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Cos'è oggi la "Regola Positiva Dentro" transmembrana? La definizione è cambiata nel tempo?

Cos'è oggi la


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Prima definizione.

Due pubblicazioni di von Heijne nel 1989 e nel 1992 hanno coniato la "regola Positive-Inside" e hanno mostrato il suo valore pratico nella previsione topologica delle eliche transmembrana. È stato chiaramente definito ed evidenziato che nei batteri i residui carichi positivamente si trovano più comunemente "all'interno" di una membrana (il citoplasma piuttosto che il periplasma).

Letteratura recente.

Tuttavia sembra che il campo si sia spostato dall'idea di "dentro il compartimento" a "dentro il citoplasma" man mano che si sono resi disponibili più dati. In una recensione del 2006 anche von Heijne descrive alcune eliche transmembrana come conformi alla regola interna positiva perché i loro residui caricati positivamente erano all'interno del citoplasma, anche se mai esplicitamente indietro sulla definizione originale. Una revisione simile nel 2007 di von Heijne offre un perfezionamento più definitivo della regola, tuttavia rimuove il concetto dall'essere applicabile alle membrane subcellulari.

… le anse che collegano le eliche differiscono nella composizione degli amminoacidi, a seconda che siano rivolte verso l'interno o verso l'esterno della cellula (la regola del “positivo-dentro”).

Ora ci troviamo di fronte a una regola scomoda che non tiene conto delle proteine ​​in altre parti della via secretoria o negli altri organelli. Tutte quelle proteine ​​sono all'interno della cellula.

Più recentemente ancora analisi su larga scala delle eliche transmembrana da diverse superfici di membrane biologiche, Sharpe et al., 2010 e Baeza-Delgado et al., 2013, mostrano che il raggruppamento della carica positiva è citosolico piuttosto che discuterlo in termini di interno del compartimento. Entrambi questi documenti dicono ancora che confermano la regola interna positiva.

Domanda.

A me sembra che la definizione sia alquanto sciatta e possa essere ampiamente usata per dire "dentro il citoplasma", nonostante le pubblicazioni siano riluttanti a definire chiaramente la regola. La definizione è mai stata esplicitamente modificata o il campo ha cambiato silenziosamente il significato di "dentro"?… O ho completamente frainteso qualcosa? Come si inseriscono gli organelli in una di queste definizioni?


Penso che tu abbia frainteso la parte "dentro" della "regola positiva-inside". Forse perché "dentro" è davvero un termine impreciso (ma ormai è storia e non si può cambiare ;) ). Per capirlo un po' meglio è utile pensare alla topologia della membrana. Durante la sintesi la maggior parte delle proteine ​​di membrana (ignorando le proteine ​​perossisomiali e mitocondriali, che sono tutt'altro argomento) vengono inserite nella membrana ER dal translocone Sec. Le parti della proteina di membrana che sono esposte al lume sono maturate dall'ER e dall'apparato di Golgi per essere presentate sulla superficie extracellulare. Le proteine ​​secretorie (quelle che alla fine verranno esportate dalla cellula) sono prodotte in modo simile tranne che passano interamente attraverso il translocone e finiscono nel lume del RE. Pertanto, il lume dell'ER (e di conseguenza il lume di altri compartimenti endomembrana) sono topologicamente coerenti con lo spazio extracellulare, "fuori", e non con l'"interno" della cellula. Forse è più facile da vedere in un'immagine (preso in prestito da qui: http://www.bioon.com/book/biology/mboc/chapter12/figure12-4.gif"> Colorati in rosa sono i comparti la cui topologia è coerente con il "fuori" e di colore grigio sono i comparti la cui topologia è coerente con il "dentro". Quindi, per le proteine ​​di membrana che si trovano nell'endosoma, ad esempio, i residui di amminoacidi nel lume sono in realtà "fuori" e non "interni". È vero che questo potrebbe non essere immediatamente chiaro a coloro che non sono profondamente immersi nel campo. Poiché gli studi iniziali utilizzavano batteri, che non hanno compartimenti subcellulari racchiusi nella membrana, "dentro" era semplice e aveva senso. Forse la "regola del positivo nel citoplasma" sarebbe stata più accurata. Spero questo sia di aiuto!


Topologia membrana-proteina

La topologia di una proteina integrale di membrana descrive il numero e le posizioni approssimative nella sequenza dei segmenti transmembrana, nonché l'orientamento complessivo della proteina in una membrana.

La topologia è controllata principalmente dall'idrofobicità e dalla lunghezza delle eliche transmembrana, nonché dalla distribuzione dei residui carichi positivamente negli anelli che collegano le eliche.

Nella maggior parte dei casi, la topologia è determinata in modo co-traduzionale durante l'inserimento mediato da translocone di un polipeptide in una membrana.

Le topologie in cui sia il terminale N che il terminale C di una proteina sono nel citoplasma sono predominanti sia nelle cellule procariotiche che in quelle eucariotiche.

Le proteine ​​di membrana si evolvono principalmente per duplicazione genica e fusione genica. Molte proteine ​​di membrana formano dimeri in cui le due catene omologhe hanno la stessa topologia (dimero parallelo) o topologie opposte (dimero antiparallelo). Le fusioni geniche creano strutture internamente duplicate in cui le due metà di una proteina sono orientate in modo parallelo o antiparallelo.


Recenti progressi nella comprensione dell'assemblaggio e della struttura delle proteine ​​di membrana

Per una serie di ragioni – non ultima l'importanza biomedica – le proteine ​​integrali di membrana sono ora molto al centro dell'attenzione in molte aree della biologia molecolare, della biochimica, della biofisica e della biologia cellulare. La nostra comprensione dei processi di base dell'assemblaggio, del ripiegamento e della struttura delle proteine ​​di membrana è cresciuta in modo significativo negli ultimi tempi, sia come risultato di nuovi sviluppi metodologici, più dati sulla struttura ad alta risoluzione e la possibilità di analizzare le proteine ​​di membrana su un genoma-wide scala.

Quindi cosa c'è di nuovo nel campo delle proteine ​​di membrana? Vari aspetti dell'assemblaggio e della struttura delle proteine ​​di membrana sono stati esaminati negli ultimi anni (Cowan & Rosenbusch, 1994 Hegde & Lingappa, 1997 Lanyi, 1997 von Heijne, 1997 Bernstein, 1998) qui, cercherò di mettere insieme una serie di interessanti recenti sviluppi. Particolarmente degne di nota sono le scoperte relative ai meccanismi di assemblaggio delle proteine ​​di membrana nella membrana interna di E. coli, nella membrana interna dei mitocondri e nel modo in cui i segmenti transmembrana vengono gestiti dal translocone ER.

Altri progressi includono studi dettagliati sull'interazione tra le eliche transmembrana e il doppio strato lipidico e sulle interazioni di impaccamento elica-elica nell'ambiente della membrana. La disponibilità di sequenze genomiche complete ha reso possibile lo studio delle proteine ​​di membrana su scala genomica. Infine, sono apparse una manciata di nuove strutture 3D ad alta risoluzione.


MATERIALI E METODI

Costrutti del DNA e sostanze chimiche

Il tag extracellulare tripla emoagglutinina (3HA), costituito da residui amminoacidici di SLEYPYDVPDY-ASYPYDVPDYAYPYDVPD, è stato inserito nel quarto ciclo extracellulare dopo il residuo 897 nel G551D CFTR, come descritto per il wild-type (wt) e ΔF508 CFTR (Sharma et al., 2004 Pedemonte et al., 2005). Il cDNA G551D CFTR è stato gentilmente fornito dal Dr. J. Rommens (Hospital for Sick Children, Toronto). Tutte le sostanze chimiche della massima purezza disponibile sono state ottenute da Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada) tranne quando indicato. La bafilomicina A1 (Baf) proveniva da LC Laboratories (Woburn, MA).

Cellule

Cellule HeLa, rene canino Madin-Darby (MDCK) e RAW264.7 sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) in un incubatore di coltura cellulare termostatato in 5% CO2 a 37°C. Cellule renali di criceto (BHK) sono state coltivate in DMEM/F12 contenente il 5% di FBS. Le cellule IB3 (gentilmente fornite dal Dr. P. Zeitlin, Johns Hopkins University) sono state coltivate in terreno basale LHC-8 (Invitrogen, Carlsbad, CA) contenente il 5% di FBS. Le cellule IB3 hanno il genotipo ΔF508/W1282X (Zeitlin et al., 1991). La linea cellulare epiteliale bronchiale umana derivata da un paziente CF con unF508F508 genotipo (CFBE41o-, designato come CFBE) sono stati caratterizzati (Cozens et al., 1994) e sono stati coltivati ​​in MEM con GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) integrato con siero FBS al 10% a 37 ° C in un 5% di CO2-incubatore umidificato come descritto (Gruenert et al., 1995). Per consentire la differenziazione di MDCK e CFBE, le cellule epiteliali sono state coltivate alla confluenza per 3-5 giorni. I macrofagi primari sono stati ottenuti mediante lavaggi intraperitoneali e broncoalveolari come precedentemente descritto (Guilbault et al., 2008). I macrofagi sono stati isolati mediante centrifugazione e risospesi in RPMI 1640 con 10% FBS e seminati su vetrini coprioggetto rivestiti di polilisina (Sigma). I coprioggetto sono stati rivestiti secondo le istruzioni del produttore. Gli esperimenti sono stati eseguiti 24-48 ore dopo la piastratura delle cellule.

Tutti i tipi di cellule utilizzati sono stati transfettati in modo transitorio o stabile con wt o G551D CFTR-3HA che ospitano tag tripla emoagglutinina nel quarto ciclo extracellulare (Sharma et al., 2004). La cellula BHK che esprime il wt e G551D CFTR-3HA è stata generata come descritto in precedenza e i cloni sono stati selezionati in presenza di 500 μM di metotrexato (Sharma et al., 2001).

Le varianti CFTR sono state espresse stabilmente nelle cellule CFBE e HeLa utilizzando vettori lentivirali dal Dr. J. Wakefield (Tranzyme, Birmingham, AL) e selezionate in presenza di puromicina 5 μg/mP come descritto (Bebok et al., 2005). Gli epiteli bronchiali IB3, che esprimono ΔF508 e W1282X CFTR endogeni a livelli non rilevabili, sono stati stabilmente trasfettati con il plasmide di espressione pCEP4 che codifica per il wt o G551D CFTR-3HA. Una miscela di cloni è stata selezionata in igromicina B. Le cellule trasfettate sono state mantenute in LHC-8 contenente il 5% di FBS e 100 μg · ml -1 di igromicina B. Le cellule RAW sono state transfettate transitoriamente con CFTR codificante pNut-CFTR utilizzando FuGENE6 come agente complessante del DNA ( Roche, Basilea, Svizzera) secondo la raccomandazione del produttore e analizzato dopo 48 h. Le cellule MDCK sono state infettate con retrovirus che codificano le varianti CFTR-3HA come descritto in precedenza (Benharouga et al., 2003).

Animali

Consanguineo C57BL/6-Cftr +/− topi eterozigoti sono stati mantenuti e allevati nell'Animal Facility del McGill University Health Center Research Institute. Tutti i cuccioli sono stati genotipizzati tra i 12 ei 14 giorni di età. Gli animali sono stati tenuti in gabbie con lettiera sterile per mais (Anderson, Bestmonro, LA) e mantenuti in rack ventilati (Lab Products, Seaford, DE). C57BL/6- di pari etàCftr +/- mouse e C57BL/6-Cftr −/− i topi sono stati mantenuti nel patogeno murino–, Helicobacter-, e condizioni di assenza di parassiti. Sono stati alloggiati (1-4 animali/gabbia), allevati e mantenuti in una struttura in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. I topi sono stati alimentati con la dieta di topi irradiati NIH-31 modificata per topi wt (Harlan Teklad, Indianapolis, IN) o con una dieta liquida a partire dai 14 giorni di età per topi knockout (dieta liquida Peptamen Nestlé Canada, Brampton, ON, Canada). La dieta liquida è stata preparata fresca ogni mattina e fornita in provette da centrifuga da 50 ml (Fisher Scientific, Nepean, ON, Canada). I topi utilizzati per gli esperimenti avevano un'età compresa tra 19 e 22 settimane. Le procedure sperimentali con i topi sono state condotte in accordo con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e con l'approvazione del Facility Animal Care Committee del Montreal General Hospital Research Institute (Montreal, PQ, Canada).

Etichettatura degli organelli endocitici con coloranti sensibili al pH

Il pH luminale degli endosomi precoci, degli endosomi di riciclo, dei lisosomi e dei fagosomi è stato determinato di routine dopo l'etichettatura selettiva del rispettivo compartimento con carico coniugato con fluoresceina isotiocianato transferrina (FITC) (ad es. CFTR, transferrina, destrano e P. aeruginosa PAO1) da FRIA come descritto per CFTR e altre molecole cargo (Sharma et al., 2004 Barriere et al., 2007 Kumar et al., 2007 Barriere e Lukacs, 2008 Duarri et al., 2008 Varghese et al., 2008 Glozman et al., 2009).

Per etichettare CFTR interiorizzato, le cellule sono state incubate con anti-HA (diluizione 1:500 equivalente a 10 μg/ml, MMS101R, Covance Laboratories, Madison, WI) Ab primario e Fab secondario anti-topo di capra coniugato con FITC (diluizione 1:500 , Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) incubando il primario per 1 ora a 37°C. Le cellule sono state quindi lavate (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM glucosio, 0,1 mM CaCl2e 1 mM MgCl2, pH 7,3) e inseguito per il tempo indicato a 37°C. L'assorbimento di Ab in fase fluida non era rilevabile nelle cellule trasfettate in modo simulato (dati non mostrati). Quando indicato, CFTR residente sulla superficie cellulare è stato etichettato su ghiaccio mediante successiva incubazione con l'Ab anti-HA primario e il FITC-Fab secondario.

Per confermare che l'Ab primario e secondario rimane legato al CFTR durante gli esperimenti FRIA, la resistenza al pH del legame dell'Ab è stata misurata mediante test di immunoperossidasi. Dopo il legame di Ab secondario anti-HA- e HRP-coniugato alle cellule HeLa che esprimono CFTR, il pH del mezzo extracellulare è stato regolato a pH 7,2, 5,0 e 2,5 per 5 min (van Kerkhof et al., 2001 NaCl 0,15 M, glicina 50 mM, BSA 0,1%, MES 20 mM, per pH 2,5 e 5,0, HEPES 10 mM per pH 7,2). La quantità di Ab coniugato con HRP è stata misurata mediante Amplex-Red come substrato, utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza POLARstar OPTIMA (BMG Labtech, Offenburg, Germany Barriere et al., 2006). Il legame Ab era praticamente inalterato a pH 5,0, ma ridotto del 50% a pH 2,5 (Figura supplementare S1A).

Gli endosomi di riciclaggio sono stati etichettati con FITC-transferrina (Tf 15 μg/ml, carico di 45 minuti dopo 45 minuti di deplezione sierica a 37 ° C) e inseguiti per 0-3 minuti. Il pH lisosomiale è stato misurato con risultati simili su cellule marcate mediante assorbimento notturno in fase fluida di FITC-destrano da solo o in combinazione con Oregon Green 488-destrano (50 μg/ml, MW 10 kDa, Molecular Probes, Eugene, OR) e inseguito per >3 h.

Il pH fagosomiale è stato monitorato in seguito all'assorbimento di FITC o FITC/TRITC-coniugato P. aeruginosa (ceppo PAO1, gentilmente fornito dal Dr. M. Parsek, Università di Washington, Seattle). Da una coltura notturna ∼5 × 10 8 batteri sono stati opsonizzati in 20% FBS-PBS per 30 minuti a 37 ° C con agitazione. Le cellule sono state lavate con PBS ed etichettate in presenza di 1 mg/ml FITC, TRITC o una combinazione di entrambi in PBS a pH 8,0 per 30 minuti a temperatura ambiente sotto rotazione. L'eccesso di coloranti fluorescenti è stato rimosso mediante centrifugazione ripetuta in PBS ghiacciato. I batteri sono stati congelati a scatto e conservati a -80°C.

Misurazione del pH organellare

La FRIA degli organelli endocitici è stata eseguita su un microscopio a fluorescenza invertita Axiovert 100 (Carl Zeiss MicroImaging, Toronto, ON, Canada) a temperatura ambiente equipaggiato con una camera CCD raffreddata Hamamatsu ORCA-ER 1394 (Hamamatsu, Giappone) e un Planachromat (63× NA 1.4) obiettivo essenzialmente come descritto in precedenza (Sharma et al., 2004 Barriere et al., 2007 Barriere e Lukacs, 2008 Glozman et al., 2009). L'acquisizione delle immagini e la FRIA sono state eseguite con il software MetaFluor (Molecular Devices, Downingtown, PA). Le immagini sono state acquisite a lunghezze d'onda di eccitazione di 490 ± 5 e 440 ± 10 nm, utilizzando un filtro di emissione di 535 ± 25 nm. Per determinare i tassi iniziali di acidificazione degli endosomi (vedi Figura 4E), CFTR è stato etichettato con anti-HA e Fab anti-topo di capra coniugato con FITC in sequenza per 1 ora su ghiaccio e inseguito a 37 ° C per i tempi indicati. La superficie cellulare rimanente Abs è stata strippata con acido prima dell'acquisizione dell'immagine (van Kerkhof et al., 2001).

Le curve di calibrazione in situ, che descrivono la relazione tra i valori del rapporto di fluorescenza e il pH dell'endosoma, del lisosoma o del fagosoma, sono servite per calcolare il pH luminale delle singole vescicole dopo la sottrazione del fondo di fluorescenza a entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione (ad es., Figura supplementare S1, B-D) . La calibrazione in situ è ​​stata eseguita bloccando il pH vescicolare tra 4,5 e 7,4 in un mezzo ricco di K + (135 mM KCl, 10 mM NaCl, 20 mM HEPES o 20 mM MES, 1 mM MgCl2e 0,1 mM CaCl2) con 10 μM di nigericina, 10 μM di monensina, 0,4 μM di Baf e 20 μM di cianuro di carbonile 3-clorofenilidrazone (CCCP Sigma-Aldrich) e registrando i rapporti di fluorescenza. Le curve di calibrazione sono state ottenute per ogni molecola di carico e ripetute ad intervalli regolari. Come controllo interno, è stata eseguita una calibrazione a un punto su ciascun coprioggetto bloccando il pH organellare a 6,5 ​​con monensina e nigericina 10 μM, Baf 0,4 μM e CCCP 20 μM. In ogni esperimento è stato determinato il pH di 200-800 endosomi/lisosomi e 100-400 fagosomi. Le distribuzioni gaussiane mono o multipicco dei valori di pH vescicolare sono state ottenute con il software Origin 7.0 (OriginLab, Northampton, MA) e sono stati illustrati i risultati dei singoli esperimenti. Il pH medio di ciascuna popolazione di vescicole è stato calcolato come media aritmetica dei dati in ogni singolo esperimento utilizzando 200-800 vescicole da 15 a 60 cellule. Per ogni condizione sono stati eseguiti almeno tre esperimenti indipendenti.

Determinazione della permeabilità relativa del controione e della capacità tampone degli organelli

La rapida dissipazione del gradiente di pH organellare da parte dell'inibitore della pompa protonica (Baf) e del protonoforo (CCCP) è stata utilizzata per determinare la relativa permeabilità al controione degli organelli. Le cellule sono state etichettate come descritto sopra e il pH organellare è stato continuamente monitorato da FRIA per il tempo indicato. La dissipazione del pH è stata misurata in presenza di 0,4 μM Baf e 20 μM CCCP. Per misurare la perdita di protoni passivi, è stato aggiunto solo Baf. Sia Baf che CCCP sono stati utilizzati a concentrazioni saturanti (Lukacs et al., 1990, 1991 Hackam et al., 1997 Steinberg et al., 2007b). Quando indicato, CFTR è stato attivato con il cocktail agonista PKA (20 μM forskolina, 0,5 mM 8-(4-clorofenil-tio)adenosina 3′,5′-sale di sodio monofosfato ciclico [CPT-cAMP] e 0,2 mM isobutilmetilxantina [IBMX ]) per 3 min prima dell'aggiunta di Baf+CCCP. FRIA è stata eseguita come descritto sopra. La velocità di dissipazione del pH è stata calcolata dalla pendenza iniziale della variazione del rapporto di fluorescenza. La capacità tampone degli organelli endocitici è stata calcolata dall'entità della rapida alcalinizzazione dopo l'aggiunta di 0,5–2 mM NH4Cl in presenza o meno di Baf. Il calcolo si è basato sulla formula di Roos e Boron (Roos e Boron, 1981 Sonawane e Verkman, 2003).

La determinazione passiva della permeabilità al protone

La permeabilità protonica passiva del riciclaggio di endosomi, lisosomi e fagosomi è stata calcolata secondo la seguente equazione: dove PH+ è la permeabilità protonica passiva organellare in cm · s −1 , dpHo/dt è il flusso di protoni organellari in pH · s −1 , V è il volume organellare in cm 3 , S è la superficie organellare in cm 2 ,v è la capacità tampone organellare in M ​​· pH −1 , e ([H + ]o − [H + ]C), è il gradiente protonico transmembrana tra il lume dell'organello e il citosol (Chandy et al., 2001 Grabe e Oster, 2001).Il flusso protonico passivo è stato misurato monitorando il tasso di alcalinizzazione organellare immediatamente dopo l'aggiunta di 400 nM Baf come mostrato nella Figura 2D. La capacità tampone è stata misurata monitorando la rapida alcalinizzazione degli organelli dopo NH4Aggiunta di Cl in presenza di Baf come dettagliato in Materiali e metodi e a Chandy et al. (2001). La superficie e il volume di endosomi e lisosomi sono stati ottenuti da dati pubblicati (Griffiths et al., 1989). Il calcolo del volume e della superficie del fagosoma si basava sull'ipotesi che il diametro medio del fagosoma fosse 3 μm e la distanza tra la parete batterica e il lembo interno della membrana fagosomiale fosse 100 nm, sulla base delle osservazioni EM (Hart et al., 1987 Chastellier, 2008). Alla luce dell'elevata conduttanza controionica degli organelli endocitici e del modesto potenziale di membrana dei fagolisosomi (<25 mV incluso l'effetto potenziale di Donnan Steinberg et al., 2007b), abbiamo ipotizzato che il potenziale di membrana abbia un modesto contributo alla forza protonica elettrochimica in organelli endocitici. Pertanto, la permeabilità protonica passiva è stata calcolata prendendo in considerazione solo la forza motrice del protone chimico, e quindi rappresenta probabilmente una sopravvalutazione. Il pH citoplasmatico è stato assunto costante (pH 7,3) durante le misurazioni dell'efflusso di protoni (Mukherjee et al., 1997).

Microscopia a immunofluorescenza

La distribuzione subcellulare di CFTR è stata determinata dopo l'internalizzazione di anti-HA Ab per 1 h in DMEM e inseguita per 0,5 h. CFTR è stato visualizzato da Fab anti-topo di capra coniugato con FITC o anti-topo di capra coniugato con TRITC dopo la fissazione delle cellule. Durante gli ultimi 45 minuti, le cellule sono state etichettate con FITC-Tf o TRITC-Tf (15 μg/ml) dopo 45 minuti di deplezione del siero per visualizzare gli endosomi di riciclaggio. I marker 1 dell'endosoma precoce (EEA1) e Rab5 sono stati rilevati mediante immunocolorazione indiretta utilizzando anticorpi policlonali di coniglio anti-EEA-1 e anti-Rab5 di Abcam (Cambridge, Regno Unito) e Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA), rispettivamente. I lisosomi sono stati marcati con FITC-destrano (50 μg/ml, MW 10 kDa) come descritto per la determinazione del pH. In alcuni esperimenti, il lisosoma è stato colorato con anti-Lamp-2 Ab monoclonale di topo (l'Ab H4B4 è stato sviluppato dal Dr. J. Thomas August e dal Dr. James EK Hildreth ed è stato ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank gestita dall'Università dell'Iowa , Dipartimento di Scienze Biologiche, Iowa City, IA). Sezioni ottiche singole sono state raccolte mediante microscopio laser a fluorescenza confocale Zeiss LSM510, dotato di un Plan-Apochromat 63X/1.4 (Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY) come descritto (Lechardeur et al., 2004). Le immagini sono state elaborate con il software Adobe Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA). La colocalizzazione fagosomiale di CFTR è stata misurata internalizzando anti-HA Ab complessato con IgG anti-topo di capra coniugato con TRITC per 1 ora in DMEM e inseguito per 0,5 ore, quindi i batteri FITC-PAO1 sono stati fagocitati per il tempo indicato. La colocalizzazione è stata eseguita utilizzando la funzione "Colocalizzazione" nel software Volocity 4.1.0 (software di improvvisazione Molecular Devices, Sunnyvale, CA) come descritto nei materiali supplementari.

Western Blot

Il livello di espressione di CFTR delle linee cellulari è stato determinato mediante immunoblotting utilizzando anti-HA (MMS101R, Covance) per le cellule epiteliali o anticorpi anti-CFTR (M3A7 e L12B4, Chemokine, East Orange, NJ) per i macrofagi. I lisati cellulari sono stati preparati utilizzando il tampone RIPA contenente 10 μg/ml di leupeptina, pepstatina, 100 μM di fenilmetilsulfonil fluoruro, 10 μM di MG132 e 10 mM n-etilmaleimmide e l'immunoblotting di CFTR è stato eseguito come descritto in precedenza utilizzando la chemiluminescenza potenziata (Sharma et al., 2004).

Saggio di efflusso di ioduro

La conduttanza dell'alogenuro cAMP-dipendente della membrana plasmatica delle cellule trasfettate e parentali è stata determinata con l'efflusso di ioduro come descritto (Sharma et al., 2001). Le cellule parentali hanno una quantità trascurabile o nulla di conduttanza dell'alogenuro attivato da cAMP. L'inibitore CFTR MalH2 (gentilmente fornito dal Dr. A. Verkman, University of California, San Francisco) è stato aggiunto contemporaneamente al cocktail di agonisti PKA contenente 20 μM di forskolina, 0,5 mM CPT-cAMP e 0,2 mM IBMX. La sensibilità al pH dell'efflusso di ioduro è stata determinata dopo l'incubazione delle cellule a pH 5 durante gli ultimi 10 minuti del carico di ioduro e la misurazione dell'efflusso in caricamento integrato con MES 20 mM e tampone di efflusso, rispettivamente. L'elettrodo ioduro-selettivo è stato calibrato in tampone contenente MES a pH 5.

Analisi statistica

Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte o come indicato. I dati sono medie ± SEM. La significatività è stata valutata calcolando i valori di p a due code al livello di confidenza del 95% con spaiato T test, utilizzando il software Prism (GraphPad Software, San Diego, CA).


3. Risultati

3.1 Interazioni tra residui in ATM: confronto con BTM e GLOB

Abbiamo analizzato le interazioni inter-residuo nella regione TM di 3462 eliche da 430 proteine ​​(set di dati ATM vedere Sezione 2). I conteggi assoluti per le interazioni sono disponibili nella tabella supplementare S2. I risultati sono presentati come mappe di calore che mostrano: (i) tutte le interazioni ( Fig. 1A), (ii) quelle all'interno della proteina ( Fig. 1B) o nella superficie proteica esposta ai lipidi ( Fig. 1C), (iii ) quelli di tipo inter-elica ( Fig. 1D) o intra-elica ( Fig. 1E) e (iv) interazioni che coinvolgono contatti sidechain-sidechain, sidechain-backbone o backbone-backbone ( Figure supplementari S1 e S2). La partecipazione di ciascun residuo al numero totale di interazioni inter-residuo è mostrata in Tabella 1. La distribuzione delle frequenze relative delle interazioni inter-residuo in ATM presenta un profilo eterogeneo con una notevole partecipazione di residui alifatici, seguiti da quelli aromatici e polari residui (principalmente Ser e Thr), e pochissime interazioni partecipate da residui carichi. Le coppie residuo-residuo più frequenti coinvolgono tutte le combinazioni di residui alifatici e Phe, principalmente Leu-Phe, Leu-Ile e Leu-Val. Chiaramente, le interazioni che coinvolgono residui alifatici ramificati appaiono principalmente sulla superficie della proteina, mentre le interazioni che coinvolgono Ala avvengono principalmente all'interno della proteina (Fig. 1B e C). Ci sono anche molte interazioni di residui alifatici o Phe con Ser o Thr. Al contrario, ci sono poche interazioni polare-polare, carica-carica o carica polare, nonostante il suo ruolo ben noto nel funzionamento delle proteine ​​(Muller et al., 2008) (Fig. 1H). Queste interazioni si verificano principalmente nel nucleo proteico. Le interazioni inter-elica triplicano le interazioni intra-elica e sono principalmente eseguite da interazioni sidechain-sidechain di residui idrofobici e Phe e interazioni tra la catena laterale di residui idrofobici e Phe e la spina dorsale di residui Gly e Ala (vedi Fig. 1D e Fig. supplementare). S2). Le interazioni intra-elica sono principalmente eseguite da residui Pro, Ser e Thr che interagiscono attraverso la sua catena laterale con la spina dorsale dei residui nel turno precedente e anche un contributo minore delle interazioni idrofobe e catena laterale-catena laterale Phe (vedi Fig. 1E e Fig. 1 supplementare). S2).

La distribuzione delle interazioni nel set ATM rispetto ai set BTM e GLOB. Mappe di calore della frequenza delle interazioni tra residui per coppie di residui normalizzate per il numero totale di interazioni in (UN) bancomat, (B) l'interno (ATM IN) e (C) superficie (ATM OUT) degli sportelli automatici, (D) interelicoidale (INTER) e (E) intra-elicoidale (INTRA) negli ATM (F) BTM set e (G) Set GLOB α-elicoidale. (H) Net-plot che rappresenta la percentuale di interazioni inter-residuo raggruppate per tipo di residuo: aromatico (Trp, Tyr e Phe), alifatico (Ile, Leu, Val e Ala), Gly–Pro, contenente zolfo (Met e Cys), polare ( Ser, Thr, Asn e Gln) e residui carichi (His, Arg, Lys, Glu e Asp). Le interazioni backbone-backbone non sono state considerate in questi grafici

La distribuzione delle interazioni nel set ATM rispetto ai set BTM e GLOB. Mappe di calore della frequenza delle interazioni tra residui per coppie di residui normalizzate per il numero totale di interazioni in (UN) bancomat, (B) l'interno (ATM IN) e (C) superficie (ATM OUT) degli sportelli automatici, (D) interelicoidale (INTER) e (E) intra-elicoidale (INTRA) negli ATM (F) BTM set e (G) Set GLOB α-elicoidale. (H) Net-plot che rappresenta la percentuale di interazioni inter-residuo raggruppate per tipo di residuo: aromatico (Trp, Tyr e Phe), alifatico (Ile, Leu, Val e Ala), Gly–Pro, contenente zolfo (Met e Cys), polare ( Ser, Thr, Asn e Gln) e residui carichi (His, Arg, Lys, Glu e Asp). Le interazioni backbone-backbone non sono state considerate in questi grafici

Numero di residui e partecipazione alle interazioni tra residui per ciascun residuo negli ATM

. Numero di residui. Partecipazione alle interazioni tra i residui.
Numero di residui interagenti. . Numero di interazioni.
Trp1846 (2.6%) 6801 (3.6%) Aromatico 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) Aromatico 31 650 (33.8%)
Tyr2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
Ile7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) Alifatico 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) Alifatico 62 300 (66.6%)
Leu11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
Val7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
Ala8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
Gly6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly–Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly–Pro 15 597 (16.7%)
Pro1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
Incontrato2612 (3.7%) 8689 (4.6%) contenente zolfo 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) contenente zolfo 11 190 (12.0%)
Cys1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
ser 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) Polare 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) Polare 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
Asn 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
Gln 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
Il suo 819 (1.2%) 2597 (1.4%) Addebitato 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) Addebitato 10 702 (11.4%)
Argo 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
Lys 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
colla 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
Asp 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)
. Numero di residui. Partecipazione alle interazioni tra i residui.
Numero di residui interagenti. . Numero di interazioni.
Trp1846 (2.6%) 6801 (3.6%) Aromatico 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) Aromatico 31 650 (33.8%)
Tyr2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
Ile7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) Alifatico 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) Alifatico 62 300 (66.6%)
Leu11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
Val7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
Ala8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
Gly6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly–Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly–Pro 15 597 (16.7%)
Pro1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
Incontrato2612 (3.7%) 8689 (4.6%) contenente zolfo 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) contenente zolfo 11 190 (12.0%)
Cis1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
ser 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) Polare 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) Polare 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
Asn 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
Gln 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
Il suo 819 (1.2%) 2597 (1.4%) Addebitato 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) Addebitato 10 702 (11.4%)
Argo 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
Lys 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
colla 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
Asp 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)

Conteggi assoluti e percentuali (tra parentesi) di ciascun amminoacido sulla composizione e numero di residui interagenti e interazioni nell'insieme ATM. Le percentuali del numero di residui interagenti e del numero di interazioni sono calcolate per ciascun residuo (o gruppo di residui) dividendo rispettivamente per il numero totale di residui interagenti (187 186) e per il numero totale di interazioni (93 593). Le interazioni backbone-backbone non sono considerate in questa tabella.

Numero di residui e partecipazione alle interazioni tra residui per ciascun residuo negli ATM

. Numero di residui. Partecipazione alle interazioni tra i residui.
Numero di residui interagenti. . Numero di interazioni.
Trp1846 (2.6%) 6801 (3.6%) Aromatico 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) Aromatico 31 650 (33.8%)
Tyr2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
Ile7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) Alifatico 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) Alifatico 62 300 (66.6%)
Leu11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
Val7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
Ala8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
Gly6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly–Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly–Pro 15 597 (16.7%)
Pro1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
Incontrato2612 (3.7%) 8689 (4.6%) contenente zolfo 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) contenente zolfo 11 190 (12.0%)
Cys1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
ser 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) Polare 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) Polare 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
Asn 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
Gln 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
Il suo 819 (1.2%) 2597 (1.4%) Addebitato 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) Addebitato 10 702 (11.4%)
Argo 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
Lys 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
colla 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
Asp 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)
. Numero di residui. Partecipazione alle interazioni tra i residui.
Numero di residui interagenti. . Numero di interazioni.
Trp1846 (2.6%) 6801 (3.6%) Aromatico 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) Aromatico 31 650 (33.8%)
Tyr2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
Ile7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) Alifatico 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) Alifatico 62 300 (66.6%)
Leu11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
Val7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
Ala8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
Gly6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly–Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly–Pro 15 597 (16.7%)
Pro1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
Incontrato2612 (3.7%) 8689 (4.6%) contenente zolfo 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) contenente zolfo 11 190 (12.0%)
Cys1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
ser 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) Polare 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) Polare 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
Asn 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
Gln 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
Il suo 819 (1.2%) 2597 (1.4%) Addebitato 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) Addebitato 10 702 (11.4%)
Argo 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
Lys 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
colla 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
Asp 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)

Conteggi assoluti e percentuali (tra parentesi) di ciascun amminoacido sulla composizione e numero di residui interagenti e interazioni nell'insieme ATM. Le percentuali del numero di residui interagenti e del numero di interazioni sono calcolate per ciascun residuo (o gruppo di residui) dividendo rispettivamente per il numero totale di residui interagenti (187 186) e per il numero totale di interazioni (93 593). Le interazioni backbone-backbone non sono considerate in questa tabella.

A scopo di confronto, abbiamo analizzato un insieme di 129 BTM e un insieme di 1231 fasci (19 861 eliche) di GLOB α-elicoidale (vedi Sezione 2 Tabella supplementare S2 e Figure supplementari S1 e S3). La distribuzione delle interazioni osservata per l'insieme ATM è notevolmente diversa da quella osservata per l'insieme BTM (Fig. 1F e Tabelle Supplementari S3 e S4). Quest'ultimo mostra una distribuzione più omogenea delle interazioni, con meno interazioni alifatico-alifatico e alifatico-polare e più interazioni partecipate da aromatico. Tyr rappresenta la più alta partecipazione alle interazioni tra residui. Poiché il nucleo proteico dei barili è idrofilico, le frequenze delle interazioni polare-polare, caricata polare e caricata sono maggiori. La distribuzione delle interazioni nell'insieme GLOB è notevolmente simile all'insieme ATM (si veda la Figura 1G e le Tabelle Supplementari S3 e S4). Il set GLOB presenta una frequenza simile di interazioni polari rispetto al set ATM, interazioni più cariche e meno interazioni alifatiche che coinvolgono residui diversi da Leu.

3.2 Il ruolo dei residui in ATM: confronto con BTM e GLOB

Per comprendere il ruolo di ciascun residuo nelle interazioni inter-residuo sopra descritte in MPs ( Fig. 1 e Figure supplementari S1 e S2 ) è importante conoscere la preferenza di ciascun residuo (o gruppi di residui) per localizzazioni specifiche all'interno del fascio : per l'interno proteico o per la superficie, e per le regioni di membrana profonde o per le regioni interfacciali. A questo scopo abbiamo analizzato la frequenza e la distribuzione di ciascun amminoacido considerando la proteina complessiva (ALL) e i residui localizzati nel nucleo proteico (IN) o nella superficie proteica esposta ai lipidi (OUT) (vedi Fig. 2A e Supplementi Tabella S5). Abbiamo anche esaminato la distribuzione dei residui lungo un profilo di membrana (vedi Fig. 2D e Fig. S4 supplementare). Questi dati mostrano che molti residui mostrano una marcata preferenza per essere localizzati all'interno della proteina o di fronte al doppio strato lipidico e per trovarsi al centro dei segmenti TM o ad una o entrambe le estremità (extracellulare e citoplasmatica). Le frequenze di ciascun residuo e dei gruppi di residui e la partecipazione al numero complessivo di interazioni sono mostrate nella Tabella 1. χ Sono stati eseguiti 2 test di bontà di adattamento (vedi Sezione 2) per determinare se le interazioni tra residui osservate nell'ATM set (Fig. 1) sono statisticamente sovrarappresentati o sottorappresentati (Fig. S5 supplementare) rispetto a quanto ci si aspetterebbe assumendo interazioni casuali basate sulla composizione osservata (frequenze di amminoacidi nella Tabella 1 e nella Tabella supplementare S5). La stessa analisi è stata condotta, a fini comparativi, negli insiemi BTM e GLOB (Fig. 2F e G, Tabella Supplementare S5 e Fig. Supplementare S6).

Composizione, distribuzione e localizzazione preferita di ciascun amminoacido. La distribuzione delle frequenze degli amminoacidi (in alto) e dei gruppi di residui (in basso si veda la Fig. 1 per la definizione dei gruppi di residui) nell'ATM (UN), BTM (B) e GLOB (C) set di dati. Viene anche mostrato il contributo dei residui all'interno della proteina (IN) o nella superficie della proteina (OUT). * indica differenze statistiche (P < 0.05) tra le frequenze IN e OUT in un test di bontà di adattamento χ2 con correzioni di Bonferroni. (D) Loghi di sequenza per la composizione del residuo lungo le eliche TM del set di dati ATM. Immagine generata con WebLogo (Crooks et al., 2004). Per ogni elica, il centro della membrana (impostato a 0 ) si basa sull'orientamento delle proteine ​​nelle membrane ( Lomize et al., 2012). La membrana va approssimativamente tra −15 (intracellulare) e + 15 (extracellulare)

Composizione, distribuzione e localizzazione preferita di ciascun amminoacido. La distribuzione delle frequenze degli amminoacidi (in alto) e dei gruppi di residui (in basso si veda la Fig. 1 per la definizione dei gruppi di residui) nell'ATM (UN), BTM (B) e GLOB (C) set di dati. Viene anche mostrato il contributo dei residui all'interno della proteina (IN) o nella superficie della proteina (OUT). * indica differenze statistiche (P < 0.05) tra le frequenze IN e OUT in un test di bontà di adattamento χ2 con correzioni di Bonferroni. (D) Loghi di sequenza per la composizione del residuo lungo le eliche TM del dataset ATM. Immagine generata con WebLogo (Crooks et al., 2004). Per ogni elica, il centro della membrana (impostato a 0 ) si basa sull'orientamento delle proteine ​​nelle membrane ( Lomize et al., 2012). La membrana va approssimativamente tra −15 (intracellulare) e + 15 (extracellulare)

3.2.1 Residui alifatici

I residui alifatici sono i più comuni nelle eliche TM. Rappresentano la metà del numero totale di residui e partecipano a due terzi delle interazioni tra residui nelle eliche TM. Sono ubiquitariamente distribuiti lungo il segmento della membrana idrofoba, sebbene con un massimo al centro del doppio strato. Leu è di gran lunga il residuo stellare e ha la maggiore frequenza (16%) e la maggiore partecipazione alle interazioni tra residui (28%). Alla superficie della proteina, Leu, Ile e Val sono i residui più frequenti, indicando che la membrana preferisce interagire con i residui ramificati. Questi residui interagiscono con altri Leu, Ile, Val (in particolare nelle interazioni Leu-Val, Leu-Leu e Leu-Ile), nonché con residui di Phe e Ala situati sulla superficie della proteina. Queste interazioni sono sovrarappresentate in base alle frequenze dei singoli residui. Nel nucleo proteico, Ala è il residuo alifatico più frequente, seguito da Leu, e di conseguenza sono coinvolti nella maggior parte delle interazioni inter-residuo, principalmente con altri residui alifatici (Leu, Ala, Val e Ile) e Phe attraverso interazioni elicoidali sidechain-sidechain. Ala presenta anche un ruolo importante nelle interazioni intereliche poiché la sua piccola catena laterale può allocare catene laterali idrofobe e polari vicino alla sua spina dorsale. Pertanto, i residui alifatici presentano un ruolo importante nell'impaccamento dell'elica.

In BTM, i residui alifatici sono esposti al doppio strato lipidico, partecipando al 40% di tutte le interazioni, attraverso interazioni alifatico-alifatiche e alifatico-aromatiche. La presenza di residui alifatici nel nucleo di BTM è rara in quanto le molecole d'acqua possono accedere al nucleo proteico. In GLOB, i residui alifatici partecipano al 60% delle interazioni, principalmente attraverso interazioni alifatico-alifatiche. Il nucleo delle proteine ​​GLOB è altamente ricco di residui alifatici, specialmente in residui di Leu e Ala. Sebbene Leu e Ala abbiano frequenze simili, Leu partecipa a un terzo di tutte le interazioni, mentre Ala contribuisce poco.

3.2.2 Residui aromatici

I residui aromatici rappresentano il 15% di tutti i residui nelle eliche TM e partecipano a quasi il 36% delle interazioni. Nonostante sia noto che le interazioni aromatico-aromatiche contribuiscono a una parte significativa delle forze stabilizzanti nelle proteine ​​(Goyal et al., 2017), il numero di interazioni di questo tipo è scarso (circa il 4%). Al contrario, i residui aromatici interagiscono principalmente con i residui alifatici. Phe è il secondo residuo più frequente sulle eliche TM e di gran lunga il residuo aromatico più frequente. I residui di Phe sono ugualmente presenti in superficie o nel nucleo proteico. Presentano una distribuzione relativamente piatta lungo il segmento TM, sebbene con un picco all'estremità extracellulare. Phe interagisce principalmente con Leu in superficie e con residui alifatici in generale nel nucleo proteico. Infatti, Phe-Leu è l'interazione inter-residuo più frequente nelle eliche TM, dove ha un ruolo importante nell'impacchettare le eliche attraverso interazioni intereliche sidechain-sidechain.I residui di Tyr e Trp hanno frequenze piccole e hanno una marcata preferenza per le estremità TM, in accordo con il loro ruolo nell'interazione con i gruppi di testa lipidici ( Baker et al., 2017 Muller et al., 2008 von Heijne, 1992) e con residui polari nell'interfaccia extracellulare e intracellulare. Mentre i residui di Tyr preferiscono il nucleo proteico, i residui di Trp appaiono ugualmente sepolti all'interno della proteina o in superficie. Tyr e Trp partecipano a poche interazioni tra residui, principalmente con Leu. Tuttavia, queste interazioni sono sovrarappresentate rispetto alle interazioni attese dalle singole frequenze degli amminoacidi.

I residui aromatici rappresentano il 40% delle interazioni totali in BTM, principalmente attraverso Tyr e Trp, affrontando il doppio strato lipidico e svolgendo interazioni aromatico-aromatico e alifatico-aromatico. Tyr esegue un numero significativo di interazioni, principalmente con residui polari e carichi nel nucleo proteico e con residui alifatici e altri aromatici nella superficie della proteina. I pochi residui aromatici trovati in GLOB si trovano principalmente al centro della proteina.

3.2.3 Residui polari

I residui polari rappresentano il 14% del numero totale di residui nei segmenti TM e partecipano al 30% delle interazioni, coinvolgendo principalmente Ser e Thr. Hanno una chiara preferenza per il nucleo proteico e sono diffusi ubiquitariamente lungo l'elica TM. La maggior parte delle interazioni si verificano tra la catena laterale di Ser e Thr e il carbonile principale del residuo nel turno precedente inducendo distorsioni ( Ballesteros et al., 2000). Pertanto, Ser e Thr hanno un ruolo importante nelle interazioni intra-elica. Poche interazioni intereliche si formano anche tra il gruppo metilene della catena laterale Thr e residui idrofobici o attraverso legami idrogeno deboli C-H···O-H tra i gruppi ossidrile e residui idrofobici ( Desiraju, 2005). Sebbene le interazioni polare-polare abbiano un ruolo importante nella funzione delle proteine ​​(Muller et al., 2008), ci sono relativamente poche di tali interazioni nelle eliche TM. Gln e Asn mostrano piccole frequenze e quindi partecipano a un numero marginale di interazioni inter-residuo. Preferiscono l'esterno della proteina, vicino ai gruppi di testa lipidici.

BTM presenta la più alta percentuale di residui polari (circa il 20%) rispetto ad ATM e GLOB. I residui polari interagiscono con tutti i tipi di residui e si trovano principalmente all'interno della proteina, dove possono interagire con le molecole d'acqua. Sebbene i residui polari siano frequenti in GLOB, contribuiscono poco alle interazioni, poiché questi residui si trovano sulla superficie della proteina e interagiscono principalmente con le molecole d'acqua.

3.2.4 Gly e Pro

Gly e Pro sono ben noti distorsori o interruttori dell'elica. Gly preferisce essere all'interno della proteina - infatti è il secondo residuo più frequente nel nucleo proteico - e nella parte centrale delle eliche TM. La mancanza di sidechain permette di allocare le sidechain di ingombranti residui idrofobici vicini alla sua spina dorsale ( Eilers et al., 2002). Le catene laterali vicine formano deboli interazioni C-H···O = C con la spina dorsale di Gly. Pertanto, Gly ha un ruolo importante nelle interazioni intereliche backbone-sidechain. Pro è presente lungo l'elica TM, sebbene con preferenza per la regione extracellulare. Pro interagisce principalmente con Leu, sia nel nucleo proteico che nella superficie proteica. Le interazioni pro-alifatiche sono sovrarappresentate considerando le frequenze dei residui nelle eliche TM. Pro ha un ruolo importante nelle interazioni intra-elica, poiché la sua catena laterale interagisce con la spina dorsale del turno precedente, come residui Ser e Thr. Così, oltre al suo ruolo di rompi-elica o di induttore di distorsione dell'elica (Cordes et al., 2002), Pro contribuisce a stabilizzare i fasci TM attraverso interazioni intra-elica.

In BTM, Pro contribuisce in pochissime interazioni, mentre Gly partecipa a un numero significativo di interazioni con residui idrofobici e aromatici attraverso la sua spina dorsale. In GLOB, sia Pro che Gly hanno frequenze piccole e quindi poca partecipazione alle interazioni.

3.2.5 Cys e Met

I residui contenenti zolfo Cys e Met mostrano basse frequenze (specialmente Cys) nelle eliche TM e preferiscono il nucleo proteico e il centro delle eliche TM (vedi Fig. 2). I residui Cys interagiscono principalmente con residui alifatici, Met e Phe. Ciò è compatibile con il fatto che i residui contenenti zolfo formano forti interazioni con amminoacidi alifatici e aromatici ( Cordomi et al., 2013 Gómez-Tamayo et al., 2016). La maggior parte delle distanze di interazione Cys-Cys sono compatibili con l'essere interazioni non legate piuttosto che legami disolfuro. Met mostra un importante contributo alle interazioni complessive inter-residuo nonostante la sua bassa frequenza. Infatti, le interazioni che coinvolgono Met sono sovrarappresentate rispetto alle interazioni attese dalle frequenze dei singoli amminoacidi.

Cys e Met sono ancora più scarsi in BTM e GLOB e contribuiscono con poche interazioni. Non hanno alcuna preferenza per essere IN o OUT.

3.2.6 Residui carichi

Il gruppo di residui presumibilmente carichi (His, Lys, Arg, Glu e Asp) ha le frequenze più piccole nei segmenti TM - sommano solo il 6% - e partecipa a un numero limitato di interazioni tra residui (circa l'11%). Si trovano vicino alle estremità dei segmenti TM. Arg e Lys affrontano prevalentemente la parte citoplasmatica, seguendo la "regola interna positiva" ( Baker et al., 2017 Muller et al., 2008 von Heijne, 1992). Nonostante la bassa partecipazione alle interazioni inter-residuo, le poche interazioni cariche sono sovrarappresentate rispetto alle interazioni attese dalle singole frequenze degli amminoacidi coerenti con il loro ruolo previsto nella funzione proteica (Muller et al., 2008).

I residui carichi sono pochi in BTM, si trovano principalmente nel nucleo proteico dove interagiscono con i residui carichi e polari. Al contrario, rappresentano il 40% dei residui sulla superficie di GLOB, dove questi residui possono interagire con l'ambiente idrofilo e con altri residui carichi.


Sottoclassificazione funzionale delle classi di proteine ​​transmembrana

Dopo che le proteine ​​di membrana sono state identificate e separate dalle proteine ​​solubili utilizzando i programmi di previsione della topologia descritti sopra, il secondo livello di classificazione nella Figura 1 prevede il raggruppamento della popolazione delle proteine ​​di membrana in singole classi funzionali e l'identificazione prospettica della funzione dei geni caratterizzati. Sono stati segnalati diversi metodi per svolgere questo compito, che sono riassunti nella Tabella 3 e schematicamente visualizzati nella Figura 2.

Come con molti algoritmi di predizione della topologia, questi metodi spesso richiedono che la sequenza di amminoacidi venga riassunta in modo quantitativo per confrontare due proteine. Uno di questi descrittori che è stato utilizzato con successo è la frazione della sequenza di una proteina composta da ciascuno dei venti amminoacidi naturali, un vettore di lunghezza venti che somma a uno ed è chiamato 'composizione amminoacidica' 56,57. L'intuizione alla base di questo descrittore è che classi distinte di proteine ​​di membrana hanno la tendenza a includere particolari amminoacidi con maggiore frequenza a causa dei requisiti strutturali o dei vincoli per la loro funzione. Sono stati proposti anche perfezionamenti del descrittore della composizione amminoacidica, come l'utilizzo del conteggio non normalizzato dei venti amminoacidi in una sequenza proteica, un metodo ritenuto più efficace in quanto cattura anche le differenze nella lunghezza caratteristica di una famiglia proteica 58. Allo stesso modo, l'espansione della composizione amminoacidica normalizzata a un vettore di lunghezza sessanta-20 per la composizione dell'intera proteina e venti elementi ciascuno per la composizione amminoacidica dei segmenti transmembrana e non transmembrana ha consentito anche una migliore discriminazione 59 . Come la composizione amminoacidica, anche le frequenze dipeptidiche sono state utilizzate con successo come descrittori per discriminare le proteine ​​di membrana di classi diverse 56,57,60. Il PSSM precedentemente menzionato derivato da Position-Specific Iterative BLAST (PSI BLAST), che misura la probabilità di una sostituzione dall'amminoacido osservato a un amminoacido alternativo in una particolare posizione in base a modelli di sostituzione tra una proteina e i suoi vicini omologhi, sono stati anche risulta avere un'elevata sensibilità come descrittore 61 . In modo più astratto, nei modelli predittivi sono stati impiegati anche descrittori numerici dell'energia di piegatura 61 .

Proprio come i descrittori di input per questi algoritmi sono vari, così sono i tipi di previsioni funzionali prodotte in questi studi. Sono stati utilizzati diversi metodi per prevedere l'appartenenza alla famiglia di un gene query, come la classificazione reciproca di canali, trasportatori e portatori 58 . Più in dettaglio, questi metodi sono stati utilizzati anche per prevedere il substrato di una proteina, come diversi ioni metallici per i canali o proteine/acidi nucleici per i trasportatori62. Le previsioni sono state anche mirate a parametri funzionali specifici per particolari classi di proteine ​​di membrana. Ad esempio, la sequenza di amminoacidi è stata utilizzata per prevedere il potenziale di attivazione semimassimo dei canali voltaggio dipendenti 63 , discriminare tra i canali in base ai loro parametri elettrofisiologici 64 o identificare canali che possono servire come bersagli terapeutici promettenti 65 .

Questi metodi descritti in precedenza, in sostanza, si basano sulla vicinanza di una proteina query a un intorno di proteine ​​note nello spazio del descrittore utilizzato. Sono stati proposti ulteriori perfezionamenti, in cui questa misurazione di prossimità può essere combinata con altre caratteristiche come i termini di Gene Ontology che descrivono i processi biologici, le funzioni molecolari, la localizzazione subcellulare di una proteina66, la presenza di domini di famiglie di proteine ​​associate alla classe (Pfam)67, o il numero di domini transmembrana previsti 68 . La combinazione risultante di informazioni di sequenza annotate e grezze può quindi essere utilizzata in un algoritmo di previsione come l'SVM 68 precedentemente discusso. In effetti, la capacità dei profili amminoacidici di servire come caratteristiche rilevanti per identificare proteine ​​funzionalmente correlate può suggerire che le famiglie condividano motivi specifici e che frammenti e motivi strutturali specifici sono stati identificati anche in studi correlati 69,70.

Espandendo queste previsioni basate su strutture bidimensionali correlate a classificazioni o parametri funzionali, sono stati sviluppati anche metodi per inferire direttamente la funzione basata su una conformazione tridimensionale. Ad esempio, il programma SLITHER utilizza simulazioni di modelli molecolari per prevedere se una presunta molecola di substrato può permeare le cavità oi canali in una struttura proteica 71 . Nei casi in cui l'esistenza di un canale in una proteina non è verificata, il programma MolAxis può essere utilizzato per prevedere se esistono utilizzando la geometria computazionale 72. Ovviamente, entrambe queste metodologie richiedono coordinate proteiche tridimensionali che sono sperimentalmente non disponibili per la maggior parte dei canali o altre proteine ​​di membrana, ma potrebbero essere combinate con previsioni di strutture tridimensionali basate sull'omologia descritte nella sezione precedente per generare previsioni funzionali per strutture tridimensionali dedotte .

Una previsione funzionale correlata consiste nell'identificare il ligando naturale, il substrato ionico o il partner di interazione proteica delle nuove proteine. Infatti, esempi che evidenziano la sfida di deorfanizzare un gran numero di sette recettori proteici transmembrana, dove il/i partner naturale/i di legame di alcuni recettori transmembrana altrimenti ben caratterizzati come BRS-3 rimane sconosciuto 73 . Sebbene non specificamente sviluppato per identificare le interazioni peptide-recettore in silicone, le previsioni su larga scala delle interazioni proteina-proteina sono state descritte utilizzando informazioni bidimensionali e tridimensionali 74,75,76. In teoria, tali algoritmi potrebbero essere impiegati per identificare nuove interazioni tra ligandi peptidici e il sottoinsieme di recettori che legano i peptidi. L'identificazione bioinformatica diretta di ligandi come i precursori di neuropeptidi ha anche beneficiato della maggiore disponibilità di dati proteomici e nucleotidici dell'intero genoma, come dimostrato dalla previsione computazionale di oltre 200 nuovi neuropeptidi nell'ape. Apis mellifera, di cui 100 validati mediante peptidomica 77 . Studi correlati sullo scarabeo della farina rossa Tribolium castaneum hanno impiegato l'analisi dell'omologia per convalidare 30/41 geni neuropeptidi previsti utilizzando dati di spettrometria di massa, che codificano 71 peptidi 78 . Data l'accuratezza delle previsioni in questi studi che utilizzano grandi set di dati genomici, ipotizziamo che tali metodi e informazioni forniscano un promettente pool di potenziali nuovi ligandi che potrebbero essere sottoposti a screening in saggi funzionali contro presunti recettori che legano i peptidi.


Il ruolo di altri fattori proteici

Le interazioni tra i domini TM non possono spiegare come due proteine ​​che hanno strutture primarie identiche e utilizzano lo stesso meccanismo di traslocazione di base possano essere sintetizzate in due diversi orientamenti. Diverse proteine, tra cui la proteina prionica (PrP), la dutina, la proteina proteolipidica mielinica (PLP) e il regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) esistono in molteplici forme topologiche (Lopez et al.,1990 Dunlop et al.,1995 Hegde et al. .,1998b Wahle e Stoffel,1998). Sebbene una catena nascente possa accedere a uno dei tanti imbuti pieghevoli disponibili, studi di PrP hanno dimostrato che questa distribuzione può essere alterata sia in cis che in trans.

Le interazioni interproteiche possono svolgere un ruolo sia nell'integrazione del dominio TM che nel riconoscimento STE. La PrP può essere sintetizzata in tre diverse forme topologiche: Ntm PrP, una proteina di membrana di tipo I in cui l'N-terminale è nel lume Ctm PrP, una proteina di membrana di tipo II in cui il C-terminale è nel lume e una forma secretoria denominato sec PrP. In vitro, in assenza di attività del fattore accessorio di traslocazione (TrAF), la PrP è prodotta esclusivamente come forma Ctm PrP (Hegde et al., 1998b), che provoca neurodegenerazione nei topi e nell'uomo quando sintetizzata in vivo (Hegde et al., 1998a). Poco si sa di TrAF, ma forse regola come o quando altri fattori, come TRAM, interagiscono con PrP e probabilmente con molte altre proteine. I primi studi hanno suggerito che gli eventi di riconoscimento mediati dal recettore si verificano durante l'inizio e l'arresto della traslocazione (Mize et al., 1986), il che è coerente con la successiva identificazione di STE (Yost et al., 1990). Recentemente, studi di reticolazione di una sequenza STE IgM hanno identificato due proteine ​​di membrana coinvolte nel riconoscimento o nella funzione di STE (Falcone et al., 1999). La caratterizzazione di questi recettori STE sarà uno dei prossimi passi verso la comprensione di come viene regolata l'integrazione.

Anche l'attività di accompagnamento sembra avere un ruolo nell'integrazione. Si propone che almeno un fattore proteico nella membrana ER sia responsabile della corretta biosintesi della connessina, componente della giunzione gap. La sintesi in vitro o la sovraespressione in vivo della connessina determina la produzione di molecole scisse in modo anomalo perché la peptidasi di segnale scambia il primo dominio TM per un peptide di segnale. Si ritiene che la scissione in vivo del dominio TM sia impedita da un chaperone non identificato nella membrana, che riconosce la catena nascente e blocca l'accesso della peptidasi di segnale. In vitro questo chaperone può essere assente o non funzionante (Falk e Gilula, 1998).

La modifica co-traslocativa delle catene nascenti può anche influenzare la biosintesi. L'oligosaccaril transferasi (OST) si associa alle catene nascenti del traslocone e dei glicosilati quando emergono nel pronto soccorso. Per esaminare i possibili effetti della glicosilazione sull'orientamento del dominio TM, Goder et al. (Goder et al., 1999) hanno creato una proteina chimerica che può essere sintetizzata in una delle due forme topologiche. Quando hanno progettato i siti di glicosilazione, hanno scoperto che il riorientamento di un dominio transmembrana nel translocone era impedito dalla glicosilazione dell'anello TM lumenale. Questi risultati suggeriscono che la regolazione della glicosilazione delle proteine ​​native può controllare il ripiegamento e l'orientamento delle proteine ​​in base alle esigenze della cellula.

Le interazioni interproteiche sopra descritte probabilmente influenzano la biosintesi di molte differenti proteine ​​di membrana. Anche le interazioni interproteiche substrato-specifiche influenzano la biosintesi. Nella membrana, come nel citosol, le proteine ​​si associano per formare complessi funzionali. Studi sulla Na + /K + -ATPasi di tipo P hanno rivelato che il corretto inserimento della subunità politopica α settima e ottava domini TM richiede l'associazione della subunità β bitopica con il ciclo extra-citosolico tra i due domini TM (Beguin et al. ., 1998). Quando la subunità incontra la regione corretta della subunità α, sembra indurre un cambiamento conformazionale che promuove il corretto ripiegamento e integrazione dei domini TM. Interazioni trans specifiche che facilitano la corretta formazione di complessi proteici di membrana potrebbero impedire alla catena nascente di creare associazioni indesiderabili o dannose con se stessa o con altre proteine.

Stiamo cominciando a capire di più sulle proteine ​​che influenzano la biosintesi delle proteine ​​di membrana, ma c'è ancora molto da imparare. La caratterizzazione sia dei TrAF che dei recettori STE migliorerà la nostra comprensione del meccanismo di integrazione del dominio di membrana, così come ulteriori esempi di interazioni substrato-specifiche. L'identificazione della chaperone coinvolta nella biosintesi della connessina ci consentirà di apprendere come funzionano le chaperone di membrana. Infine, la scoperta di proteine ​​che utilizzano la glicosilazione per controllare l'orientamento in vivo chiarirà altri modi in cui la biosintesi può essere regolata.


Ci stiamo perdendo lo stato oligomerico dinamico? Come studiare un dimero simmetrico e flessibile?

Ottenere il controllo di un dimero debole

Il basso numero di strutture TMD omodimeriche attualmente disponibili da SPTMR è probabilmente un riflesso delle sfide associate agli studi strutturali di questi dimeri simmetrici e flessibili. Un'elevata flessibilità conformazionale e una modesta affinità degli omodimeri TMD sono presumibilmente un prerequisito per la loro capacità prevista di passare da una conformazione all'altra, queste proprietà tuttavia sfidano chiaramente anche gli studi strutturali dei dimeri SPTMR-TMD. Come discusso, la qualità complessiva delle strutture disponibili appare limitata e, inoltre, lo stato oligomerico della proteina non è sempre chiaramente definito. Lo stato omodimerico della maggior parte dei TMD è stato principalmente confermato nelle condizioni applicate mediante l'acquisizione di NOE intereliche [15, 23, 58-63, 65, 66, 69, 71, 72] , talvolta in combinazione con esperimenti di reticolazione [ 64] o con il rilevamento di variazioni dimensionali stimate dai tassi di rilassamento della spina dorsale [61, 62, 69] o dall'ultracentrifugazione [70]. I NOE interelici ottenuti in esperimenti basati su filtri dovrebbero preferibilmente essere confrontati con gli spettri di riferimento di fondo della proteina in assenza di proteina non etichettata per evitare un'interpretazione errata di forti picchi intramolecolari che fuoriescono attraverso il filtro a causa dell'imperfetta etichettatura degli isotopi [50], ma raramente è chiaro se questi sono stati acquisiti. Negli studi strutturali dei TMD monomerici, inoltre, non è sempre dimostrato che il TMD sia effettivamente monomerico nelle condizioni applicate.Questa mancanza di valutazione dello stato oligomerico è probabilmente il risultato delle complicazioni introdotte dal loro inserimento nei mimetici di membrana, che rende le classiche stime dimensionali dipendenti da due incognite (l'entità dell'oligomerizzazione della proteina e la dimensione dei mimetici di membrana). Il rilevamento di NOE intereliche è, se usato correttamente, una misura affidabile di una popolazione significativa di dimero. Tuttavia, i NOE interspecie sono misurazioni pesanti in termini di risorse che non sono adatte per valutare grandi insiemi di condizioni e non sono facilmente, se possibile, acquisite su proteine ​​che interagiscono in modo transitorio [120]. Inoltre, non sono appropriati per confermare l'assenza di oligomerizzazione per studi dello stato monomerico. Una possibile strategia è l'utilizzo di tag paramagnetici [48], la cui implementazione può tuttavia richiedere una conoscenza preliminare del sito di dimerizzazione, la generazione di una serie di mutanti, nonché ulteriori sfide tecniche associate all'uso di etichette idrofobiche nel contesto di un ambiente che imita la membrana. Pertanto, lo sviluppo di metodi ad alto rendimento per la determinazione affidabile dello stato oligomerico di TMD micellati in un ampio insieme di condizioni NMR-adatte è essenziale per lo sviluppo del campo. Un vantaggio promettente è il recente sviluppo della spettrometria di massa nativa sulle proteine ​​di membrana, che consente l'acquisizione di spettri su complessi proteici di membrana intatti incorporati nelle micelle [125]. Questi metodi, tuttavia, non sono ancora sufficientemente quantitativi per determinare l'entità dell'oligomerizzazione.

Una sfida particolare è quella di stabilizzare gli oligomeri delle proteine ​​di membrana in mimetici di membrana non nativi. Sta diventando sempre più chiaro che il doppio strato lipidico può partecipare alle associazioni TMD attraverso effetti indipendenti dalla sequenza come lo spessore e la carica della membrana [126, 127]. Inoltre, è stato suggerito che gli effetti dipendenti dalla sequenza che mediano il legame specifico dei lipidi alle eliche TMD svolgano ruoli importanti nella regolazione dell'equilibrio monomero-dimero, sia contrastando che migliorando la dimerizzazione [128]. Questi effetti non sono naturalmente ben simulati nei mimetici di membrana che consentono studi strutturali mediante spettroscopia NMR allo stato di soluzione, destabilizzando ulteriormente gli omodimeri TMD. Diversi studi hanno riportato che l'equilibrio monomero-dimero per alcuni TMD può essere manipolato, e quindi studiato, attraverso cambiamenti nel rapporto detergente-proteina (DP) o lipide-proteina (LP), come riportato per la prima volta da Fisher. et al. [129] sul GpA-TMD. Questo è essenzialmente analogo al comune approccio di diluire un complesso proteico con lo scopo di spingere l'equilibrio verso la conformazione del monomero per consentire la determinazione della sua costante di dissociazione. Oltre a GpA, sono state riportate transizioni monomero-dimero a seguito di cambiamenti nel rapporto DP per molti dei TMD di cui sono state segnalate strutture, ad esempio gli omodimeri di FGFR3, VEGFR, ErbB1-4, APP e TLR3 [23, 59-63, 69, 71, 130] .

La spettroscopia NMR a stato di soluzione è un potente strumento per studiare le transizioni monomero-dimero come conseguenza di cambiamenti nel rapporto DP, ad es. , oltre a fornire informazioni strutturali. Anche nei casi in cui si verificano contemporaneamente più stati oligomerici, i dati possono essere estratti e assegnati a ciascuno stato in determinate condizioni. Sono state sviluppate metodologie per l'utilizzo della spettroscopia NMR allo stato di soluzione per lo studio dell'oligomerizzazione TMD basata sulla manipolazione del rapporto DP o LP [130, 131] tuttavia, un metodo ad alta produttività per confermare che i cambiamenti di spostamento chimico osservati derivano da cambiamenti negli stati oligomerici è ancora desiderabile. Il principale svantaggio è inoltre che le concentrazioni di detersivo applicabili per gli studi NMR hanno limiti sia superiore che inferiore. Il limite superiore è causato da un aumento della viscosità del campione, e quindi da un rallentamento del tumbling molecolare, che porta all'allargamento della linea [132], con l'esatto limite di concentrazione dipendente dalla natura del detergente e dalle condizioni sperimentali. Il limite inferiore sorge perché è difficile analizzare correttamente i dati ottenuti con concentrazioni di detersivo inferiori alla concentrazione micella critica (CMC) del detersivo, poiché la natura delle micelle proteiche/detergenti in queste condizioni è poco conosciuta. Di conseguenza, sono interpretabili solo i sistemi che subiscono transizioni complete monomero-dimero all'interno della gamma di detergenti applicabile. Inoltre, con l'eccezione di APP-TMD nelle micelle LMPG [130], la maggior parte dei sistemi detergenti TMD studiati finora mostra uno scambio lento sulla scala temporale NMR della transizione monomero-dimero. Di conseguenza, mancano ancora le metodologie NMR per lo studio quantitativo dei sistemi in scambio veloce.

Studi NMR soluzione-stato della transizione monomero-dimero TMD

Determinare la cinetica delle transizioni monomero-dimero nel solvente detergente è un caso piuttosto complesso, in cui fattori imposti dal sistema solvente, come la CMC, le proprietà e la partecipazione del detergente, nonché le collisioni micellari sono possibili contributori al comportamento osservato . Diversi modelli sono stati proposti per aiutare la derivazione di formalismi per descrivere l'oligomerizzazione di TMD a passaggio singolo in tali sistemi: il modello a solvente continuo [133, 134], il modello a rilascio di detergente [129, 134] e il modello a solvente micellare [131] . In sostanza, il modello a solvente continuo presuppone che il detergente agisca come solvente nel processo di dimerizzazione, cioè che la dimerizzazione in solvente micellare si comporti in modo simile alla dimerizzazione in acqua o in un doppio strato lipidico. Tale ipotesi è principalmente applicabile quando la transizione monomero-dimero avviene all'interno della stessa micella (ad esempio, a basso rapporto DP). Nel modello di rilascio del detergente, il detergente non viene trattato come un solvente ma piuttosto come un partecipante al processo di dimerizzazione, una descrizione che si è trovata meglio applicabile a un rapporto DP elevato e a dimeri relativamente forti. Infine, il modello del solvente micellare si basa sul presupposto che la dimerizzazione e la dissociazione si verificano solo in caso di collisione e decadimento delle micelle, rispettivamente. Il formalismo associato si applica solo quando le collisioni tra micelle sono frequenti e i tassi di dissociazione del dimero sono lenti sulla scala temporale NMR e le transizioni all'interno di una singola micella diventano quindi trascurabili. Una descrizione dettagliata di tutti i modelli e formalismi per descrivere l'equilibrio si trova nel Rif. [131] . Il fatto che nessun singolo formalismo o modello sia in grado di descrivere tutte le transizioni monomero-dimero evidenzia la loro complessità, e molto resta da capire. L'omodimerizzazione dell'APP-TMD è stata ad esempio studiata sia nelle micelle DPC [71] che nelle micelle LMPG [130], dove il monomero-dimero è in lento scambio sulla scala temporale NMR in DPC, ma in rapido scambio in LMPG. Cioè, la transizione monomero-dimero dell'APP-TMD si adatta al modello di rilascio del detergente e al modello di solvente continuo, a seconda del detergente piuttosto che della natura intrinseca dell'associazione TMD. Ciò è in linea con l'osservazione che l'entità della costante di dissociazione del dimero dipende dal detergente applicato [129, 134], e quindi può essere sollevata la questione della rilevanza biologica di tali stime della cinetica di equilibrio. Anche quando queste misurazioni sono condotte nei doppi strati lipidici, la forza delle associazioni varia considerevolmente con la composizione della membrana [126, 127], uno scenario che potrebbe riflettere la rilevanza biologica. Si può sostenere, come suggerito da Mineev et al. [131], che queste stime possono essere utilizzate per confrontare la forza della formazione di dimeri di TMD misurata nello stesso ambiente che imita la membrana. Tuttavia, come accennato, diversi detergenti e lipidi non influenzano in modo simile la struttura, la stabilità e la funzionalità delle proteine ​​di membrana e questa interazione non è attualmente ben compresa. La domanda è quindi se lo stesso ambiente mimetico di membrana influisca in modo diverso anche sui diversi equilibri monomero-dimero TMD e la cinetica di equilibrio misurata diventa quindi un'equazione con troppe incognite per fornire risultati biologicamente significativi. Va notato che la maggior parte di questi studi sono stati condotti solo sul GpA-TMD, che è generalmente considerato un omodimero molto stabile [135], presumibilmente anche più tollerante al variare delle condizioni.

In termini di conoscenza strutturale della risoluzione atomica sulla transizione monomero-dimero, solo i TMD di ErbB1, ErbB2 e APP sono rappresentati da strutture sia di un monomero che di un omodimero, e nel caso di ErbB2, il monomero e il dimero non hanno origine da la stessa specie. Inoltre, come discusso, esiste una controversia sulle strutture dell'ErbB1-TMD, mentre le caratteristiche dell'APP-TMD non sono chiare a causa delle molteplici strutture che rappresentano l'APP-TMD monomerico e dimerico. Di conseguenza, sono disponibili poche conoscenze dirette sui dettagli della trasformazione strutturale dei TMD al momento della transizione da monomero a dimero. La manciata di TMD monomerici elicoidali, tuttavia, dimostra chiaramente che la formazione della struttura secondaria è disaccoppiata dall'oligomerizzazione. Va tuttavia notato che l'α-elica di ErbB1-TMD è stata trovata estesa dopo l'omodimerizzazione [62].


Tensegrità cellulare

La tensegrità è un principio costruttivo che è stato descritto per la prima volta dall'architetto R. Buckminster Fuller (Fuller,1961) e visualizzato per la prima volta dallo scultore Kenneth Snelson (Snelson, 1996). Fuller definisce i sistemi di tensegrità come strutture che stabilizzano la loro forma mediante tensione continua o "integrità tensionale" piuttosto che mediante compressione continua (ad esempio come utilizzato in un arco di pietra). Questo è chiaramente visibile nelle sculture Snelson, che sono composte da barre di acciaio inossidabile isolate che sono tenute in posizione e sospese nello spazio da cavi ad alta tensione (Fig. 1A). La sorprendente semplicità di queste sculture ha portato a una descrizione dell'architettura tensegrile come una rete tesa di elementi strutturali che resiste alla distorsione della forma e si autostabilizza incorporando altri elementi di supporto che resistono alla compressione. Queste sculture e strutture simili composte da montanti in legno e corde elastiche (Fig. 1B) illustrano magnificamente l'equilibrio delle forze sottostante, che si basa sulla compressione locale e sulla tensione continua (Fig. 2A) che è responsabile della loro stabilità. Tuttavia, non sono richiesti elementi rigidi, perché strutture simili possono essere costruite da molle flessibili che differiscono semplicemente per la loro elasticità (Fig. 1C).

Strutture tensegrità. (A) Tripla corona, una scultura tensegrità, dell'artista Kenneth Snelson, composta da barre di acciaio inossidabile e cavi di tensione. Nota che questa struttura è composta da più moduli di tensegrità che sono interconnessi da regole simili. (B) Una sfera tensegrità composta da sei montanti in legno e 24 corde elastiche bianche, che imita il modo in cui una cellula cambia forma quando aderisce a un substrato (Ingber, 1993b). (C) La stessa configurazione tensegrile di B costruita interamente da molle con elasticità differenti.

Strutture tensegrità. (A) Tripla corona, una scultura tensegrità, dell'artista Kenneth Snelson, composta da barre di acciaio inossidabile e cavi di tensione. Nota che questa struttura è composta da più moduli di tensegrità che sono interconnessi da regole simili. (B) Una sfera tensegrità composta da sei montanti in legno e 24 corde elastiche bianche, che imita il modo in cui una cellula cambia forma quando aderisce a un substrato (Ingber, 1993b). (C) La stessa configurazione tensegrile di B costruita interamente da molle con elasticità differenti.

(A) Una vista ad alto ingrandimento di una scultura Snelson con elementi di compressione e tensione del campione etichettati per visualizzare l'equilibrio della forza tensegrile basato sulla compressione locale e sulla tensione continua. (B) Un diagramma schematico dell'equilibrio delle forze complementari tra microfilamenti tesi (MF), filamenti intermedi (IF), microtubuli compressi (MT) e l'ECM in una regione di un array di tensegrità cellulare. Le forze di compressione sopportate dai microtubuli (in alto) vengono trasferite alle adesioni ECM quando i microtubuli vengono distrutti (in basso), aumentando così la trazione del substrato.

(A) Una vista ad alto ingrandimento di una scultura Snelson con elementi di compressione e tensione del campione etichettati per visualizzare l'equilibrio della forza tensegrile basato sulla compressione locale e sulla tensione continua. (B) Un diagramma schematico dell'equilibrio delle forze complementari tra microfilamenti tesi (MF), filamenti intermedi (IF), microtubuli compressi (MT) e l'ECM in una regione di un array di tensegrità cellulare. Le forze di compressione sostenute dai microtubuli (in alto) vengono trasferite alle aderenze ECM quando i microtubuli vengono distrutti (in basso), aumentando così la trazione del substrato.

Secondo la definizione più generale di Fuller, la tensegrità include due ampie classi strutturali - precompressa e geodetica - che non riuscirebbero ad agire come una singola entità o a mantenere la loro stabilità di forma quando sollecitate meccanicamente senza una trasmissione continua di forze tensionali (Fuller, 1961 Fuller, 1979 Ingber, 1998 Chen e Ingber, 1999). I primi mantengono le loro articolazioni in posizione come risultato di una "precompressione" (tensione di trazione preesistente o tensione isometrica) all'interno della struttura (Fig. 1). Questi ultimi triangolano i loro membri strutturali e li orientano lungo geodetiche (percorsi minimi) per vincolare geometricamente il movimento. I nostri corpi forniscono un esempio familiare di una struttura tensegrità precompressa: le nostre ossa agiscono come puntoni per resistere alla trazione di muscoli in tensione, tendini e legamenti e la stabilità della forma (rigidità) dei nostri corpi varia a seconda del tono (precompressione) nei nostri muscoli . Esempi di strutture tensegrali geodetiche includono cupole geodetiche di Fuller, buckminsterfullereni a base di carbonio (Bucky Balls) e strutture spaziali tetraedriche, che sono popolari con la NASA perché mantengono la loro stabilità in assenza di gravità e, quindi, senza compressione continua.

Alcuni ricercatori usano la tensegrità per riferirsi solo alle strutture precompresse "bar and cable" o particolari sottoclassi di queste (ad esempio forme non ancorate) (Snelson, 1996 Heidemann et al., 2000). Poiché Fuller ha definito il termine tensegrità, qui uso la sua definizione più generale. L'esistenza di una base strutturale comune per queste due diverse classi di strutture è supportata anche da recenti lavori del matematico Robert Connelly. Ha sviluppato un metodo altamente semplificato per descrivere le configurazioni tensegrili precompresse e poi ha scoperto che le stesse regole matematiche fondamentali descrivono l'impaccamento più vicino delle sfere (Connelly e Back, 1998), che delineano anche le diverse forme geodetiche (Fuller, 1965).

Il modello tensegrile cellulare propone che l'intera cellula sia una struttura tensegrile precompressa, sebbene strutture geodetiche si trovino anche nella cellula a scale di dimensioni più piccole. Nel modello, le forze tensionali sono sostenute da microfilamenti citoscheletrici e filamenti intermedi, e queste forze sono bilanciate da elementi strutturali interconnessi che resistono alla compressione, in particolare, puntoni di microtubuli interni e adesioni della matrice extracellulare (ECM) (Fig. 2B). Tuttavia, i singoli filamenti possono avere una doppia funzione e quindi sopportare sia la tensione che la compressione in diversi contesti strutturali o su diverse scale dimensionali (ad esempio i fasci di filamenti di actina rigidi sopportano la compressione nei filopodi). La precompressione tensionale che stabilizza l'intera cellula è generata attivamente dall'apparato contrattile dell'actomiosina. Ulteriori contributi passivi a questo prestress provengono dalla distensione cellulare attraverso adesioni alla ECM e ad altre cellule, forze osmotiche che agiscono sulla membrana cellulare e forze esercitate dalla polimerizzazione dei filamenti. I filamenti intermedi che si interconnettono in molti punti lungo i microtubuli, i microfilamenti e la superficie nucleare forniscono rigidità meccanica alla cellula attraverso le loro proprietà del materiale e la loro capacità di agire come cavi sospensivi che si interconnettono e irrigidiscono tensionalmente l'intero citoscheletro e il reticolo nucleare. Inoltre, il citoscheletro interno si interconnette alla periferia della cellula con una rete citoscheletrica corticale altamente elastica direttamente sotto la membrana plasmatica. L'efficienza dell'accoppiamento meccanico tra questa rete strutturale sottomembrana e il reticolo citoscheletrico interno dipende dal tipo di complesso di adesione molecolare che si forma sulla superficie cellulare. L'intero citoscheletro integrato viene quindi permeato da un citosol viscoso e racchiuso da una membrana superficiale differenzialmente permeabile.


CMB 334 Esame 1

I moderni sistemi di filtraggio utilizzano articoli di laboratorio in plastica usa e getta anziché filtri a base di alghe e hanno camere superiori/inferiori e sono disponibili in una varietà di dimensioni dei pori.

1.) Natura del acido nucleico nel virione (modello di Baltimora, il più usato)

2.) Simmetria del guscio proteico/capside

3.) Presenza di a membrana/involucro lipidico

Cella resistente- non consente l'ingresso di virus

Saggio di messa a fuoco della florescenza- simile al test della placca, tranne che viene aggiunto un anticorpo per il virus insieme a un secondo anticorpo indicatore fluorescente che si attacca al primo anticorpo per osservare il titolo del virus come "unità-focalizzanti-fluorescenti/ml".

Saggio di centri infettivi- simile al test della placca, tranne per il fatto che inizia con un numero noto di cellule infette e viene utilizzato per misurare la percentuale di cellule infette in colture persistentemente infette.

Saggio di trasformazione- utile per i retrovirus che non formano placche, misura il numero di "pile" o focolai che si formano a causa delle cellule infette che perdono la loro inibizione di contatto che consente loro di formare un normale monostrato. questo si misura in unità formanti focus/ml.