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Come scegliere l'anticorpo secondario?

Come scegliere l'anticorpo secondario?


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quando l'isotipo dell'anticorpo primario è IgG2a (dal topo) e IgG2b (dal ratto), come scegliere l'anticorpo secondario contro questi isotipi primari? L'anticorpo secondario è così specifico per rilevare IgG2a/2b? Qual è la logica dietro la scelta degli anticorpi secondari? Una nota dettagliata al riguardo sarà molto apprezzata.


Non stai dicendo cosa fai, ma penso che sia western blot - e per questa applicazione non è importante sapere quale isotipo ha il tuo anticorpo. L'anticorpo secondario (che dovrebbe legare il primario) deve essere diretto contro l'isotipo (IgG per esempio) e la specie in cui è stato prodotto l'anticorpo primario, nel tuo caso questo sarebbe anti-topo o anti- ratto IgG. Poiché la maggior parte degli anticorpi in commercio in laboratorio sono IgG, le persone di solito non ci pensano.

Il motivo è che l'anticorpo secondario è diretto contro la parte Fc dell'anticorpo primario (che ha una sequenza specie-specifica) e anche con le differenze nelle sottoclassi dovute al diverso assemblaggio delle catene leggere e pesanti questo non verrà rilevato dai secondari. Vedere la figura (da qui) sulle differenze schematiche:

Con un'attenta selezione dei peptidi utilizzati per l'immunizzazione è possibile generare anticorpi secondari che possono essere utilizzati per distinguere tra sottoclassi.


Selezione dell'anticorpo secondario

Gli anticorpi secondari sono fondamentali per esperimenti di successo che coinvolgono gli anticorpi. Forniscono il rilevamento e l'amplificazione del segnale oltre ad estendere l'utilità di un anticorpo attraverso la coniugazione alle proteine. Esistono diversi tipi di anticorpi secondari e selezionare il migliore può essere una sfida. L'articolo qui sotto ti aiuterà a fare la scelta migliore.

Sfoglia tutti gli anticorpi secondari

Qual è la specie ospite del tuo anticorpo primario?

L'anticorpo secondario deve essere allevato contro la specie ospite dell'anticorpo primario. Ad esempio, se l'anticorpo primario è stato generato nel coniglio, il secondario deve essere anti-coniglio

Figura 1. Specie ospiti più comuni di anticorpo primario.

Il tuo anticorpo primario è policlonale o monoclonale?

Anticorpo policlonale

Un anticorpo policlonale contiene una miscela di diversi isotipi di immunoglobuline G (ad es. IgG1, IgG2a). Pertanto, per massimizzare il rilevamento del bersaglio, è meglio utilizzare un anticorpo secondario che riconosca tutti gli isotipi. Questi sono tutti gli anticorpi secondari che sono etichettati come "IgG H+L" (H e L rappresentano rispettivamente le catene pesanti e leggere di IgG). Questa designazione significa che la specie ospite secondaria è stata immunizzata con un pool di IgG di un'altra specie consentendo all'anticorpo secondario purificato di riconoscere tutte le forme.

Anticorpo monoclonale

Un anticorpo monoclonale contiene un singolo isotipo di immunoglobulina. Pertanto, è fondamentale utilizzare un secondario che riconosca specificamente quell'isotipo. L'isotipo dell'anticorpo primario deve essere indicato sulla scheda tecnica del prodotto.

Figura 2. Categorie di anticorpi: A) gli anticorpi policlonali si legano allo stesso antigene, ma epitopi diversi e B) gli anticorpi monoclonali si legano allo stesso epitopo su un antigene bersaglio.

Nota: se l'anticorpo primario è un frammento (non l'intero anticorpo), anche l'anticorpo secondario deve essere specifico del frammento per ridurre il segnale di rumore (ad es., gli anticorpi secondari del frammento F(ab')₂ penetrano più facilmente nel tessuto nell'IHC).

Qual è il tuo metodo di rilevamento del segnale?

Gli anticorpi secondari possono essere coniugati a un'ampia gamma di sostanze chimiche, inclusi enzimi (perossidasi di rafano (HRP) o fosfatasi alcalina (AP)) e fluorofori (ad esempio fluoresceina (FITC) o cianina (Cy3)).

Altre considerazioni

Purificazione:

Una tecnica di purificazione comune per gli anticorpi secondari è la purificazione ad alta affinità, con conseguente riduzione del legame non specifico. Inoltre, gli anticorpi secondari possono passare attraverso un ulteriore passaggio di purificazione per ridurre potenziali reazioni incrociate con altre specie chiamate adsorbimento incrociato. In questo processo, la soluzione di anticorpo secondario viene fatta passare su diverse colonne contenenti proteine ​​sieri di specie diverse per filtrare l'anticorpo secondario non specifico (ad es., per la multicolorazione).

Western Blotting dopo immunoprecipitazione:

Quando si utilizza il Western blot per rilevare una proteina in campioni immunoprecipitati, è necessario prestare particolare attenzione alla scelta degli anticorpi. I campioni immunoprecipitati contengono le catene pesanti e leggere dell'anticorpo pull-down. Queste catene si presentano a 100 kDa e 50 kDa. Se l'anticorpo secondario riconosce l'anticorpo pull-down e l'anticorpo primario del Western blot, queste bande si presenteranno ad alta intensità e potrebbero oscurare il segnale della proteina bersaglio. È meglio usare una specie diversa per l'anticorpo primario del Western Blot rispetto all'anticorpo pull-down. Se ciò non è possibile, si consiglia di utilizzare un secondario che riconosca la catena specifica più lontana dalla proteina bersaglio o di utilizzare un anticorpo secondario che preferisca le forme native rispetto a quelle denaturate.


La differenza tra anticorpo primario e anticorpo secondario

Qual è la differenza tra un anticorpo primario e un anticorpo secondario? Questa è una domanda frequente da parte di mani verdi in laboratorio. Qui risponderemo a questa domanda da cinque angolazioni: capacità di legame, uso e etichettatura, sorgente, clonazione e pre-adsorbimento.

Gli anticorpi (Ab) sono ampiamente utilizzati per la ricerca. A seconda della loro capacità di legame, gli anticorpi possono essere classificati in due tipi: anticorpi primari e anticorpi secondari. Nello specifico, gli anticorpi primari sono anticorpi che si legano alla proteina o all'antigene (Ag) oa qualsiasi sostanza studiata, mentre gli anticorpi secondari sono quelli che si legano agli anticorpi primari. Guarda la Fig. 1 qui sotto:

Fig. 1 Ab primario VS. Ab . secondario

Se hai letto il nostro articolo precedente Cos'è un anticorpo? acquisirai una buona conoscenza della struttura dell'anticorpo, e quindi troverai più facile capire che il dominio Fab dell'anticorpo primario si lega a un antigene ed espone il suo dominio Fc all'anticorpo secondario, e quindi il dominio Fab dell'anticorpo secondario si lega al dominio primario dominio Fc dell'anticorpo.

Poiché il dominio Fc è lo stesso in tutte le molecole anticorpali della stessa classe in una data specie, un tipo di anticorpo secondario è in grado di legarsi a molti tipi di anticorpi primari. Ad esempio, quando gli anticorpi della classe IgG allevati nei topi vengono utilizzati come anticorpo primario, un anticorpo che ha come bersaglio il dominio Fc IgG di topo e non viene allevato nei topi può essere utilizzato come anticorpo secondario.

Nei saggi immunologici, è sempre necessario un anticorpo primario per legarsi all'antigene bersaglio, ma non viene necessariamente utilizzato un anticorpo secondario. Prendiamo come esempio l'ELISA diretto e l'ELISA indiretto. L'ELISA diretto implica l'etichettatura diretta, il che significa che l'anticorpo primario è etichettato direttamente con un enzima per la reazione enzimatica e il rilevamento del segnale e non è necessario un anticorpo secondario. L'ELISA indiretto non etichetta direttamente l'anticorpo primario, ma invece etichetta l'anticorpo secondario con un enzima, come mostrato nella Fig. 2 di seguito.

Fig. 2 ELISA diretto VS. ELISA indiretto

Se etichettare l'anticorpo primario (etichettatura diretta) o l'anticorpo secondario (etichettatura indiretta) dipende dall'esperimento. Sia l'etichettatura diretta che l'etichettatura indiretta hanno i suoi vantaggi e svantaggi. L'etichettatura diretta è generalmente associata a un protocollo semplice che consente di risparmiare tempo e reagenti, non presenta alcun rischio di reattività crociata dall'anticorpo secondario, ma manca di flessibilità e amplificazione del segnale e può comportare un background elevato. L'etichettatura indiretta comporta l'amplificazione del segnale, è molto flessibile poiché lo stesso anticorpo secondario può reagire con più anticorpi primari, ma ha un protocollo relativamente complesso e un rischio di reattività crociata.

La fonte degli anticorpi è un aspetto importante da considerare. La specie ospite dell'anticorpo primario dovrebbe essere diversa dalla specie del campione, per evitare reattività crociata dall'anticorpo secondario con le immunoglobuline del campione. Inoltre, la specie ospite dell'anticorpo secondario dovrebbe essere diversa dalla specie ospite dell'anticorpo primario, poiché l'anticorpo secondario dovrebbe essere diretto contro la specie dell'anticorpo primario.

Ad esempio, se studi un campione di topo, avrai bisogno di un anticorpo primario generato in animali diversi dal topo, come quelli generati nel coniglio. Quindi, se si utilizza un anticorpo di coniglio diretto contro il topo come anticorpo primario, sarà necessario un anticorpo secondario generato in animali diversi dal coniglio, come quelli generati nella capra.

Per consentire il rilevamento dell'antigene bersaglio, l'anticorpo secondario non solo dovrebbe avere specificità per la specie dell'anticorpo primario, ma anche per l'isotipo dell'anticorpo primario. Ad esempio, se l'anticorpo primario è un anticorpo IgG1 allevato nel coniglio, sarà necessario un anticorpo secondario che possa reagire con l'anticorpo IgG1 di coniglio e non sia generato nel coniglio.

L'anticorpo primario può essere un anticorpo monoclonale (mAb) o un anticorpo policlonale (pAb).

Confrontiamo prima gli anticorpi monoclonali e gli anticorpi policlonali. Gli anticorpi monoclonali riconoscono solo un epitopo su un antigene, mentre gli anticorpi policlonali riconoscono più epitopi su un antigene. A causa di ciò, gli anticorpi monoclonali e gli anticorpi policlonali hanno proprietà e usi diversi. Gli anticorpi monoclonali hanno un'elevata specificità e un'elevata riproducibilità, causando meno sfondo dalla colorazione rispetto agli anticorpi policlonali. Tuttavia, a causa della loro elevata specificità, gli anticorpi monoclonali possono non funzionare quando l'epitopo bersaglio viene modificato dal trattamento chimico dell'antigene. Al contrario, gli anticorpi policlonali hanno un'elevata affinità, tollerano cambiamenti minori dell'antigene e consentono un rilevamento più robusto. Ma gli anticorpi policlonali hanno una maggiore variabilità da lotto a lotto e hanno maggiori probabilità di creare uno sfondo elevato dalla colorazione.

Se il tuo esperimento richiede un'elevata specificità, l'uso di anticorpi monoclonali come anticorpi primari può essere una buona scelta. Se il segnale positivo è debole, prova gli anticorpi policlonali. Poiché gli anticorpi policlonali riconoscono più epitopi, è più probabile che diano risultati migliori nell'immunoprecipitazione (IP) e nell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Ma se si desidera sondare domini specifici dell'antigene, gli anticorpi policlonali non sono utili e gli anticorpi monoclonali come anticorpi primari potrebbero essere migliori.

L'anticorpo secondario può essere un anticorpo monoclonale o un anticorpo policlonale che si lega all'anticorpo primario o ai suoi frammenti. Esistono diverse forme di anticorpi secondari. Primo, un anticorpo secondario può essere diretto contro l'intera molecola dell'anticorpo primario. Ad esempio, un anticorpo primario è generalmente l'isotipo IgG. Quindi, avrai bisogno di un anticorpo anti-IgG H&L (Catene pesanti e leggere) come anticorpo secondario, che reagisce con entrambe le catene pesanti e leggere dell'anticorpo IgG primario. Inoltre, questo anticorpo anti-IgG H&L reagisce anche con altre classi di immunoglobuline come IgM e IgA delle specie dell'anticorpo primario, poiché tutte le immunoglobuline in una data specie hanno le stesse catene leggere. In secondo luogo, un anticorpo secondario può essere specifico per la regione Fab dell'anticorpo primario. Allo stesso modo, questa forma di anticorpo secondario reagisce anche con le catene pesanti e leggere e quindi reagisce con altre classi di immunoglobuline con le stesse catene leggere. Terzo, un anticorpo secondario può essere specifico per la regione Fc dell'anticorpo primario, il che significa che reagisce solo con la catena pesante. Quindi questo anticorpo secondario reagisce solo con una classe di immunoglobuline, come IgG o IgM. Infine, un anticorpo secondario può essere specifico per la catena leggera dell'anticorpo primario, quindi reagirà con tutte le classi di immunoglobuline con la stessa catena leggera.

Gli anticorpi secondari a volte richiedono un processo di purificazione aggiuntivo, noto come pre-adsorbimento, per aumentare la specificità e ridurre al minimo la non specificità. Durante il pre-assorbimento, la soluzione contenente anticorpi secondari viene fatta passare attraverso una matrice di colonna contenente proteine ​​sieriche immobilizzate o immunoglobuline da specie potenzialmente cross-reattive (come le specie del campione). Attraverso questo processo, gli anticorpi non specifici nella soluzione verranno rimossi, mentre verranno lasciati gli anticorpi secondari altamente specifici. Ad esempio, se stai lavorando con tessuti di topo, scegli un anticorpo secondario che è stato adsorbito con siero di topo o IgG di topo.

Gli anticorpi secondari pre-adsorbiti producono meno legami non specifici e quindi hanno meno probabilità di creare uno sfondo non specifico. Quando si determina l'espressione proteica in più esperimenti di etichettatura o quando si studiano tessuti o cellule ricchi di immunoglobuline, si consiglia di utilizzare un anticorpo secondario pre-assorbito.

In sintesi, ci sono diverse differenze tra anticorpi primari e anticorpi secondari. In primo luogo, gli anticorpi primari e gli anticorpi secondari hanno diverse capacità di legame. Gli anticorpi primari si legano all'antigene rilevato, mentre gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari, solitamente il loro dominio Fc. In secondo luogo, gli anticorpi primari sono sempre necessari nei test immunologici, mentre gli anticorpi secondari non sono necessariamente necessari, il che dipende dal metodo sperimentale (marcatura diretta o indiretta). In terzo luogo, la specie in cui vengono generati gli anticorpi primari non è la stessa specie del campione e la specie in cui vengono generati gli anticorpi secondari è diversa dalla specie fonte di anticorpi primari. In quarto luogo, sia gli anticorpi primari che gli anticorpi secondari possono essere monoclonali o policlonali, ma ci sono cose diverse da considerare nella selezione della loro clonalità. Infine, gli anticorpi secondari a volte devono essere pre-adsorbiti, mentre generalmente non c'è bisogno di anticorpi primari.

Ora, potresti ottenere una migliore comprensione della differenza tra anticorpi primari e anticorpi secondari e troverai più facile selezionare gli anticorpi giusti per i tuoi esperimenti. Scegliere l'anticorpo giusto non è mai un compito facile. Se hai scelto un anticorpo non adatto al tuo esperimento, potresti sprecare denaro, tempo e campioni preziosi. Per semplificare la selezione dell'anticorpo, puoi continuare a leggere un altro articolo sul nostro sito: Come scegliere un anticorpo per la ricerca scientifica?


Ottimizzazione del protocollo di blocco

L'obiettivo di tutti gli agenti bloccanti è lo stesso: migliorare la sensibilità del test immunoistochimico riducendo il rumore di fondo non specifico e migliorando il rapporto segnale-rumore. Tuttavia, il miglior protocollo di blocco dipenderà dal tipo di campione, dalla fonte di anticorpi, dal metodo di rilevamento* e dalla presenza di interazioni proteina-proteina impreviste. Pertanto, dovrai testare più bloccanti e condizioni per determinare empiricamente il tuo metodo di blocco ottimale.

* Non tutti gli agenti di blocco e i buffer sono compatibili con tutti i metodi di rilevamento. Ad esempio, i coniugati di fosfatasi alcalina non sono compatibili con alcun conservante di sodio azide nei tamponi e il sistema complesso avidina-biotina non è compatibile con il latte in polvere scremato.


Permeabilizzazione e fissazione

La colorazione di antigeni intracellulari come le citochine può essere difficile perché le sonde a base di anticorpi non possono passare facilmente attraverso la membrana plasmatica all'interno della cellula. Per fare ciò, le cellule devono essere prima fissate in sospensione e quindi permeabilizzate prima di aggiungere l'anticorpo. La scelta del fissativo è un primo passo importante. La formaldeide e la gluteraldeide creano legami tra i residui di lisina con conseguente proteine ​​reticolate, tuttavia la gluteraldeide aumenta l'autofluorescenza. Di solito viene utilizzato a concentrazioni dello 0,5-4% in PBS a seconda del campione. Se hai intenzione di conservare i tuoi campioni per periodi di tempo più lunghi, dovrebbero essere rimossi dal fissativo dopo 1-2 ore.

La formaldeide non permeabilizza i campioni, quindi è necessaria una fase di permeabilizzazione separata. Ciò consente alle sonde di accedere alle strutture intracellulari lasciando intatte le caratteristiche di dispersione morfologica delle cellule. Tritone, digitonina e saponina sono esempi di reagenti di permeabilizzazione che agiscono disgregando la membrana cellulare. Il livello di permeabilizzazione è importante poiché l'accesso agli epitopi può richiedere diversi livelli di permeabilizzazione (ad esempio epitopi citoplasmatici vs epitopi nucleari) e l'anticorpo non legato deve essere sufficientemente lavato via dalle cellule. Oggi sono disponibili anche molti kit commerciali che forniscono i reagenti per eseguire sia la fissazione che la permeabilizzazione, ad esempio Leucoperm&trade (Figura 28).

Fig. 28. Colorazione intracellulare. Il sangue intero umano (A) è stato colorato in superficie per CD4 seguito da colorazione intracellulare per IFN-gamma, su linfociti a riposo (B) o linfociti stimolati con PMA/ionomicina e trattati con monensina (C) prima della colorazione.


BSA contro latte nel blocco e nell'incubazione dell'anticorpo - (30/11/2011 )

Non riesco a vedere un segnale della mia proteina a basso peso molecolare (16kda), ho fatto il 15% di SDS-PAGE e ho bloccato la membrana nel latte al 5%, incubazioni primarie (monoclonali) e secondarie diluite anche nel latte al 5%.
Alcune persone mi suggeriscono di provare la BSA al posto del latte.
In realtà, ho incubato di nuovo lo stesso filtro con l'anticorpo diluito nel latte durante la notte 4°C.
Chissà se posso fare un anticorpo secondario diluito in BSA?? o devo tenerlo nel latte?
Grazie

luciana cosa è successo al tuo blot. voglio sapere il risultato. in futuro lavorerò su 17kd protein blotting.

Ciao,
dopo aver otturato nuovamente il filtro con BSA 5% e anticorpo diluito in BSA. Ho ricevuto un segnale con lo sfondo.. Ma ho notato che il 15% non è realmente necessario. Posso mantenere il 10% becos Sembra che questa proteina abbia un trimero a 55kda. Non sono riuscito a vedere 16kda!

i lavaggi vengono eseguiti per 10 minuti ogni 3 volte dopo il blocco, l'incubazione addominale primaria e l'incubazione addominale secondaria, questo ridurrà correttamente lo sfondo, questo è successo a me. nel tuo caso trimer stai dicendo ma è il tuo gel, gel riducente SDS giusto? allora come mai trimer? hai riscaldato il campione per 5 minuti prima di caricarlo.?


Guida e risoluzione dei problemi di immunoistochimica (IHC)


L'immunoistochimica è una tecnica di laboratorio utilizzata per la rilevazione visiva degli antigeni nei tessuti. Quando si lavora con le cellule, questa tecnica viene generalmente definita immunocitochimica. Queste tecniche sono ampiamente utilizzate dai laboratori di istologia/patologia e dai ricercatori di scienze della vita come metodo per rilevare cellule anormali o per caratterizzare la localizzazione di proteine ​​all'interno di un campione biologico. Il rilevamento visivo si ottiene utilizzando anticorpi che sono stati coniugati chimicamente con un marcatore come un colorante fluorescente, un enzima, un elemento radioattivo o l'oro colloidale. La reazione finale antigene-anticorpo è visibile utilizzando un microscopio ottico o fluorescente a seconda degli anticorpi marcati utilizzati per il rilevamento.
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Selezione di anticorpi:

Ci sono numerosi fattori da considerare quando si sceglie un anticorpo primario in quanto vi sono vantaggi e svantaggi nell'utilizzo di un anticorpo primario monoclonale o policlonale. Gli anticorpi monoclonali sono generati da un singolo clone di cellule B di un animale che si traduce in una popolazione omogenea di immunoglobuline diretta contro un singolo epitopo. Gli anticorpi policlonali sono sviluppati da più cloni di cellule B dell'animale, il che si traduce in una miscela eterogenea di anticorpi diretti contro vari epitopi dello stesso antigene.

Generalmente i ricercatori possono scegliere un anticorpo monoclonale perché i lotti prodotti dalla linea di ibridomi stabilita consentono una produzione identica, quindi la standardizzazione. Inoltre, hanno meno probabilità di avere una colorazione di fondo e hanno meno probabilità di avere reattività crociata con altre proteine. Poiché gli anticorpi policlonali riconoscono più epitopi sullo stesso antigene, sono più tolleranti a piccoli cambiamenti nell'antigene durante la fissazione e l'elaborazione. Inoltre, gli anticorpi policlonali possono aumentare il segnale di rilevamento dell'antigene e sono il metodo preferito quando si utilizzano proteine ​​denaturate.

Quando si scelgono gli anticorpi per l'IHC, è necessario considerare anche la specie contro cui sono stati allevati gli anticorpi. Per fornire gli sfondi più bassi, gli anticorpi primari e secondari dovrebbero essere allevati contro la stessa specie.
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Metodi/Protocolli:

Preparazione del campione: fissazione

Il primo passo è la raccolta del campione di tessuto. La corretta raccolta del tessuto è un passaggio estremamente importante perché eviterà la degradazione del campione e manterrà la qualità. I fattori che possono influenzare la qualità includono il tempo fino alla fissazione e la temperatura del campione. Inoltre, il tessuto deve essere posto in una soluzione fissativa il prima possibile.

I fissativi vengono utilizzati per immobilizzare gli antigeni mantenendo le strutture cellulari e subcellulari attraverso ponti di metilene reticolati e basi di Schiff tra i residui di aminoacidi basici delle proteine. Esistono una varietà di fissativi utilizzati per l'IHC e non ce n'è uno ideale per tutti gli anticorpi e le applicazioni. Il fissativo più comunemente utilizzato è la formalina tamponata neutra al 10%. Altri includono metanolo, etanolo e acetone che possono essere usati per fissare e permeabilizzare la membrana.
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Preparazione del campione: inclusione

Esistono anche vari composti per inclusione che possono essere utilizzati per supportare il tessuto durante la lavorazione/sezionamento. Le sezioni congelate sono ideali per l'elaborazione rapida e le situazioni in cui l'anticorpo potrebbe non essere compatibile con i composti di paraffina. Le sezioni congelate vengono generalmente utilizzate per metodi di rilevamento dell'immunofluorescenza diretta o indiretta e sezionate con uno spessore di 10 micron. Il secondo tipo e più comune di mezzi di inclusione è la paraffina. La paraffina viene utilizzata per la massima conservazione dei tessuti e costituisce un blocco più forte per il sezionamento dei tessuti. Tipicamente le sezioni di paraffina vengono tagliate con uno spessore compreso tra 3-5 micron.
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Recupero dell'antigene:

A volte è necessario smascherare l'antigene perché il processo di paraffinazione e l'uso di fissativi forti possono inibire l'adesione degli anticorpi primari all'antigene. Esistono due processi comuni per il recupero dell'antigene: digestione mediata dal calore e digestione enzimatica. Entrambe queste tecniche servono a rompere i legami incrociati ed esporre l'antigene. Inoltre, viene utilizzata una fase di deparaffinazione su sezioni di tessuto incluse in paraffina attraverso un processo di serie di lavaggi con alcol.

Quando si utilizzano i reagenti per la digestione enzimatica è importante non sovradigerire o sottodigerire: il tempo di digestione deve essere ottimizzato. Gli enzimi utilizzati includono pronasi, tripsina, pepsina e proteinasi K. Il recupero dell'antigene indotto dal calore può essere effettuato utilizzando una pentola a pressione, microonde, autoclave o bagnomaria.
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Immunocolorazione:

L'immunocolorazione è il processo di incubazione del tessuto/cellule con anticorpi per formare il complesso antigene-anticorpo per la rilevazione/segnale dell'antigene mirato. Il rilevamento viene comunemente ottenuto utilizzando una reazione colorimetrica (enzima) o un segnale fluorescente generato da una sorgente ultravioletta.

Esistono molteplici tecniche di etichettatura tra cui diretta, indiretta e indiretta con amplificazione del segnale. L'etichettatura diretta utilizza un anticorpo primario direttamente coniugato a una fonte di segnalazione, mentre l'etichettatura indiretta ha un anticorpo secondario che genera un segnale che si attaccherà all'anticorpo primario che entra in contatto con l'antigene. Ad esempio, un anticorpo primario prodotto da coniglio verrebbe rilevato utilizzando un anticorpo secondario che è anti-coniglio e coniugato a una sonda di rilevamento. Infine, la tecnica indiretta con amplificazione del segnale viene eseguita utilizzando un anticorpo secondario biotinilato e un reagente di amplificazione come la streptavidina.

Le tecniche di immunofluorescenza utilizzano anticorpi coniugati chimicamente a coloranti fluorescenti visibili alla luce UV. Due coloranti popolari sono l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) e l'isotiocianato di rodamina (TRITC).

Le reazioni colorimetriche utilizzano anticorpi coniugati chimicamente agli enzimi perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina. L'enzima catalizza la reazione del substrato formando un precipitato di colore. I substrati comuni includono diaminobenzidina (DAB), 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC), 4-cloro-1-naftolo (4-CN) e bromocloroindolifosfato/nitro blu tetrazolio (BCIP/NBT).
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Risoluzione dei problemi:

I problemi comuni riscontrati includono colorazione insufficiente, colorazione eccessiva o sfondo elevato.

Nessuna macchia

Problema Possibili soluzioni)
L'anticorpo primario e l'anticorpo secondario potrebbero non corrispondere. Si raccomanda che l'anticorpo secondario sia contro la specie in cui è stato allevato l'anticorpo primario (ad es. se l'anticorpo primario viene allevato nel topo, utilizzare l'anticorpo secondario anti-topo).
L'anticorpo potrebbe non essere adatto per le procedure IHC che rivelano la proteina nella sua forma nativa (non denaturata). Testare l'anticorpo su un western blot non denaturato e denaturato per assicurarsi che l'anticorpo riconosca l'antigene non denaturato.
L'anticorpo secondario non è stato conservato al buio. Si raccomanda di evitare di esporre l'anticorpo secondario alla luce.
Non abbastanza anticorpo primario sta legando la proteina di interesse. Diluire meno l'anticorpo.
incubare più a lungo a 4°C.
La proteina di interesse non è abbondantemente presente nel tessuto. Eseguire un controllo positivo.
L'utilizzo di una fase di amplificazione può aiutare ad amplificare il segnale.
Utilizzare una diluizione inferiore dell'anticorpo primario.
La proteina di interesse è una proteina nucleare e l'anticorpo non può penetrare nel nucleo. Per facilitare la penetrazione del nucleo, aggiungere un agente permeabilizzante al tampone bloccante e al tampone di diluizione dell'anticorpo.
La deparafinizzazione potrebbe essere insufficiente Deparaffinare le sezioni più a lungo.
Usa xilene appena preparato.
I fissativi come la formalina e la paraformaldeide possono modificare l'epitopo riconosciuto dall'anticorpo. Utilizzare il metodo di recupero dell'antigene per smascherare l'epitopo.
Riparare per meno tempo.
Il tampone PBS può essere contaminato da batteri che hanno danneggiato la proteina di interesse. Utilizzare un conservante come l'azide allo 0,01% nel tampone di conservazione dell'anticorpo PBS.
utilizzare PBS sterile fresco.

Sfondo alto

Problema Possibili soluzioni)
Il blocco del legame non specifico potrebbe essere insufficiente. Aumentare il periodo di incubazione di blocco a 30 min per le sezioni e 1 ora per la coltura cellulare. Utilizzare un agente bloccante come il 10% di siero normale per le sezioni e l'1-5% di BSA per la coltura cellulare.
La concentrazione di anticorpi primari potrebbe essere troppo alta. Titolare l'anticorpo a una concentrazione più ottimale, incubare più a lungo utilizzando più diluito. Ciò fornirà un'associazione più lenta ma più specifica.
L'anticorpo secondario può legarsi in modo non specifico. Eseguire un controllo secondario senza anticorpo primario.
La temperatura di incubazione potrebbe essere troppo alta. Incubare sezioni di tessuto o cellule a 4°C.
Tessuto non adeguatamente lavato. Lavare abbondantemente con PBS tra tutti i passaggi
Le perossidasi endogene sono attive. Utilizzare inibitori enzimatici come Levamisol (2 mM) per la fosfatasi alcalina o H2O2 (0,3% v/v) per la perossidasi.
I fissativi come la formalina e la paraformaldeide sono troppo forti e potrebbero aver modificato l'epitopo riconosciuto dall'anticorpo. Modificare i metodi di recupero dell'antigene.
Diminuire il tempo di incubazione con la soluzione di smascheramento dell'antigene.
È stato applicato troppo substrato. Ridurre il tempo di incubazione del substrato.
Il cromogeno reagisce con il PBS presente nelle cellule. Utilizzare un tampone Tris per lavare le sezioni prima dell'incubazione con il substrato.
La pemeabilizzazione ha danneggiato la membrana e rimosso la proteina di membrana. Rimuovi l'agente permeabilizzante dai tuoi tamponi.

Colorazione non specifica

Problema Possibili soluzioni)
La concentrazione dell'anticorpo primario o secondario potrebbe essere troppo alta. Prova a ridurre la concentrazione di anticorpi e/o il periodo di incubazione. Confronta l'intensità del segnale con le cellule che non esprimono il bersaglio.
L'anticorpo primario viene allevato contro la stessa specie del tessuto colorato (ad es. anticorpo primario di ratto testato su tessuto di ratto). Quando viene applicato l'anticorpo secondario, si lega a tutto il tessuto poiché è stato allevato anche contro quella specie. Usa anticorpi primari/secondari generati contro una specie diversa dal tuo tessuto.
Le perossidasi endogene sono attive. Utilizzare inibitori enzimatici come Levamisol (2 mM) per la fosfatasi alcalina o H2O2 (0,3% v/v) per la perossidasi.
Le sezioni/celle si sono asciugate. Mantenere le sezioni di tessuto e le cellule ad alta umidità e non lasciarle seccare.

Informazioni correlate:

Confronto tra formaldeide e formalina:

Formaldeide:
La formaldeide è un gas incolore noto con la formula chimica di CH2O.

Formalina:
Quando il gas di formaldeide viene sciolto in acqua, si satura in soluzione al 37% (in peso) o al 40% (in volume) e viene indicato come 37-40% di formaldeide, 100% formalina o formalina forte. La parola formalina è usata per riferirsi a soluzioni di gas di formaldeide disciolte in acqua. La formalina immagazzinata contiene circa il 10% di metanolo per rallentare la polimerizzazione che porta alla precipitazione della paraformaldeide. Le soluzioni comunemente usate di formalina come fissativo includono:
• 10% NBF (formalina tamponata neutra):
- 100 ml 100% formalina
- 900 ml di acqua.
- 4 grammi sodio diidrogeno fosfato, monoidrato (NaH2PO4h2o)
- 6,5 grammi di disodio idrogeno fosfato, anidro (Na2HPO4)
- La concentrazione finale contiene il 4% di formaldeide.
• Formalina Salina:
- 100 ml 100% formalina
- 900 ml di acqua
- 8,5 grammi di cloruro di sodio.
• 10% di formalina:
- 100 ml 100% formalina
- 900 ml di acqua

Paraformaldeide:
La paraformaldeide è la forma polimerizzata della formaldeide. È usato per produrre soluzioni di formalina prive di metanolo che non contengono acido formico quando vengono prodotte per la prima volta.
• 4% Paraformaldeide:
- 40 grammi di paraformaldeide
- Portare a un litro con tampone fosfato salino (PBS)
- Riscaldare la soluzione sotto cappa a 60ºC - 70ºC e aggiungere gocce di NaOH 10M fino a quando la soluzione non diventa limpida. Filtro soluzione finale.


ProSci Incorporated ha sviluppato e prodotto anticorpi SARS-CoV-2 (COVID-19, 2019-nCoV), antigeni e altri reagenti relativi all'ingresso cellulare: recettore ACE2, TMPRSS2 ed enzima furin. ProSci Inc. aggiunge continuamente nuovi reagenti SARS-CoV-2 per spike, S1, S2, nucleocapside, membrana, busta inclusi anticorpi a dominio singolo lama e proteine ​​ricombinanti. Disponiamo di proteine ​​ricombinanti SARS-CoV-2 (2019-nCoV), anticorpi convalidati da campioni di pazienti COVID-19 e stiamo attivamente sviluppando nuovi prodotti per il coronavirus. Inoltre, i nostri servizi di anticorpi personalizzati supportano la ricerca SARS-CoV-2 nello sviluppo di strumenti di ricerca, diagnostica, terapie e vaccini.

Reagenti SARS-CoV-2

ProSci offre anticorpi e proteine ​​ricombinanti per tutte le proteine ​​strutturali di SARS-CoV-2.

Varianti SARS-CoV-2

Proteine ​​RBD per le varianti COVID-19: Alpha, Beta, Gamma disponibili per la ricerca!

Reagenti per telaio di lettura aperto SARS-CoV-2

ProSci ha un catalogo di anticorpi e proteine ​​per molte delle proteine ​​accessorie dell'ORF.

Anticorpi accoppiati SARS-CoV-2

Queste coppie includono anticorpi contro spike s1, spike RBD e proteine ​​nucleocapside.

Anticorpi convalidati con campioni di pazienti

ProSci potenzia gli sforzi di ricerca a livello globale per comprendere questo virus e i suoi effetti sulla salute. ProSci offers antibodies against structural SARS-CoV-2 proteins validated with COVID-19 positive patient tissue samples.

COVID-19 Small Molecules

Several strategies are being taken for SARS-CoV-2 antiviral drug discovery. ProSci offers several drugs that have helped in the exploration of the SARS-CoV-2 life cycle and its mode
of infection.

ACE2 and Related Targets

Angiotensin-converting enzyme 2, has been shown to be the receptor for SARS-CoV-2 through binding of its Spike protein.

Infectious Disease Research Reagents

ProSci offers antibodies and proteins to over 20 infectious disease targets.

Influenza Virus Research Reagents

Antibodies and recombinant proteins for influenza virus targets such as H5N1, H1N1, and more!

Cytokine Storm

ProSci offers antibodies and recombinant proteins for many factors involved in the inflammatory response.

5A's Antibody Guide

Inside our antibody development guide section, you will find information about how our custom antibody services work, the challenges we face, and how we resolve them.

San Diego Company

ProSci is proud to be a local San Diego antibody company devoted to R&D and committed to the design, development, and production of high-performance antibodies.

ProSci Blog

Learn more about ProSci's experience with creating antibodies for difficult antigens and new developments in antibody research through our blog posts.

Broad Antibody Catalog | Extensive Antibody Services | Established in 1998


School of Medicine Columbia

We are primarily involved in teaching, research and service. Our research is well-funded by grant support from federal sources such as the National Institutes of Health and from private foundations. Such support has resulted in high-quality publications in scientific journals as well as presentations at regional, national and international conferences.

Interdisciplinary Approach

Our department offers a highly interactive research environment conducive to collaborations on interdisciplinary and multidisciplinary research projects with others in our school, university and beyond, as evidenced by extramurally-funded center and program project grants.

Servizio

Our faculty direct state-of-the-art cores such as the Flow Cytometry and Sorting. Our other shared resources comprise cutting-edge equipment and technology for Advanced Microscopy, –Omics (Genomics, Epigenomics, Transcriptomics and Microbiome technology) and Metabolic Profiling studies. We welcome you to visit us to see our equipment and resources first-hand.

Faculty

Our faculty are recognized leaders in their fields. They are appointed to national and international grant-review committees, hold offices in scientific societies, organize conferences and serve on government-appointed panels and scientific journal editorial boards. They participate in teaching courses primarily for medical and graduate students, as well as for post-baccalaureate and physician assistant students.

Core Courses

A seven-credit-hour, fall semester, second-year course covering fundamental and clinical aspects of microbiology and immunology as they relate to bacteria, viruses, fungi and parasites. Infectious agents are discussed in relation to their morphology, biology, epidemiology and pathogenesis.

The role of the specific and nonspecific immune systems in defense against infection and disease, as well as in the causation of disease (immunopathogenesis), is emphasized. A section of the course is devoted to special topics in infectious diseases. Primary methods of instruction include lecture, case-based discussion/presentation, patient-oriented problem-solving exercises, clinical correlations and laboratory. Modes of assessment include departmental written multiple choice examination and an assessment of participation in problem-solving exercises, case study discussions and computer simulated laboratory exercises.

A two-semester, seven-credit-hour (PAMB 641 - fall) and six-credit-hour (PAMB 642 - spring), second-year course that provides students with an understanding of the basic mechanisms of diseases, the body’s response to these diseases and the manifestation of these changes in patient signs, symptoms and tests in specific organ systems. Primary methods of instruction include lecture and small-group discussion. Modes of assessment include a NBME subject examination and departmental multiple choice examinations.

This graduate level course covers immune system components, including the innate and adaptive immune system, their functions and interactions. Topics on immune system dysregulation and consequences as related to disease and health are included. Current topics of interest in immunology also are covered. Overall, students will gain an advanced understanding of the immune system.

By the end of this course the student will demonstrate knowledge and understanding in:

  1. the components of the immune system and their functions.
  2. interactions between immune system components.
  3. immune system dysregulation and consequences.
  4. immune response during health and disease.

In this course, students learn and understand the following topics:

  • Apoptosis and its implications in neurodegenerative and malignant diseases
  • Proteomics in biomedical science
  • Basic concepts of stem cells and their roles in diseases
  • Roles of G-proteins in cell signaling in various disease processes
  • development of gene therapy approaches and gene therapy based therapeutics for basic and clinical applications

A minimum of 4 students is required to conduct this course.

In this course, students learn and understand the following topics:

  • Basic components of different neoplastic diseases and general pathology of neoplasia
  • Mechanisms of metastasis, oncogenes, tumor suppressor genes and telomerase
  • AIDS related malignancies
  • Signaling pathways in cancer
  • DNA and RNA tumor viruses apoptosis and cancer
  • Stem cells and cancer
  • HPV vaccines cancer epidemiology and chemoprevention
  • Environmental carcinogenesis
  • Animal models in cancer research and cancer chemotherapy

A minimum of 4 students is required to conduct this course.

This course is offered in Fall and Spring semesters, primarily to graduate students who have a background in basic Immunology. The format of the course is as a journal club wherein 2-3 papers will be discussed on a weekly basis on current immunology literature that has appeared in high-impact journals like Science, Nature, Nature Medicine, Nature Immunology, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Journal of Experimental Medicine, Journal of Immunology, Cell and Immunity.

The scientific paper discussion will include Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion and Bibliography. One of the most important aspects of this course is to train the student to critique research and to improve the quality of their research by incorporating novel concepts and techniques.

This course is designed to provide graduate students with a fundamental biomedical knowledge base in human pathology and an introduction to the study of the disease process. Particular emphasis will be given to the etiology, pathogenesis and description of gross and microscopic pathologic patterns occurring during the progress and outcome of major human diseases and conditions.

Students will be introduced to the experimental approach of the development and subsequently effective treatment of certain diseases, through the description of animal models simulating related pathologies. With the knowledge of normal histology, and by gaining familiarity of microscopic appearances through a hands-on experience at the lab small groups, students will develop observational and descriptive skills and ultimately deepen thier understanding of the underlying mechanisms of disease. By the description of the experimental methodologies, including the murine models of various diseases, they will formulate the causative approach in the study of disease.

Research Area Focus Groups

The research interests of our faculty fall under the following main thematic groups.

Expand all Inflammatory and Autoimmune Diseases

    - Epigenetic regulation of inflammatory and autoimmune diseases, including multiple sclerosis and autoimmune hepatitis. - Effect of microbiome in inflammatory diseases such as colitis, obesity and cancer. – Role of macrophage-induced inflammation in colon cancer. – Targeting skin inflammation in atopic dermatitis. – Interaction of primary antibody deficiency and inflammation caused by host-microbiome dysbiosis. – Role of aryl hydrocarbon receptor in lupus, MS and diabetes. – Involvement of macrophage-produced tumor necrosis factor alpha in preclinical models of colitis and colon cancer.
    – Effect of exercise in obesity and metabolic disorders. – Cellular and molecular mechanisms in induction of obesity and metabolic syndrome. - Cannabinoid receptor antagonists in the treatment of obesity. - Gut microbiome in obesity. – Role of exercise and obesity in muscle wasting disorders.
    – Use of chemoimmunotherapy in treatment of glioblastoma and neuroblastoma. – Targeting Sphingosine-1 phosphate in macrophages and mast cells for cancer therapy. – Role of microRNA in induction of apoptosis in tumor stem cells from neuroblastoma and melanoma. - Epigenetic regulation colon cancer by plant products. – Molecular mechanism underlying carinogenesis. – H. pylori induced carcinogenesis. – Characterization of spontaneous pain in colorectal cancer.
    – Epigenomic studies on the effects of plant products (resveratrol and cannabinoids) in the treatment of multiple sclerosis, colitis and obesity. – Effects of dietary supplements (indoles, etc.) on regulation the microbiome in colitis, acute lung injury, MS and obesity. – Role of exercise and dietary products (curcumin, quercetin and emodin) in breast and colon cancer as well as obesity-driven cancer progression. – Therapeutic efficacy of resveratrol and other AhR ligands on MS, lupus and diabetes. – Development of dietary quercetin to treat muscle wasting disorders. The effects of Ojeok-san on neuro-immune interactions in cancer-induced visceral pain.


Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Il enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is an immunological assay commonly used to measure antibodies, antigens, proteins e glicoproteine in biological samples. Some examples include: diagnosis of HIV infection, pregnancy tests, and measurement of cytokines or soluble receptors in cell supernatant or serum. ELISA assays are generally carried out in 96 well plates, allowing multiple samples to be measured in a single experiment. These plates need to be special absorbant plates (e.g. NUNC Immuno plates) to ensure the antibody or antigen sticks to the surface. Each ELISA measures a specific antigen, and kits for a variety of antigens are widely available.

The ELISA pictured in Figura 1 is what is known as a sandwich ELISA, here two sets of antibodies are used to detect secreted products, e.g. cytokines. The method is stepwise in the order shown. The 1st step is to coat the ELISA plate with capture antibody, any excess, unbound antibody is then washed from the plate. The capture antibody is an antibody raised against the antigen of interest.

Figura 1. ELISA method. Described above is a sandwich ELISA, showing the steps in the assay, numbered in order 1-4.

Next the campione (e.g. urine, serum, or cell supernatant) is added. Any antigen found in the sample will bind to the capture antibody already coating the plate. Samples are usually added in duplicate or triplicate (to allow for statistical analysis), and in varying concentrations to guarantee it falls within the levels of detection of the assay. Again any excess sample is washed from the plate.

In step 3, detection antibody is added. This antibody is labelled with an enzyme, usually horse radish peroxidase or alkaline phosphatase. Detection antibody binds to any target antigen already bound to the plate. Finally, a substrate is added to the plate. ELISA assays are usually chromogenic using a reaction that converts the substrate (e.g. TMB or ABTS) into a coloured product which can be measured using a plate reader.

Determination of antigen concentration in a sample requires production of a standard curve using antigens of a known concentration (shown in figura 2). The concentration of antigen in a sample can then be calculated using the optical density (OD).

figura 2. A typical standard curve. Shown is a standard curve for an IFN-γ ELISA. To work out the concentration of antigen in a sample, a standard curve using a solution of known concentration needs to be prepared.


How does a lateral flow test work?

LFDs use immunoassay technology using nitrocellulose membrane, coloured nanoparticles (or labels), and typically antibodies, to produce results.

When a sample is added, the sample will flow along the test device passing through the conjugate pad into the nitrocellulose membrane and then onto the absorbent pad.

The bullet points below demonstrate how a sandwich assay lavori. Alternatively, click the play button on this image to watch a video.