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8.8: Trascrizione inversa - Biologia

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Nel dogma centrale, il DNA codifica per l'mRNA, che codifica per le proteine. Questi virus codificati da RNA hanno una fase nel loro ciclo di vita in cui il loro RNA genomico viene riconvertito in DNA da un enzima codificato dal virus noto come trascrittasi inversa. La capacità di convertire l'RNA in DNA è un metodo desiderabile in laboratorio per numerose ragioni. Ad esempio, la conversione di RNA di interesse in cDNA viene utilizzata nella RT-PCR e in altre applicazioni come l'analisi di microarray.

Processi

Innanzitutto, si crea un oligonucleotide di DNA che funge da primer per la trascrittasi inversa da utilizzare su un RNA bersaglio. Il primer deve, ovviamente, essere complementare a un segmento (vicino all'estremità 3') dell'RNA da amplificare. L'RNA, la trascrittasi inversa, il primer e quattro dNTP sono mescolati. Con un ciclo di replicazione, l'RNA viene convertito in un singolo filamento di DNA. La denaturazione libera il cDNA a singolo filamento, che può essere utilizzato così com'è o convertito in cDNA a doppio filamento, a seconda dell'applicazione.


Figura 8.37 - Trascrittasi inversa dell'HIV. La funzione della nucleasi è necessaria per il ciclo di vita virale, ma non per l'uso in laboratorio. Wikipedia

Rilevare le interazioni molecolari

Lo studio della biochimica è fondamentalmente lo studio delle interazioni delle molecole cellulari. I metodi per rilevare le interazioni tra biomolecole sono, per questo motivo, molto utili ai biochimici. Discuteremo ora un paio di metodi molto diversi per rilevare queste interazioni intermolecolari.

Sistema a due ibridi di lievito (Y2H)

Lo screening del doppio ibrido del lievito è una tecnica sofisticata per identificare quale/i proteina/e, da una raccolta di tutte le proteine ​​di una cellula, interagisce con una specifica proteina di interesse. Il metodo si basa sull'interazione tra due proteine ​​per ricostituire un attivatore trascrizionale funzionale all'interno delle cellule di lievito. Forse ricorderete che molti attivatori trascrizionali sono proteine ​​modulari che hanno un dominio che si lega al DNA e un altro dominio che attiva la trascrizione (Figura 8.38).

Se il fattore di trascrizione è diviso, in modo che il dominio di legame sia attaccato a una proteina e il dominio di attivazione a un'altra proteina, un attivatore trascrizionale funzionale può essere ricreato solo se le due proteine ​​"vettrici" entrano in stretta vicinanza - cioè , interagiscono. La presenza di questo attivatore funzionale può essere rilevata dall'espressione di un gene reporter.

Un modo semplice per capire questa idea è pensare a un attivatore trascrizionale come un dispositivo, come una torcia, che ha due parti, la batteria e la lampada, che devono stare insieme per funzionare. Né una persona che ha solo una batteria né chi ha solo la lampada sarà in grado di vedere in una stanza buia. Ma se i due interagiscono avvicinandosi abbastanza da inserire la batteria nella torcia, la loro interazione può essere rilevata dal fatto che la torcia sarà ora funzionante come evidenziato dalla luce prodotta.

Bisogna essere in due per ballare il tango

La Figura 8.39 (A) mostra il normale attivatore trascrizionale del lievito, GAL4, con entrambi i domini di legame al DNA (DBD) e di attivazione (AD). È in grado di stimolare la trascrizione del gene reporter a valle, lac z. I pannelli B e C mostrano costrutti che producono GAL4 DBD e AD, rispettivamente, fusi ad altre proteine, una delle quali è chiamata "esca" e l'altra come "preda". Nessuna di queste proteine ​​di fusione può stimolare la trascrizione del gene lac z. Quando i costrutti che codificano sia l'esca che la preda si trovano nella stessa cellula di lievito, se la proteina dell'esca interagisce con la preda, il DBD e l'AD del GAL4 verranno uniti per ricostituire un GAL4 funzionale. La presenza di GAL4 funzionale è facilmente rilevabile perché stimolerà l'espressione del gene reporter lac z. Se le proteine ​​dell'esca e della preda non interagiscono, non ci sarà espressione di lac z. Quando l'interazione viene rilevata attraverso l'espressione del gene reporter, è possibile identificare la specifica proteina preda.

Il sistema a due ibridi di lievito consente lo screening simultaneo di molte proteine ​​preda, costruendo grandi raccolte di costrutti di fusione, con ogni potenziale partner proteico della proteina esca fusa al dominio di attivazione GAL4.


Figura 8.39 - Quattro scenari per il sistema a due ibridi di lievito. UAS = Upstream Activator Sequences - agisce come un promotore. Lo scenario A mostra che i due fattori di trascrizione iniziano come una proteina. Wikipedia


Guarda il video: Da RNA a DNA: vacilla DAVVERO il Dogma Centrale della biologia? (Febbraio 2023).