campionata su uno spettrometro NMR a 600 MHz per acquisire spettri NMR 1D e 2D e per chiarire la struttura molecolare dei singoli componenti della sfingomielina.

A chi deve essere indirizzata la corrispondenza. Telefono: 0049-421-218-2818. Fax: 0049-421-218-4264. E-mail: [email protetta]


4 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI FLOOTANNINE E TECNICHE SELFENATE PER L'ANALISI QUANTITATIVA

L'uso della cromatografia liquida (LC) per quantificare le composizioni di florotannini negli estratti di macroalghe è limitato dalla mancanza di standard disponibili in commercio. L'unico standard per la calibrazione disponibile in commercio è il monomero floroglucinolo.

Koivikko et al. misurata la concentrazione di florotannini attraverso l'integrazione di picchi in un estratto grezzo di Fucus vesiculosus. 38 Il saggio F-C è stato utilizzato per calcolare il TPC di questi composti e quindi è stato calcolato un coefficiente di correlazione di Pearson tra le singole tracce del cromatogramma e il contenuto di florotannini totali. È stata eseguita un'ulteriore analisi statistica per valutare quanto bene la variazione nel profilo cromatografico del florotannino possa spiegare la variazione del contenuto dei florotannini totali conducendo un'analisi di regressione multipla. Questo tentativo di quantificazione non è tuttavia completo in quanto l'area del picco nel profilo cromatografico è influenzata dalla sensibilità del composto alla rivelazione e dalla stabilità dei composti in condizioni analitiche. 38 Pertanto, è necessario eseguire ulteriori ricerche con standard caratterizzati al fine di sviluppare completamente metodi qualitativi di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).


1.14: Separazione delle fosfatidilcoline mediante HPLC in fase inversa - Biologia

a Istituto di chimica, Università di Graz, Universitaetsplatz 1, 8010 Graz, Austria
E-mail: [email protected]
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Astratto

Amanita muscaria, noto anche come fungo dell'agarico di mosca, può accumulare vanadio (V), fino a diverse centinaia di mg V kg −1 massa secca. È noto da tempo che V è presente in A. muscaria come un complesso chiamato amavadina, ma mancano metodi per lo studio della distribuzione e della biosintesi dell'amavadina nei funghi. Qui, descriviamo lo sviluppo del primo metodo sensibile per la determinazione dell'amavadina e di altri composti contenenti V in campioni ambientali utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICPMS). Una forte colonna a scambio anionico funge da fase stazionaria e la fase mobile è costituita da un tampone acquoso di citrato di ammonio ed etilendiamminotetraacetato (EDTA). Sono stati valutati la concentrazione e il pH della fase mobile e la temperatura della colonna per ottimizzare la separazione. Con il metodo finale, l'amavadina viene eluita in meno di 17 minuti e il suo limite di rilevazione è 0,05 μg V L −1 . Inoltre, i due isomeri del composto sono separati l'uno dall'altro e possono essere quantificati indipendentemente. Il metodo è stato applicato ad estratti di campioni di corpo fruttifero di A. muscaria. L'efficienza di estrazione era del 74 ± 12% e l'amavadina rappresentava il 75-96% del V estratto. Inoltre, è stato possibile rilevare concentrazioni significative di altre specie di V, che non sono mai state descritte prima. I nostri risultati dimostrano che la speciazione della V nei funghi è più complessa di quanto ipotizzato fino ad ora e che sono necessarie indagini più approfondite su questo argomento. Il metodo sviluppato consente l'indagine di specie V organiche e inorganiche nell'ambiente, anche a basse concentrazioni.


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2. MATERIALI E METODI

2.1 Materiali

Gli standard acido 3-idrossibutirrico (3-OH-FA (4:0)) sale sodico, acido (±)-3-idrossiesanoico (3-OH-FA (6:0)), acido (±)-3-idrossiottanoico (3-OH-FA (8:0)), acido (±)-3-idrossidecanoico (3-OH-FA (10:0)), acido (±)-3-idrossidodecanoico (3-OH-FA (12 :0)), (±)−3-idrossi acido miristico (3-OH-FA (14:0)) e rhamnolipid (R-95), di-rhamnolipid dominante (Rha), sono stati ottenuti da Sigma Aldrich (Steinheim , Germania). I solventi e gli additivi utilizzati per il rilevamento della MS erano di grado LC-MS. Metanolo (MeOH), acetonitrile (ACN) e acido acetico (AcOH) sono stati ottenuti da Carl Roth (Karlsruhe, Germania).

2.2 Preparazione del campione degli standard

A causa della diversa solubilità in acqua, come conseguenza della diversa lunghezza della catena, sono stati disciolti 3-OH-FA (4:0), 3-OH-FA (6:0) e 3-OH-FA (8:0) in H2O, mentre 3-OH-FA (10:0), 3-OH-FA (12:0) e 3-OH-FA (14:0) sono stati sciolti in MeOH/H2O (6:4, v/v), entrambi a una concentrazione di 2 μg/mL.

2.3 Idrolisi dei ramnolipidi

Per l'idrolisi acida, 5 mg di ramnolipide (R-95) sono stati sospesi in 0,5 mL 2,7 M H2COSÌ4 in una fiala di vetro con tappo a vite. Un volume di 0,5 mL di CHCl3 è stato aggiunto e il sistema bifasico ottenuto è stato riscaldato a 110°C per 140 min. Lo strato di cloroformio contenente l'acido grasso è stato raccolto, evaporato a secchezza e successivamente solubilizzato in 1 mL di MeOH.

Per l'idrolisi alcalina, è stata preparata una soluzione madre di 5 mg di ramnolipide (R-95) in 0,5 mL di MeOH (10 mg/mL). Una soluzione madre (50 μL) e una soluzione metanolica di NaOH 2N (50 μL) sono state aggiunte ciascuna a 900 μL di una soluzione di THF/MeOH (9:1, v/v) e agitate per 2 ore a temperatura ambiente (≈25 °C). I solventi sono stati quindi rimossi sotto vuoto, il residuo diluito con 200 μL di acqua e acidificato con HCl 0,1 M a pH 2-3. La soluzione è stata quindi estratta tre volte con 200 μL di acetato di etile, gli strati organici combinati sono stati evaporati a secchezza e ricostituiti con 100 μL di MeOH/H2O (3:7, v/v). La soluzione è stata diluita dieci volte (H2O) per l'analisi LC-MS.

2.4 Idrolisi lipopeptidica

Il lipopeptide è stato dapprima sciolto in MeOH per ottenere la soluzione madre (10 mg/mL). Un'aliquota di 50 μL (corrispondente a 500 μg) è stata aggiunta fino a 1 ml con una soluzione di acido cloridrico deuterato 6 M (DCl/D2O, 1:1, v/v) in una fiala di vetro con tappo a vite e riscaldata per 24 h a 110°C. L'acido cloridrico è stato evaporato in un evaporatore ad alte prestazioni EZ-2 della GeneVac (Ipswich, UK). Il residuo è stato estratto con 200 µl di una miscela di acqua e cloroformio in rapporto 1:1 (v/v). Lo strato di cloroformio contenente l'acido 3-idrossialcanoico è stato evaporato a secchezza utilizzando il Genevac e il residuo ricostituito con 100 μL di MeOH. La soluzione è stata sciolta dieci volte con H2O per RP e MeOH per misurazioni HILIC. Anche lo strato acquoso è stato evaporato a secchezza e utilizzato per l'analisi degli amminoacidi (riportata altrove).

2.5 Strumentazione

La separazione cromatografica chirale è stata eseguita su un sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity (Waldbronn, Germania) dotato di una pompa binaria (G4220A), un termostato a colonna (G1316A) e un autocampionatore PAL (CTC Analytics AG, Svizzera). Le separazioni sono state eseguite su una colonna CHIRALPAK IA-U (100 × 3,0 mm, 1,6 μm). Le fasi mobili comprendevano acqua (MP-A) e acetonitrile (MP-B), entrambe contenenti 0,1% (v/v) di acido acetico. Se non diversamente indicato, è stato applicato il seguente gradiente: 0–2 min 10% MP-B, 2–20 min 10-100% MP-B, 20–22 min 100% MP-B, 22-22,1 min 100–10% MP-B e 22,1-25 min 10% MP-B. La portata era di 300 μL/min, la temperatura della colonna di 40°C e il volume di iniezione di 10 μL.

Il rilevamento MS è stato eseguito su uno spettrometro di massa AB SCIEX API 4000 MS/MS dotato di TurboIonSpray (SCIEX, Ontario, Canada) in modalità di monitoraggio della reazione selezionata (SRM).I parametri delle transizioni di monitoraggio della reazione selezionate, inclusi il tempo di permanenza, l'energia di collisione e il potenziale di delustering (DP), sono stati ottimizzati individualmente per ciascun composto e sono visualizzati nella Tabella 1. Il tempo di ciclo totale è stato di 385 ms. Tutte le misurazioni sono state eseguite in modalità di polarità negativa. Il potenziale di uscita della cella è stato impostato a -15 V, il potenziale di ingresso a -10 V, la tensione della sorgente ionica a -4500 V, la temperatura a 400 ° C, le pressioni del gas nebulizzatore e del gas del riscaldatore a 30 psi, il gas di cortina a 35 psi e il gas di dissociazione attivato dalla collisione a 6 psi. Per l'analisi dei dati è stato utilizzato il software PeakView 2.2.

Nome Q1 Q3 Tempo di sosta (ms) CE DP
3-OH-FA (4:0) 103 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (6:0) 131.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (8:0) 159.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (10:0) 187.1 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (12:0) 215.2 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (14:0) 243.2 59.1 50 −20 −80
3-OH-FA (12:0) [M+1-H] – 132.1 59.1 50 −15 −80
3-OH-FA (14:0) [M+1-H] – 160.1 59.1 50 −15 −80

Metodi cromatografici nella separazione di acidi grassi mono e polinsaturi a catena lunga

Questa recensione presenta vari sistemi cromatografici, TLC, HPLC, GC e anche SFC, sviluppati per l'identificazione e la quantificazione accurata di acidi grassi mono e polinsaturi a catena lunga da diversi campioni con enfasi sulla letteratura selezionata pubblicata nell'ultimo decennio. Quasi tutti gli aspetti come la fase di preseparazione degli acidi grassi (cis e trans), vengono discussi la fase stazionaria, il sistema solvente e la modalità di rilevamento.

1. Introduzione

Gli acidi grassi a catena lunga (LC-FA) sono composti organici in cui la lunghezza della catena idrocarburica può variare da 10 a 30 atomi di carbonio. La catena idrocarburica può essere satura o insatura (contiene uno o più doppi legami). In base al numero di doppi legami, gli acidi grassi insaturi sono classificati nei seguenti gruppi [1, 2]: (i) acidi grassi monoinsaturi (acidi monoenoici, MUFA), contenenti un doppio legame, ad esempio acido oleico, (ii) acidi grassi polinsaturi (acidi polienoici, PUFA), aventi due o più doppi legami, ad esempio, ?-acido linolenico, (iii) eicosanoidi, che sono derivati ​​da acidi grassi polienoici, ad esempio prostaglandine.

Dati recenti della letteratura indicano che sia gli acidi grassi monoinsaturi che quelli polinsaturi sono importanti composti biologici che svolgono un ruolo significativo per gli organismi viventi [3-17]. Studi sull'alimentazione umana negli ultimi dieci anni dimostrano che i PUFA e i MUFA sono i componenti principali della dieta ipocolesterolemizzante [4, 7, 9]. Inoltre, c'è stato un grande interesse per l'effetto di MUFA e PUFA sul sistema immunitario e infiammatorio [13]. Tra i vari acidi grassi monoinsaturi, il più popolare è l'acido oleico (C18:1n-9). Si trova nelle piante (ad esempio olio d'oliva), negli animali e nei microrganismi. Il consumo di olio d'oliva ha benefici per la prevenzione del cancro al colon e al seno [8]. Gli studi attuali mostrano che l'acido oleico svolge un ruolo importante nella prevenzione della malattia coronarica (capacità di ridurre il colesterolo LDL) [7, 9]. Gli acidi grassi polinsaturi simili agli acidi grassi monoinsaturi sono ampiamente distribuiti in natura [18]. Esistono tre classi di acidi grassi insaturi comuni nei tessuti umani [5]: i ?-3 (n-3 PUFA), ?-6 (n-6 PUFA), e ?-9 (n-9 PUFA) acidi grassi. Al gruppo degli acidi grassi insaturi discussi appartiene anche l'acido demospongico, una miscela di acidi grassi a catena molto lunga, principalmente C24-C30 con il sistema atipico di 5,9-diinsaturazione. Esiste nei microrganismi, negli invertebrati marini e nelle piante terrestri [19]. Le principali fonti di omega-3 sono i pesci, alcune piante e le alghe verdi [20]. Le alghe oleaginose verdi sono la potenziale fonte di quanto segue ?-3 acidi: eicosapentaenoico (EPA), docosaesaenoico (DHA), e anche acido arachidonico (AA) da ?-6 gruppo [21–23]. Gli Omega-6 PUFA sono presenti in alta concentrazione nei cereali così come in molti semi e carni. Per questo motivo possiamo notare un aumento del consumo umano di frutti di mare negli ultimi anni. I microrganismi oleosi, come fonti alternative di PUFA ad altri come i prodotti a base di olio animale, sono stati ampiamente studiati. Protisti fungoidi marini (Traustochitridi) Come Schizochytrium sono stati trovati come un romanzo, eccellente DHA ed EPA ?-3 produttori di acidi grassi [24, 25]. Un eccellente articolo di revisione eseguito da Nichols dimostra che molti microrganismi, inclusi i batteri marini, sono stati considerati i principali produttori de novo di n-3 PUFA [26]. I dati disponibili in letteratura suggeriscono che negli ultimi anni sono state condotte ricerche approfondite per la produzione di PUFA da parte dei funghi [27, 28]. Come è stato riportato da Arjuna tra i vari microrganismi, una fonte ottimale di acidi grassi polinsaturi omega-6 in particolare ?-acido linolenico (GLA) può essere alcuni funghi [27].

È noto che i PUFA possono influenzare molti processi fisiologici, comprese le funzioni cardiovascolari, neurologiche e immunitarie, nonché il cancro. Il consumo di oli ricchi di n-3 LC-PUFA durante la gravidanza riduce il rischio di parto prematuro [12]. Studi con primati non umani e neonati umani indicano che il DHA è essenziale per il normale sviluppo funzionale della retina e del cervello, in particolare nei neonati prematuri [13, 29]. Un nuovo articolo preparato da Kaczmarski et al. dimostrato il ruolo significativo dell'acido linoleico e anche α-acido linolenico in alcuni sintomi della dermatite atopica [17]. Pertanto, si può notare che i PUFA sono importanti bersagli nutraceutici e farmaceutici [22].

Fino ad oggi mancano le conoscenze sulla funzione di LC-PUFA nei tessuti e nelle cellule dei mammiferi in cui si trovano. Tuttavia, è stato affermato che è noto che gli acidi grassi polinsaturi a catena molto lunga si accumulano in due tipi di principali malattie genetiche perossisomiali, la sindrome di Zellweger e l'adrenoleucodistrofia legata all'X (X-ALD), caratterizzata da fenotipi neurodegenerativi [30, 31]. Lo studio di Hama e collaboratori ha mostrato l'esistenza di molti tipi di LC-PUFA in campioni di pazienti di Zellweger, suggerendo la possibilità di un nuovo biomarcatore per le malattie perossisomiali [31]. L'articolo di revisione eseguito da Aggaga e collaboratori [32] ha riassunto l'attuale conoscenza dei VLC-PUFA sul loro ruolo funzionale nella retina che sono altamente arricchiti in PUFA con particolare enfasi sugli allungamenti responsabili della loro sintesi da parte della proteina ELOVL4. L'interesse per LC-PUFA è stato riacceso nel 1987 dopo che i LC-PUFA sono stati inizialmente rilevati nelle retine bovine da Aveldano [33]. L'effetto del LC-PUFA retinico sui fotorecettori a bastoncello e cono è stato descritto anche da Bennett et al. [34]. Un altro articolo preparato da Butovich ha confermato che, tra i diversi tessuti dei mammiferi, il meibum è una miscela eccezionalmente complessa di vari acidi grassi [35].

Poiché la maggior parte dei LC-PUFA, compresi gli acidi grassi omega-3 e omega-6, non possono essere sintetizzati in quantità sufficiente dall'organismo umano, devono essere forniti con la dieta. Il problema dell'integrazione di LC-PUFA e dell'esplorazione di una nuova fonte (alternativa al pesce azzurro) di LC-PUFA (ad es. microalghe marine) è ampiamente descritto da pochi anni in molti articoli. Per questo motivo, è necessario trovare un metodo efficace e rapido per l'identificazione e la quantificazione degli acidi grassi mono e polinsaturi a catena lunga di nuova concezione nelle piante e nei prodotti ittici. È inoltre necessaria una serie di vari strumenti come i metodi cromatografici per completare l'intera caratteristica strutturale dei PUFA nei campioni di mammiferi, ad esempio nel plasma umano, nel cervello, nella retina o nel meibum. Questo è importante ai fini della diagnosi clinica.

Quindi, questa recensione presenta vari sistemi cromatografici, TLC, HPLC, GC e anche SFC, adatti per la preseparazione e la quantificazione accurata di acidi grassi mono e polinsaturi a catena lunga da diversi campioni con enfasi sulla letteratura selezionata pubblicata nell'ultimo decennio.

2. Cromatografia su strato sottile (TLC) di acidi grassi mono e polinsaturi a catena lunga

Gli acidi grassi a catena lunga saturi e insaturi (MUFA e PUFA) sono elementi strutturali di base dei lipidi. Pertanto, la determinazione cromatografica della composizione degli acidi grassi mediante TLC, compreso il contenuto di LC-MUFA e LC-PUFA, è obbligatoria per l'analisi dei lipidi nei campioni alimentari, agricoli e anche biologici [36-39]. Inoltre, gli acidi grassi mono e polinsaturi possono essere determinati cromatograficamente mediante TLC nei lipidi di organismi acquatici (ad esempio, pesci marini e d'acqua dolce, crostacei e alghe marine) [40].

È ben noto che la cromatografia su strato sottile è un metodo classico di separazione, identificazione e quantificazione degli acidi grassi [41]. L'indagine della letteratura dell'ultimo decennio dedicata all'analisi dei lipidi indica che, tra i diversi metodi analitici, la cromatografia su strato sottile (TLC) e la sua moderna cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC) sono ancora strumenti molto importanti nei lipidi e anche nei grassi analisi degli acidi Come riportato da Fuchs et al. [41], ci sono molti vantaggi che rendono la TLC molto competitiva con l'HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) nel campo degli acidi grassi come la semplicità d'uso, il costo meno costoso, il ridotto consumo di solventi rispetto all'HPLC, la disponibilità di analisi di diversi campioni in parallelo e possibilità di facile visualizzazione degli acidi grassi insaturi dopo il frazionamento TLC mediante l'uso di coloranti adatti [41]. Il rapporto di Sherma sull'analisi TLC in campioni di alimenti e agricoltura ha confermato che l'HPTLC quantitativo dotato di densitometro può produrre risultati paragonabili a quelli ottenuti mediante l'uso della gascromatografia (GC) o della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) [42].

L'argomento moderno nell'analisi TLC degli acidi grassi mono e polinsaturi è l'uso della cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni in combinazione con il rilevamento spettrometrico di massa, ad esempio HPTLC-MALDI-TOF/MS [43-48]. Gli studi di ricerca indicano che il rilevamento della MS è un potente strumento per l'identificazione dei punti TLC in modo più dettagliato rispetto ai metodi di colorazione tradizionali [41].

Molti tipi di fasi stazionarie classificate come normali (NP) e invertite (RP) vengono utilizzate per l'analisi TLC degli acidi grassi (MUFA e PUFA). Gli strati NP più popolari sono gel di silice, allumina, cellulosa, amido, poliammidi e farina fossile [42]. Di tutte le fasi stazionarie sopra menzionate, la migliore è il gel di silice, che può essere ulteriormente modificato mediante impregnazione con agenti diversi. La TLC in fase inversa viene solitamente eseguita su strati RP-18, RP-2 o RP-8 legati chimicamente [42].

Numerosi articoli di ricerca di Nikolova-Damyanova e altri autori hanno mostrato che il motivo principale che spiega perché la TLC gioca un ruolo significativo nell'analisi degli acidi grassi è la disponibilità di vari adsorbenti commerciali e fatti in casa, comprese le piastre TLC impregnate [36, 41, 49-51] . L'impregnazione delle piastre TLC con un reagente appropriato può migliorare la risoluzione di diverse classi di composti organici, inclusi gli acidi grassi. Tra le diverse modifiche delle fasi stazionarie utilizzate nella TLC, il gel di silice impregnato è un adsorbente molto adatto per l'analisi di MUFA e PUFA [41].

2.1. Separazione di MUFA e PUFA con l'uso di piastre TLC impregnate

Una delle procedure di impregnazione della TLC principalmente utilizzate per separare gli acidi grassi in campioni lipidici complessi era la TLC con ioni d'argento (Ag-TLC). Informazioni dettagliate sull'Ag-TLC degli acidi grassi saturi e insaturi sono state fornite in diversi articoli e libri [36, 49–51]. La cromatografia con ioni d'argento si basa sulla capacità di Ag + di formare complessi di trasferimento di carica reversibili deboli con

elettroni dei doppi legami degli acidi grassi insaturi [36, 52]. La ritenzione degli acidi grassi insaturi a catena lunga dipende dalla forza di complessazione con Ag (I), dal numero di doppi legami e dalla loro configurazione, e anche dalla distanza tra i doppi legami. I dati di letteratura indicano che in Ag-TLC vengono utilizzate sia lastre di vetro fatte in casa che prerivestite [51]. Le procedure generali di preparazione delle fasi stazionarie per le tecniche cromatografiche con ioni d'argento sono state esaminate da Momchilova e Nikolova-Damyanova, nel 2003 [53]. Tra i vari adsorbenti per TLC disponibili, il gel di silice è il principale materiale di supporto [53]. L'impregnazione dello strato sottile viene eseguita spruzzando o immergendo la lastra in una soluzione di nitrato d'argento alla concentrazione dello 0,5-20% (in caso di immersione), mentre per la procedura di spruzzatura si consiglia una soluzione al 10-40% di nitrato d'argento [51, 53]. La fase mobile utilizzata nell'argentazione TLC consiste solitamente di due o tre componenti, ad esempio esano, etere di petrolio, benzene e toluene. Inoltre, a queste fasi mobili possono essere aggiunte piccole quantità di acetone, dietil etere, etanolo, metanolo o acido acetico [40]. Di vari agenti di visualizzazione delle macchie, quelli più popolari per l'Ag-TLC degli acidi grassi sono una soluzione etanolica al 50% di acido solforico, acido fosfomolibdico e una miscela di acido rame-acetato-fosforico. Un altro metodo di visualizzazione è spruzzare le piastre con un indicatore fluorescente di 2′,7′-diclorofluoresceina in etanolo e successivamente osservare i punti sotto la luce UV [36]. Le regole generali di migrazione nell'analisi Ag-TLC degli acidi grassi sono state descritte da Nikolova-Damyanova e collaboratori [53, 54]. Secondo i suggerimenti di Nikolova-Damyanova la ritenzione degli acidi grassi con più di un doppio legame dipende dalla distanza tra i legami e l'ordine di eluizione è il seguente: doppi legami separati acidi grassi > doppi legami interrotti > doppi legami coniugati acidi grassi insaturi a catena più lunga (LC-PUFA) sono trattenuti meno fortemente degli acidi grassi a catena più corta e degli acidi grassi con trans i doppi legami sono tenuti meno fortemente degli acidi grassi con cis doppi legami [53, 54].

Una delle prime analisi Ag-TLC degli acidi grassi è stata eseguita da Wilson e Sargent nel 1992 per separare i PUFA di interesse fisiologico. Gli esteri metilici di PUFA sono stati separati su piastre di gel di silice 60 TLC impregnate di AgNO3. Le piastre sono state sviluppate con toluene-acetonitrile (97: 3, v/v). La visualizzazione delle macchie è stata effettuata mediante l'uso di acetato di rame al 3% e acido ortofosforico all'8%. È stato affermato che questa tecnica è particolarmente utile per gli studi metabolici dei PUFA a catena allungata [55]. In un altro lavoro Wilson e Sargent hanno dimostrato che le piastre TLC impregnate di nitrato d'argento erano utili nella separazione degli acidi grassi monoinsaturi (come esteri metilici) dagli acidi grassi polinsaturi e anche dagli acidi grassi saturi, rispettivamente, negli studi metabolici degli acidi grassi da parte dei fibroblasti della pelle umana [56 ]. Il prossimo lavoro di Lin et al. hanno indicato che il gel di silice e l'esano-cloroformio-dietil etere-acido acetico (80: 10: 10: 1, v/v/v/v) erano buoni nell'analisi dell'acido docosaesaenoico (22: 6 DHA) negli spermatozoi delle scimmie [ 57]. I singoli fosfolipidi da questo campione sono stati separati mediante un altro sistema come cloroformio-metanolo-etere di petrolio-acido acetico-acido borico (40: 20: 30: 10: 1,8, v/v/v/v/v). Altri dati di letteratura hanno confermato che la cromatografia su gel di silice argentata ha permesso di ottenere l'acido eicosapentaenoico di elevata purezza estratto da microalghe e oli di pesce [58]. Le recenti revisioni della letteratura che si sono concentrate sulla cromatografia TLC mostrano che, tra i diversi materiali cromatografici, l'Ag-TCM-TLC (gel di silice argento-tiolato) è molto stabile (rispetto alle piastre Ag-TLC altamente sensibili alla luce) per l'analisi TLC di insaturi composti organici tra cui MUFA e PUFA. Dillon et al. [59] ha confermato che il sistema Ag-TCM-TLC funziona in modo simile all'Ag-TLC separando gli acidi grassi in base al grado di insaturazione (numero di doppi legami). I risultati di questa analisi sono paragonabili a quelli ottenuti da Ag-TLC. Il metodo Ag-TCM-TLC è stato utilizzato per analizzare alcuni poliidrocarburi e anche esteri metilici di acidi grassi insaturi contenenti da 0 a 6 doppi legami sotto forma di esteri metilici. Come fase mobile è stata utilizzata una miscela costituita da esano-acetato di etile (9 : 1, v/v). In queste condizioni è stata osservata la completa separazione degli acidi grassi con 0-5 doppi legami. La risoluzione degli acidi grassi costituiti da 6 doppi legami da altri non è stata ottenuta in questo caso [59].

I risultati presentati in questa sezione mostrano che nella separazione degli acidi grassi insaturi sono state utilizzate varie piastre commerciali di gel di silice, ma alcune di esse non sono adatte al processo di derivatizzazione mediante metilazione degli acidi grassi su piastre TLC e successiva quantificazione mediante gascromatografia, poiché provoca la perdita di acidi grassi separati [60]. La procedura di metilazione degli acidi grassi dopo il loro precedente frazionamento su gel di silice argentata è stata utilizzata nelle analisi degli acidi grassi insaturi da semi ricchi di lipidi. In questo caso come fase mobile è stata utilizzata una miscela di esano-dietil etere-acetico e 70 : 30 : 1 (v/v/v). Le piastre sono state spruzzate con una soluzione etanolica di 2′,7′-diclorofluoresceina e successivamente identificate sotto lampada UV (a 365 nm) [60]. Shahin et al. [61]. Un altro articolo preparato da Kramer et al. dimostrato che la tecnica migliore per analizzare il CLA e trans 18: 1 isomeri in prodotti sintetici e animali è la combinazione della gascromatografia con Ag-TLC o con Ag-HPLC [62]. Inoltre, l'utilizzo di Ag-TLC nella separazione di forme isomeriche di EPA e DHA ottenute dopo l'isomerizzazione chimica degli stessi (durante la deodorizzazione dell'olio di pesce) può essere trovato in un articolo di Fournier et al. [63].

Una nuova applicazione di Ag-TLC è la bioanalisi. Un metodo TLC semplice e rapido per l'analisi dei livelli di PUFA nel sangue umano è stato sviluppato da Bailey-Hall et al. [64].

Va precisato che, oltre alla modifica del gel di silice con ioni Ag+, i seguenti sali metallici, Cu(I), Cu(II), Co(III), e Zn(II), possono essere utilizzati per l'impregnazione di Piastre TLC [41, 65]. Un altro tipo di impregnante per l'analisi TLC degli acidi grassi (MUFA e PUFA) è l'acido borico. È stato affermato che i metaboliti dell'acido arachidonico sono stati separati in modo soddisfacente su gel di silice impregnato di acido borico come agente complessante e dalla fase mobile: esano-etere etilico (60: 40, v/v) [41, 65]. La successiva modifica della fase stazionaria che ha un impatto sull'effetto di risoluzione degli acidi grassi e dei loro derivati ​​come i metaboliti (ad es. fosfolipidi) è l'EDTA e la fase mobile contenente acqua cloroformio-metanolo-acido acetico in composizione volumetrica di 75: 45: 3: 1 [ 41, 66]. Un altro lavoro ha mostrato che è possibile ottenere una separazione efficiente di cinque diversi fosfolipidi mediante l'impregnazione delle piastre TLC con solfato di ammonio allo 0,4%. Una miscela di cloroformio-metanolo-acido acetico-acetone-acqua in una composizione in volume di 40: 25: 7: 4: 2 era adatta per questa procedura [67].

Oltre al sistema TLC sopra presentato in fase normale (NP-TLC), gli acidi grassi insaturi ei loro metaboliti potrebbero essere separati su piastre RP-TLC. Uno dei primi rapporti incentrati sull'analisi RP-TLC di PUFA è stato realizzato da Beneytout e collaboratori nel 1992 [68]. Beneytout et al. acido arachidonico separato e i suoi metaboliti su uno strato in fase inversa. Le piastre erano rivestite di gel di silice con fenilmetilvinilclorosilano.Una miscela di eptano-metil formiato-dietil etere-acido acetico (65: 25: 10: 2, v/v/v/v) è stata applicata come fase mobile [68].

2.2. 2D-TLC di MUFA e PUFA

La TLC bidimensionale (2D-TLC) è uno dei potenti strumenti di nuova concezione per separare varie miscele di lipidi e acidi grassi provenienti dai lipidi. È noto che il 2D-TLC ha migliorato la qualità della separazione, ma richiede molto più tempo rispetto al molto popolare 1D-TLC [41]. La revisione della letteratura ha mostrato che 2D-TLC è piuttosto un metodo di scelta per la separazione dei lipidi dai polifosfoinositidi della membrana cellulare e anche dei prodotti di ossidazione lipidica in miscela. Questa analisi viene solitamente eseguita su gel di silice impregnato con acetato di magnesio (7,5%) e mediante sistema solvente cloroformio-metanolo-ammoniaca (5 : 25 : 5, v/v/v) nella prima direzione e cloroformio-acetone-metanolo-acetico acqua acida (6 : 8 : 2 : 2,1, v/v/v/v) nella seconda dimensione [69].

2.3. Rilevamento di macchie e metodi di quantificazione di MUFA e PUFA

Il rilevamento degli acidi grassi mediante il metodo TLC si basa sulla loro visualizzazione mediante il legame a un colorante. Come è stato riportato in un'eccellente revisione da Fuchs et al. [41] in letteratura sono descritti molti reagenti di visualizzazione adatti alla rilevazione di acidi grassi. Tra questi, i reagenti più popolari sono i vapori di iodio, la 2′,7′-diclorofluoresceina, la rodamina 6G, che producono macchie colorate, e anche la primulina, che fornisce sensibilità nell'ordine delle nanomole [41]. In caso di PUFA si ottiene un intenso scurimento dopo la loro separazione su AgNO3 piastre TLC impregnate (come effetto della riduzione di Ag+ ad argento colloidale), ma questo metodo di rilevazione richiedeva la presenza di idrocarburi aromatici come componente della fase mobile [70]. Altri reagenti di visualizzazione sono i seguenti: acido solforico, dicromato di potassio in acido solforico al 40% o soluzione al 3-6% di acetato di rame in acido fosforico. Inoltre, è possibile rilevare diversi acidi grassi mediante PMA (acido fosfomolibdico) e vapori di cloruro di solforile [41]. La visualizzazione delle macchie di acidi grassi viene eseguita spruzzando o immergendo le piastre in una soluzione dei rispettivi agenti di visualizzazione. Successivamente, le macchie vengono osservate alla luce UV o identificate mediante densitometria. Per una caratterizzazione più dettagliata degli acidi grassi che sono stati separati mediante cromatografia su strato sottile, può essere utilizzata la TLC combinata con lo spettrometro di massa (TLC-MS). In questo metodo le macchie vengono eluite dalle piastre cromatografiche con rispettivi solventi e gli acidi grassi successivamente ottenuti vengono analizzati mediante MS. L'applicazione di TLC accoppiata con MS consente un'elevata risoluzione dei picchi identificati. Inoltre, non è necessario estrarre il campione dalle piastre prima di questa analisi [41]. Una novità nella strumentazione cromatografica su strato sottile è una TLC in combinazione con lo spettrometro MALDI MS (TLC MALDI) [44, 71, 72]. Questa tecnica è piuttosto veloce e fornisce spettri che possono essere analizzati in modo relativamente semplice e tollera un'elevata contaminazione del campione [41]. Il limite di rilevazione degli acidi grassi determinato da TLC MALDI potrebbe essere inferiore a 1 nanogrammo [41]. È stato affermato che TLC MALDI potrebbe essere applicato in modo soddisfacente a miscele lipidiche molto complesse (ad esempio estratti da cellule staminali) [47]. Ad esempio, mediante cromatografia su strato sottile combinata e analisi MALDI-TOF/MS dell'estratto lipidico totale dell'archeone ipertermofilo Pyrococcus furiosus sono stati eseguiti [45]. La prossima tendenza moderna nell'analisi del profilo lipidico è l'uso del metodo TLC accoppiato con FID (rivelatore a ionizzazione di fiamma) [73]. Chromarod/Iatroscan TLC-FID è stato utilizzato con successo nell'analisi delle classi lipidiche e dei loro costituenti degli acidi grassi estratti dai frutti di mare. Come è stato descritto nell'articolo di Sinanoglou et al. [73], Iatroscan è uno strumento che combina la risoluzione delle TLC con la capacità di quantificazione mediante FID. È possibile ottenere un'efficiente separazione TLC-FID mediante l'aggiunta di un sistema di solventi polari senza modificare la fase stazionaria. Tuttavia, questo apparato consente di analizzare in breve tempo (2-3 ore) rispetto a GC o HPLC circa 30 campioni [73].

2.4. TLC Separazione di cis e trans Isomeri di MUFA e PUFA

Poiché è stato riportato che gli acidi grassi saturi indicano una correlazione con le malattie cardiovascolari, gli acidi grassi insaturi sono stati raccomandati per la sostituzione degli acidi grassi saturi in una dieta. Per questo motivo si osserva un aumento di interesse per gli acidi grassi insaturi come gli acidi grassi n-6 e n-3. È noto che gli acidi grassi insaturi discussi formano isomeri geometrici specifici. Possono essere trans o cis a seconda dell'orientamento del doppio legame. Di tutti gli acidi grassi polinsaturi il trans I PUFA costituiti da lunghezze di catena C18, C20 e C22 fanno solitamente parte della dieta umana. Pertanto, è molto importante rilevarli e quantificarli nei prodotti alimentari. Uno dei metodi più popolari per ottenere gli acidi grassi mono-, di- e triinsaturi sotto forma di isomeri geometrici (cis e trans), rispettivamente, è un processo termico o chimico [63]. Sintesi di trans isomeri è solitamente prodotto dalla produzione alimentare (raffinazione, idrogenazione). Ad esempio, trans gli isomeri si formano durante la deodorizzazione (fase cruciale della raffinazione) degli oli vegetali o di pesce. Come riportato da Fournier et al. [63], le metodologie relative alla separazione accurata e alla quantificazione di trans isomeri di acidi grassi mono-, di- e triinsaturi mediante metodi cromatografici sono stati sviluppati nell'ultimo decennio. Ag-TLC è una delle tecniche cromatografiche più potenti ampiamente applicate per separare cis e trans isomeri di LC-PUFA perché è caratterizzato da semplicità, basso costo ed efficienza. Gli isomeri geometrici sono separati in base al loro numero di doppi legami. L'efficacia dell'Ag-TLC per la separazione degli isomeri EPA e DHA è stata confermata da Fournier et al., nel 2006 [63]. A questo scopo piastre TLC prerivestite con gel di silice e impregnate di AgNO3 erano abituati. Una miscela di toluene-metanolo nella composizione del volume 85: 15 è stata applicata come mobile per la risoluzione di EPA mono-, di-, tri-, tetra-, penta-trans e DHA esa-trans isomeri [63]. In un altro lavoro, al fine di determinare il profilo di cis e trans isomeri di CLA nel fegato con il metodo TLC, una miscela di triclorometano-n-esano-acido etanoico glaciale 65:35: 1 (v/v/v) e anche lastre di gel di silice. La soluzione di rodamina è stata utilizzata come agente di visualizzazione. In ulteriori passaggi, dopo metilazione degli acidi grassi separati, questi sono stati quantificati con il metodo GC [74].

Il documento successivo ha indicato che la cromatografia preparativa su strato sottile di nitrato d'argento è stata applicata con successo per analizzare il cis, cis-acido ottadecadienoico (18 : 2) in campioni commerciali di grasso di burro bovino. Il rilevato da Ag-TLC cis, cis-5,9-18 : 2 isomero è stato trovato per la prima volta nel grasso del burro [54]. In un altro studio alimentare, novantatre campioni commerciali di grassi del burro bulgaro prodotti uniformemente durante l'anno sono stati sottoposti a nitrato d'argento-TLC quantitativo di componenti di acidi grassi (come esteri isopropilici), con particolare attenzione trans contenuto di acidi grassi monoenoici [75]. Tutti i risultati ottenuti indicano che la TLC con argentazione dovrebbe essere una tecnica analitica efficace nel frazionamento e nell'identificazione degli isomeri geometrici degli acidi grassi insaturi come i PUFA.

La tabella 1 mostra i sistemi TLC più efficienti utilizzati per la separazione e il frazionamento di acidi grassi da varie matrici.

3. Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

Ci sono pochi eccellenti documenti e recensioni originali fino ad oggi che si concentrano sull'uso della cromatografia su colonna liquida per l'analisi degli acidi grassi (saturi e insaturi) e anche delle loro sostanze correlate in campioni biologici, alimentari e farmaceutici [18, 93-96] . In questi documenti sono stati ampiamente applicati i principi dell'HPLC, tra cui la preparazione del campione, le fasi mobili, le fasi stazionarie e i metodi di rilevamento. Tra i precedenti articoli di revisione, solo tre esaminano la conoscenza degli acidi grassi a catena lunga. Uno di questi preparato da Rao et al. [94] hanno mostrato l'analisi LC-PUFA con l'uso di HPLC ma dal 1974 fino al 1995. Il successivo documento supportato da Rezanka e Votruba [96] ha dimostrato l'uso della cromatografia inclusa l'HPLC per l'analisi di acidi grassi a catena molto lunga dal 1982 al 2001. La terza revisione preparata da Kolanowski e collaboratori [97] ha descritto gli importanti metodi strumentali come HPLC e anche GC per l'analisi degli acidi grassi polinsaturi omega-3 a catena lunga ma solo negli alimenti. La mancanza di una panoramica sui nuovi risultati nell'analisi HPLC degli acidi grassi mono e polinsaturi con un'enfasi sull'analisi degli acidi grassi polinsaturi a catena lunga come omega-3 e omega-6 fa sì che vi sia la necessità di eseguire un'analisi completa indagine bibliografica dal 2002 al 2013 (ultimo decennio) con enfasi sull'applicazione dell'HPLC per l'analisi di tutte le importanti LC-MUFA e LC-PUFA biologiche a livello analitico in varie matrici. Questo documento mette in evidenza i moderni risultati dell'HPLC, inclusi i principi dell'analisi MUFA e PUFA in diverse matrici: modalità di separazione e nuovi sistemi di rilevamento che consentono la quantificazione di LC-PUFA a livello di nanogrammi. L'attuale conoscenza dell'analisi HPLC di acidi grassi mono e polinsaturi è stata descritta sulla base dei lavori pubblicati nell'ultimo decennio (2002-2013).

L'uso dell'HPLC per la separazione e la quantificazione degli acidi grassi è aumentato dal 1950, quando fu applicato per la prima volta da Haward e Martin per l'analisi di alcuni acidi grassi [98]. Da questo momento fino ad oggi si osserva un progresso molto rapido nell'analisi HPLC di tutti gli acidi grassi inclusi LC-MUFA e LC-PUFA. È noto che, in base alla natura della fase stazionaria (solida o liquida), la cromatografia liquida ad alte prestazioni è suddivisa in [18] cromatografia liquido-liquido (LLC), cromatografia ad adsorbimento (LSC) e cromatografia in fase inversa (RP) , che è una combinazione di LSC e LLC.

Tra le tecniche cromatografiche liquide ad alte prestazioni sopra menzionate, l'RP-HPLC gioca un ruolo chiave nell'analisi LC-PUFA [94]. Questa tecnica permette di separare quegli acidi grassi che non possono essere separati dalla normale HPLC in fase. Come è stato riportato all'inizio da Rao et al. [94] la ritenzione degli acidi grassi in RP-HPLC dipende dalla polarità della fase stazionaria, della fase mobile e dalla struttura chimica degli acidi grassi esaminati. In generale, il tempo di ritenzione è proporzionale alla lunghezza della catena e al numero di doppi legami presenti negli acidi grassi esaminati. Inoltre, l'influenza dell'isomerizzazione geometrica degli acidi grassi gioca un ruolo molto importante nell'analisi HPLC in fase inversa. È stato riferito che il cis gli isomeri degli acidi grassi sono generalmente eluiti prima trans isomeri. Un effetto simile si osserva nel caso delle differenze nel numero di atomi di carbonio negli acidi grassi studiati. Quelli con piccole quantità di carbonio (catena corta) vengono eluiti per primi rispetto agli acidi grassi a catena lunga [94]. La letteratura attuale indica che l'HPLC in fase inversa è uno dei metodi popolari utilizzati nel campo dell'analisi degli acidi grassi di MUFA e PUFA per la sua semplicità, riproducibilità e credibilità. I risultati ottenuti mediante HPLC sono generalmente comparabili con quelli determinati mediante metodo GC. Inoltre, il tempo di analisi è paragonabile alla tecnica GC [94]. Tuttavia, lo sviluppo di nuove modalità di rilevamento come il rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID) o il rilevatore elettrochimico (ED) migliora l'applicabilità dell'HPLC per l'analisi MUFA e PUFA [93].

3.1. Metodi di derivatizzazione degli acidi grassi per l'analisi HPLC

Il problema più importante nello studio HPLC di LC-MUFA e anche di LC-PUFA è la necessità di rilevarli a livelli di concentrazione inferiori come nanogrammi o picogrammi. La derivatizzazione degli acidi grassi può migliorare l'importanza per i parametri di analisi HPLC come sensibilità, precisione, selettività e anche un limite di rilevamento e quantificazione [18, 95]. Diversi metodi di derivatizzazione utilizzati per la determinazione quantitativa e qualitativa degli acidi grassi sono stati ampiamente descritti in un articolo di revisione di Rosenfeld nel 2002 [99]. In generale, il tipo di agente derivatizzante dipende dal tipo di rivelatore applicato nell'analisi PUFA, inclusi i rivelatori di assorbimento UV, fluorescenza, diffusione della luce e indice di rifrazione [94].

Il rivelatore UV-VIS è il sistema di rivelazione più diffuso applicato in cromatografia liquida perché è sensibile e specifico. Nel 1983 Aveldano e collaboratori [100] hanno applicato la cromatografia liquida ad alta pressione in fase inversa con rivelazione UV su colonna octadecylsilil per separare una miscela di acidi grassi saturi e insaturi non derivatizzati e i loro esteri metilici provenienti da tessuti di mammiferi.

Generalmente per facilitare la rivelazione per assorbimento UV-VIS vengono utilizzati i seguenti reagenti derivatizzanti per acidi grassi [93]: bromuro di fenacile (PB), bromuro di p-bromofenacile (BPB), bromuro di p-clorofenacile (CPB), p-nitrofenacil bromuro che vengono utilizzati nell'analisi degli acidi grassi negli oli, negli standard e nel sangue nell'intervallo da ng a pmol [97]. Gli esteri naftil (ottenuti da bromuro di 2-naftil, p-nitrofenacile e p-diclorofenacile consentono la rilevazione di picogrammi di acidi grassi nella miscela standard. 2-nitrofenilidrazina (NPH) e 2-bromoacetofenone (o α,p-dibromoacetofenone, BAP) convertono gli acidi grassi in derivati ​​specifici rilevabili in campioni biologici (siero) con limiti di rilevabilità in fmoli. I derivati ​​PNB (p-nitrobenzile) e p-metiltiobenzil cloruro (MTBC) di acidi grassi con limiti di rilevabilità in pmole sono importanti nell'analisi dell'olio di cocco. Il reagente derivatizzante ideale per la separazione chirale degli acidi grassi è il 3,5-dinitrofenil isocianato (DNPI) [96].

Il prossimo sistema di rilevamento molto popolare applicato nell'HPLC è il rilevatore a fluorescenza che ha una maggiore sensibilità rispetto al rilevatore UV-VIS. Per questo motivo potrebbe quantificare la composizione degli acidi grassi a livello di picomole e femtomole. Diversi reagenti fluorescenti vengono utilizzati per la derivatizzazione di acidi grassi come il 9-diazometilantracene (9-DMA) e il 9-antrildiazometano (ADAM). Gli esteri antrimetilici degli acidi grassi possono essere facilmente rilevati nel plasma umano e nel siero nelle picomoli. Altri derivati ​​più sensibili di ADAM sono gli esteri del pirenildiazometano (PDAM). Le cumarine e il 9-amminofenantrene (9-AP) sono importanti nella rilevazione degli acidi grassi in campioni ambientali e biologici nell'intervallo da pmoli a fmole. Altri derivati ​​come le dansil piperazine e le acetamidi degli acidi grassi possono essere rilevati nel siero al di sotto dell'intervallo di 100 fmol [93, 94, 97]. Un recente studio condotto da Wang e collaboratori nel 2013 indica che l'utilizzo di un nuovo reagente di etichettatura fluorescente denominato 1,3,5,7-tetrametil-8-butyrethylendiamine-difluoroboradiaza-s-indacene (TMBB-EDAN) è una tecnica HPLC sensibile e rapida per il è stata sviluppata la determinazione degli acidi grassi in campioni biologici (ad es. siero umano). Con la procedura proposta il limite di rilevamento dei derivati ​​degli acidi grassi era nell'intervallo 0,2-0,4 nM [101].

Un altro tipo di rilevamento degli acidi grassi è la chemiluminescenza. Questo metodo si basa sulla pre-etichettatura dei gruppi –COOH con un opportuno reagente chemiluminogenico. In pratica luminal e il suo composto correlato isoluminal sono stati ampiamente utilizzati come reagenti di derivatizzazione chemiluminescente per acidi grassi a causa delle loro proprietà chemiluminescenti. Il sistema di rilevamento descritto è efficiente per il rilevamento sensibile di acidi grassi nel siero umano e plasma in picomoli [93].

Per rilevare le sostanze con proprietà ossidanti o riducenti, inclusi gli acidi grassi, può essere utilizzato un rilevatore elettrochimico (ED). Questa modalità di rilevamento consente la misurazione degli acidi grassi in campioni biologici complessi contenenti diversi componenti a livelli di nanogrammi. Per ottenere la maggiore sensibilità possono essere applicati i seguenti reagenti derivatizzanti per ED: p-amminofenolo 2,4-dimetossianilina 2-bromo-2′-nitroacetofenone derivati ​​ferrocenici 2,4-dinitrofenilidrazina e 3,5-dinitrobenzoil cloruro. L'applicazione clinica dell'HPLC-ED è mostrata nell'articolo di Kotani et al. [80]. In questo lavoro è stata eseguita la determinazione degli acidi grassi plasmatici inclusi PUFA come l'acido arachidonico e anche linoleico mediante cromatografia liquida ad alta prestazione accoppiata con rivelatore elettrochimico (HPLC-ED) [80]. Questa procedura può essere indicata per il monitoraggio degli acidi grassi plasmatici nei pazienti diabetici.

Tra i diversi tipi di rivelatori utilizzati nell'analisi HPLC degli acidi grassi, molto utile è quel rivelatore che non richiede nessuna delle procedure preliminari di derivatizzazione dei composti studiati come, ad esempio, il rivelatore a dispersione di luce evaporativa (ELSD) o lo spettrometro di massa (MS) [93 ]. Come è stato descritto in un articolo da Lima e Abdalla [93], il rivelatore a dispersione di luce per evaporazione è sensibile alla massa dell'analita vaporizzato e il suo sistema operativo non è limitato dalle caratteristiche di assorbimento dei singoli componenti e dalla natura dell'eluente. Pertanto, l'ELSD può essere utilizzato per risolvere il problema della separazione degli acidi grassi che hanno gruppi di assorbanza deboli [93].

3.2. Rilevamento spettrometrico di massa di acidi grassi

L'applicazione dell'HPLC-MS nell'analisi degli acidi grassi è nota solo dall'ultimo decennio. Lo spettrometro di massa è ampiamente utilizzato nell'analisi degli acidi grassi soprattutto in caso di campioni biologici. Uno dei principali vantaggi del metodo HPLC-MS è la possibilità di analizzare composti non volatili inclusi gli acidi grassi [93]. Numerose modalità di ionizzazione e rilevamento possono essere applicate per l'analisi degli acidi grassi come la ionizzazione elettrospray (ESI), la ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) e anche il tempo di volo (TOF). Una nuova possibilità nella spettrometria di massa HPLC è la MS tandem (HPLC-MS-MS) o la combinazione di ionizzazione elettrospray con spettrometro di massa tandem come la tecnica HPLC-ESI-MS-MS. Il principale vantaggio di LC-ESI è la grande separazione degli acidi grassi in matrici complesse come il plasma sanguigno. HPLC-MS-MS è un potente strumento nella determinazione della posizione del doppio legame o dei punti ramificati nella catena degli acidi grassi insaturi [93]. Il prossimo metodo HPLC sviluppato per la rilevazione di acidi grassi a catena lunga è il metodo HPLC-MS combinato con APCI, che è stato applicato nella rilevazione di acidi grassi a catena molto lunga sotto forma di esteri picolinilici provenienti dalla cera di canna da zucchero [102]. HPLC-MS accoppiato con tre sistemi di ionizzazione, impatto elettronico (EI), ionizzazione chimica a pressione atmosferica e ionizzazione elettrospray, era adatto per la determinazione accurata di PUFA e anche dei loro metaboliti ossidativi come gli eicosanoidi in campioni biologici nell'intervallo di pg [103 ]. Secondo i documenti preparati da Řezanka et al., che si sono concentrati sull'analisi degli acidi grassi negli organismi inferiori, la cromatografia liquida spettrometria di massa accoppiata alla modalità di ionizzazione APCI era il metodo più efficiente applicato per l'identificazione e la quantificazione di acidi grassi polinsaturi a catena molto lunga da acqua marina organismi (che hanno la capacità di produrre VLC-PUFA) come i dinoflagellati marini Amphidinium carterae e alghe verdi Chlorella kessleri [81, 104-106] e anche in olio ottenuto da Ximenia frutta (materia prima per l'industria cosmetica) [107]. Come è stato eseguito in questi documenti, il sistema HPLCMS-APCI consisteva in una colonna Hichrom (HIRPB-250AM) e un programma di solventi a gradiente con acetonitrile (MeCN), diclorometano (DCM) e propionitrile (EtCN) che erano adatti per la separazione 13 di esteri picolinici di VLCPUFA da organismi inferiori. Un'eccellente separazione degli esteri metilici degli acidi grassi insaturi provenienti dai crostacei d'acqua dolce è stata ottenuta dalla stessa fase mobile e dalla colonna cromatografica riempita con fase octadecilsilil (Supelcosil LC-18) [108]. Un'ampia revisione di un lunghissimo polinsaturo pubblicato da Řezanka e Sigler indica che i moderni metodi analitici come HPLC-MS rendono possibile la rilevazione e l'identificazione di VLC-PUFA in diverse classi di lipidi, inclusi regni microbici e funghi [109]. HPLC in fase inversa con eluizione in gradiente di un sistema solvente contenente acetonitrile e cloroformio e dotato di rivelatore a dispersione di luce (ELSD) è stato utilizzato per purificare e identificare gli esteri metilici di PUFA C16-C28 incluso acido octacosaottaenoico in quantità di milligrammi da microalghe marine [82] . Un metodo semplice basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni a coppia ionica in fase inversa (RP-HPLC) è stato utilizzato con successo per separare i vari monoepossidi degli acidi eicosatrienoico, arachidonico, eicosapentaenoico e docosaesaenoico [110]. Questi composti sono stati facilmente identificati mediante cromatografia liquida spettrometria di massa (HPLC-MS) con ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) nell'intervallo di nanogrammi [110]. Questo lavoro ha dimostrato che il metodo basato su APCI-MS accoppiato con HPLC è altamente affidabile per l'analisi di vari monoepossidi di PUFA nel loro studio sul metabolismo. Un altro sistema HPLC come la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa non acquosa (NARP-HPLC) con ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI-MS) era adatto per il rilevamento di 5 acidi grassi insaturi polimetilici interrotti come cis-5,9-ottadecadienoico (taxoleico), cis-5,9,12-ottadecatrienoico (pinolenico), cis-5,11-eicosadienoico (cheteleeronico), e cisAcidi -5,11,14-eicosatrienoici (sciadonic) isolati da oli di semi di conifere (ottenuti da larice europeo, abete rosso norvegese e abete bianco europeo) [111]. La combinazione di due metodi cromatografici come TLC e HPLC è stata utilizzata per analizzare gli acidi grassi n-3 negli integratori alimentari di olio di pesce. La frazione EPA e DHA ottenuta mediante il metodo Ag-TLC è stata ulteriormente analizzata mediante HPLC. La colonna cromatografica ODS (3,9 mm × 30 cm, 10 μm), fase mobile contenente acido tetraidrofurano-acetonitrile-acqua-acetico 25: 35: 75: 0,4 (v/v/v/v) e rivelatore a matrice di fotodiodi nell'intervallo 190-240 nm [112 ]. Il sistema HPLC dotato di colonna analitica Supelcosil C18 (4,6 mm × 25 cm) e rivelatore a matrice di fotodiodi (DAD) è stato utilizzato per l'analisi di PUFA idroperossidici come prodotti della perossidazione provenienti dal plasma umano. È stata utilizzata una miscela di acido acetico-acetonitrile-tetraidrofurano 52: 30: 18 (v/v/v) come fase mobile. L'analisi è stata monitorata a 200-300 nm. Il controllo della quantità mediante procedura applicata dei derivati ​​ottenuti dai PUFA può essere utile come marker clinici di stress ossidativo sui sistemi biologici [113]. In un'altra cromatografia liquida a fase inversa a gradiente di carta (C18 ODS 25 cm × 0,46 cm, 5 μm) mediante l'uso di acqua metanolo e rivelatore ELSD universale consentito per la separazione e il frazionamento di acidi grassi liberi saturi, insaturi e ossigenati come esteri metilici estratti da semi di Crepis alpina e Vernonia antielmintica, rispettivamente [114]. Questo lavoro ha mostrato che il C18 in fase inversa era adatto per la purificazione e il frazionamento dei PUFA prima della loro quantificazione mediante GC-MS. Oltre al sistema HPLC dotato dei suddetti tipi di modalità di rilevamento come ECD, MS, ELSD, DAD e UV, è anche molto utile un rilevatore di fluorescenza [115, 116] che ha consentito la determinazione precisa degli acidi grassi polinsaturi a catena lunga inclusi quelli linolenici acido arachidonico, eicosapentaenoico e docosaesaenoico nel siero umano a basse concentrazioni come le fmole. Ad esempio, il metodo descritto nel 1986 da Yamaguchi et al. eseguito la conversione di LC-PUFA in derivati ​​fluorescenti mediante reazione con 3-bromometil-6,7-dimetossi-1-metil-2(1H)-chinossalinone. Il processo di separazione è stato eseguito su una colonna a fase inversa (YMC Pack C8) con un'eluizione isocratica utilizzando acetonitrile acquoso al 72% (v/v) [115]. La letteratura attuale mostra che HPLC con diversi sistemi di solventi è adatto nell'analisi di nuovi esteri idrossilici grassi e acidi fosforici dell'acido 10-idrossi-2-decenoico (9-HAD) provenienti dalla pappa reale delle api (Apis mellifera). L'analisi HPLC è stata eseguita su sistemi a colonna Diaion HP-20, Sephadex LH-20 e Cosmosil 75C18-OP. Sono state applicate diverse fasi mobili contenenti acetonitrile. È stato applicato un rilevatore di indice di rifrazione per monitorare il profilo di eluizione degli acidi grassi esaminati [117].

3.3. HPLC agli ioni d'argento nella quantificazione e identificazione degli isomeri geometrici degli acidi grassi

Come riportato da Nikolova-Damyanova e Momchilova [118], l'HPLC con ioni d'argento (Ag-HPLC) è ampiamente applicato da molti scienziati come fase preliminare per il frazionamento di miscele complesse di acidi grassi nei loro gruppi prima dell'analisi quantitativa mediante GC metodo. La risoluzione degli acidi grassi mediante Ag-HPLC è ottenuta in base al numero e alla geometria dei doppi legami [118]. La separazione si basa sulla formazione reversibile di un debole complesso di trasferimento di carica tra uno ione d'argento e un doppio legame. Il problema principale in Ag-HPLC è l'introduzione di Ag+ in questo sistema. Quindi, analogamente al caso di Ag-TLC, il primo tentativo è stato eseguito su una colonna riempita in laboratorio con slurry della fase stazionaria (ad esempio gel di silice) impregnata con AgNO3. Il secondo metodo consiste nell'aggiungere una soluzione di ioni d'argento (AgNO3) in fase mobile. Il terzo metodo consiste nell'utilizzare una colonna a scambio cationico a base di silice disponibile in commercio (Nucleosil 5 SA) o la colonna prodotta da Chrompack (ChromSpher 5 lipids). Questi sistemi a colonna commerciali danno risultati molto migliori (migliore riproducibilità) dell'analisi degli acidi grassi rispetto a quelli preparati in laboratorio [118]. Un'altra eccellente revisione dei metodi cromatografici utilizzati per analizzare gli isomeri geometrici e posizionali degli acidi grassi di Aini et al. [119] hanno mostrato che i seguenti fattori influenzano la risoluzione degli acidi grassi nell'HPLC con ioni d'argento come il metodo di impregnazione della colonna, la composizione della fase mobile e anche la temperatura della colonna [119]. La scelta della composizione della fase mobile utilizzata nell'Ag-HPLC è solitamente a base di toluene, acetonitrile, esano o diclorometano [118, 120]. Buoni risultati sono stati ottenuti con l'uso di isopropanolo e tetraidrofurano come modificatore. La temperatura della colonna più bassa generalmente si traduce in un tempo di eluizione più breve in Ag-HPLC. Inoltre, il miglioramento della risoluzione degli acidi grassi monoenoici e polienoici è stato ottenuto convertendoli in esteri fenacilici, benzilici, n-propilici, n-butile ed etilisopropilici [52]. Separazione mediante Ag-HPLC accoppiato con rivelatore UV di cis- e transacidi -ottadecanoici descritti da Momchilova e Nikolova-Damyanova [83] hanno indicato che l'efficienza della separazione aumenta nel seguente ordine: feniletil < fenacil < p-metossifenacil esteri. Tuttavia, la ritenzione e la risoluzione di questi acidi grassi da parte dell'Ag-HPLC potrebbero essere influenzate da piccoli cambiamenti di diclorometano in fase mobile. Tra i vari sistemi cromatografici la migliore risoluzione di cis- e trans-isomeri posizionali dell'acido ottadecenoico dopo averli convertiti in esteri di p-metossifenacile è stato ottenuto su una colonna di ioni d'argento mediante eluizione isocratica con una fase mobile contenente esano-diclorometano-acetonitrile in composizione volumetrica di 60 : 40 : 0,2 (v/v/v) [120]. Una fase mobile simile è stata utilizzata da Momchilova e Nikolova-Damyanova nel 2000 per stimare le proprietà cromatografiche degli isomeri posizionali degli acidi grassi ottadecenoici dopo averli convertiti a 2-naftil, 2-naftilmetile e 9-antrilmetil derivati ​​[83]. Secondo i risultati ottenuti in questo documento, diclorometano-acetonitrile 100: 0,025 (v/v) come fase mobile ha fornito una migliore risoluzione dei derivati ​​9-antrilmetil di 6-, 9- e 11-18: 1. Alta risoluzione da Ag- L'HPLC è stato ottenuto per gli isomeri posizionali di PUFA come l'acido eicosapentaenoico, l'acido docosaesaenoico e anche l'acido docosapentaenoico proveniente da triacilgliceroli contenenti PUFA. Il sistema solvente esano-isopropanolo-acetonitrile era adatto per la separazione di questi composti [84]. L'isolamento di alcuni PUFA da oli commestibili mediante cromatografia su gel di silice argentato (Ag-TLC e Ag-HPLC) è stato eseguito da Guil-Guerrero et al. [121]. Usando questo metodo gli isomeri dei seguenti acidi grassi, acido linoleico, α-linolenico, ?-linolenico, acido stearidonico e acido eicosapentaenoico e docosaesaenoico, sono stati isolati sotto forma di esteri metilici da oli di semi di lino, girasole e borragine e da olio di fegato di mako a pinne corte. Allo stesso modo, come è stato descritto nella parte precedente, Ag-HPLC è stato utile per l'analisi degli isomeri geometrici dell'acido eicosapentaenoico e docosaesaenoico formati durante la deodorizzazione dell'olio di pesce [63]. I risultati ottenuti hanno mostrato che questa tecnica non può essere utilizzata per determinare gli isomeri nell'olio di pesce che si sono formati a temperature superiori a 180°C (ad es.trans DHA e tutto-cis EPA, è stato osservato. Analisi efficiente di trans isomeri dell'acido linoleico coniugato in prodotti sintetici e animali (da suini, carne di pollo) è stato ottenuto anche mediante tecniche cromatografiche tra cui Ag-HPLC [62]. La letteratura recente indica che la quantificazione degli isomeri geometrici separati da Ag-HPLC degli acidi grassi viene eseguita principalmente mediante GC-MS o mediante GC accoppiato con FID (rivelatore a ionizzazione di fiamma). I rivelatori FID, UV e refrattivi vengono solitamente utilizzati per la quantificazione diretta degli isomeri degli acidi grassi come esteri metilici. Come riportato da Nikolova-Damyanova e Momchilova [118], gli esteri aromatici degli acidi grassi possono essere rilevati da Ag-HPLC combinato con rivelatore UV-VIS nell'intervallo 0-200 μG. Il documento preparato nel 2013 da Sun e collaboratori dimostra che una cromatografia liquida/ozonolisi in linea/spettrometria di massa (LC/O3-MS) è un nuovo approccio pratico e facile da usare per la determinazione diretta della posizione del doppio legame nei lipidi presentati in miscele complesse. Per testare questo metodo in estratti lipidici complessi, un campione di grasso bovino con quantità note di isomeri posizionali e cis/trans sono stati analizzati gli isomeri degli acidi grassi insaturi. Il principale vantaggio dell'ozonolisi in linea è la sua applicabilità in combinazione con vari spettrometri di massa senza modifiche strumentali [122].

L'indagine di alcune condizioni HPLC selezionate utili per la separazione e l'identificazione di MUFA e PUFA da vari campioni è elencata nella Tabella 2.


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