Informazione

In che modo il 2-mercaptoetanolo porta allo spostamento della banda a un peso molecolare più elevato?

In che modo il 2-mercaptoetanolo porta allo spostamento della banda a un peso molecolare più elevato?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ho un progetto per isolare una proteina con proprietà biologiche da una pianta. La proteina purificata forma quattro bande con peso molecolare simile su SDS-PAGE (30-35 kDa) in presenza del 5% di 2-mercaptoetanolo e due bande con MW inferiore (27-30 kDa) quando viene omesso il 2-mercaptoetanolo.

Come si spiegano questi risultati? Qual è il metodo più semplice e più economico per separare le proteine ​​strettamente correlate (se è quello che sono, e non solo le subunità di una singola proteina)?


Il 2-mercaptoetanolo (2ME) riduce i legami disolfuro nelle proteine. Se i legami disolfuro collegano due catene polipeptidiche ("intermolecolari"), allora 2ME le farebbe separare e quindi invece di una banda di peso molecolare (MW) più alto si otterrebbe una o più bande di MW più bassi.

Tuttavia, se ci sono legami disolfuro nella stessa catena polipeptidica, possono causare il ripiegamento della catena. Ciò fa sì che la catena polipeptidica abbia effettivamente un raggio idrodinamico più piccolo rispetto alla catena completamente denaturata. In tali casi la riduzione dei legami disolfuro utilizzando 2ME farebbe sì che la banda si sposti ad un MW più alto.

Qual è il metodo più semplice e più economico per separare proteine ​​strettamente correlate?

Questa è una domanda completamente diversa e ci sono diverse tecniche a seconda di quanto "dissimili" o "simili" siano le proteine ​​strettamente correlate. 2D PAGE (con focalizzazione isoelettrica) è una tecnica in grado di offrire una risoluzione maggiore rispetto a una normale SDS-PAGE. Esistono molti altri metodi cromatografici.


Risoluzione dei problemi: perché il peso molecolare delle proteine ​​osservato differisce da quello calcolato?

La prima fase del WB è l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), seguita dal trasferimento di proteine ​​su una membrana e successiva rilevazione con anticorpi specifici. Poiché la SDS-PAGE è condotta in condizioni denaturanti, le proteine ​​migrano in base ai loro pesi molecolari indipendentemente dalla loro struttura secondaria/terziaria, carica o interazioni proteina-proteina. Ciò significa che le proteine ​​più piccole migrano più velocemente di quelle più grandi.

Il peso molecolare previsto (MW) della proteina è la somma dei pesi molecolari di tutti gli amminoacidi proteici. È facile da calcolare, ad esempio, utilizzando lo strumento ExPASy online gratuito. Spesso il MW calcolato è diverso da quello osservato sul WB. Qui proviamo a riassumere i motivi più comuni per cui ciò può verificarsi (Figura 1).

Dimensioni insolite o inaspettate delle bande WB
1. Il peptide segnale (e un pro-peptide) viene scisso

Molte proteine ​​che subiscono il trasporto attraverso la via secretoria hanno peptidi segnale di 15-35 aa. lunghezza localizzata prevalentemente al loro N-terminale. Sono spesso scissi da varie proteasi durante il loro trasporto subcellulare. Ciò si traduce nella proteina matura in esecuzione a un peso molecolare inferiore al previsto. La presenza di peptidi segnale può essere prevista da vari strumenti online o sulla base di dati precedentemente pubblicati. Di solito sono ben annotati nei database di proteine, ad esempio UniProt. Inoltre, un sottoinsieme di proteine ​​ha pro-peptidi, domini proteici presenti nei precursori proteici. I precursori proteici devono essere processati dalle proteasi per generare un prodotto funzionale (senza pro-peptide).

Figura 2: PINK1 (23274-1-AP) è una chinasi mitocondriale serina/treonina-proteina che protegge le cellule dalla disfunzione mitocondriale indotta dallo stress. Il precursore di PINK1 (65 kDa) è sintetizzato nel citosol ed è importato nella membrana esterna dei mitocondri. PINK1 viene ulteriormente trasferito nella membrana interna dove viene scisso in una forma matura di 52 kDa.

Le caspasi, una famiglia di endoproteasi, sono attori fondamentali nelle reti di regolazione cellulare che controllano l'infiammazione e la morte cellulare. La caspasi 3 (19677-1-AP) esiste come una forma proenzimatica inattiva di 32 kDa (p32), che in seguito alla segnalazione apoptotica viene scissa in due subunità attive (p19/17 e p12) che si assemblano in un enzima tetramerico funzionale (PMID: 7596430 ).

Le proteine ​​della famiglia delle metalloproteinasi della matrice (MMP) sono coinvolte nella rottura della matrice extracellulare in molti processi fisiologici, inclusi lo sviluppo embrionale, la riproduzione, il rimodellamento dei tessuti e processi patologici come l'artrite o le metastasi. La maggior parte delle MMP sono secrete come proproteine ​​inattive che vengono attivate quando scisse dalle proteinasi extracellulari. Il pro-MMP9 inattivo (10375-2-AP) è 92 kDa. Viene scisso sequenzialmente da MMP3 in una forma elaborata di 68 kDa attraverso una forma intermedia - 78/82 kDa (PMID: 1371271). Inoltre, MMP9 può esistere anche come dimero da 180 kDa (PMID: 7492685).

2. Modifiche post-traduzionali (PTM)
A) Glicosilazione e glicanazione

La maggior parte delle proteine ​​che vengono sintetizzate sui ribosomi associati al reticolo endoplasmatico subiscono la glicosilazione. Ciò significa che un legame covalente di porzioni di zucchero viene aggiunto alla catena polipeptidica. I due tipi più comuni di glicosilazione negli eucarioti sono la glicosilazione legata all'N - ad asparagina e la glicosilazione legata all'O - alla serina e alla treonina. L'estesa glicosilazione aggiunge ulteriore peso molecolare, non incluso nella sequenza proteica originale, che fa migrare le proteine ​​più lentamente.

Figura 3: Il ligando 1 della morte cellulare programmata (PD-L1, CD274 o B7-H1) (66248-1-Ig) è una proteina transmembrana di tipo I, che agisce come regolatore chiave della risposta immunitaria adattativa. L'intero MW PD-L1 è di 33 kDa. Il peptide segnale viene scisso durante il trasporto della proteina alla membrana plasmatica e la proteina è fortemente N-glicosilata con un peso molecolare apparente di 45-70 kDa con la forma principale glicosilata di 45-50 kDa (PMID: 27572267).

Notare che: Una deglicosilazione enzimatica è una tecnica sperimentale comunemente usata per verificare se una proteina studiata è glicosilata. Prima del WB, il campione proteico viene incubato con un enzima in grado di rimuovere parti o intere catene di glicani. Le specie proteiche WB del campione digerito vengono quindi confrontate con il campione non digerito e qualsiasi cambiamento osservato nel peso molecolare indica la glicosilazione proteica. Un enzima comunemente usato è PNGase F che rimuove i glicani legati all'N scindendo il legame tra la N-acetilglucosamina più interna della catena glicanica e il residuo di asparagina.

CD133, noto anche come PROM1 (prominin-1) (18470-1-AP), è una glicoproteina transmembrana con un dominio extracellulare NH2-terminale, cinque anse transmembrana e una coda citoplasmatica. CD133 è una proteina altamente glicosilata con un peso molecolare apparente di 115-120 kDa. Dopo il trattamento dei lisati con PNGase F, CD133 si sposta in una proteina con un MW di 75-85 kDa. Ciò corrisponde al peso molecolare calcolato del CD133 deglicosilato (PMID: 23150174).

I proteoglicani sono un gruppo caso speciale di glicoproteine. Sono proteine ​​della matrice extracellulare con lunghe catene di glicosaminoglicani non ramificate attaccate in modo covalente al nucleo della catena amminopeptidica. Di solito, il peso molecolare del gruppo zuccherino è persino maggiore del componente proteico.

Figura 4: Decorin (14667-1-AP) è un membro della piccola famiglia di proteine ​​​​ricche di proteoglicani ricchi di leucina. Il precursore della decorina forma un intervallo di 43-47 kDa MW. Contiene un segnale peptidico N-terminale scindibile e può anche essere glicosilato. L'attaccamento dei glicosaminoglicani (condroitin solfato o dermatan solfato) alla decorina avviene nell'apparato di Golgi prima della secrezione della forma glicantata matura dalle cellule.

B) Fosforilazione

Una delle modifiche post-traduzionali più comuni è la fosforilazione delle proteine. Avviene su residui di serina, treonina e tirosina. La fosforilazione regola la funzione della proteina, la sua attività enzimatica, le interazioni proteina-proteina e la localizzazione delle proteine. La fosforilazione è catalizzata dalle fosfatasi e può essere reversibile: le proteine ​​fosforilate possono essere defosforilate dalle proteine ​​defosfatasi. L'aggiunta di un singolo gruppo fosforilico aggiunge +/- 1 kDa al MW, che è spesso oltre la risoluzione della SDS-PAGE standard. Tuttavia, più siti di fosforilazione possono portare a cambiamenti di MW più importanti.

Figura 5: La serina/treonina-proteina chinasi AKT svolge un ruolo in molti processi cellulari. I fattori di sopravvivenza possono sopprimere l'apoptosi in modo indipendente dalla trascrizione attivando la serina/treonina chinasi AKT1, che quindi fosforila e inattiva i componenti del meccanismo apoptotico. (60203-2-Ig rileva tutti i membri AKT con o senza fosforilazione, 66444-1-Ig rileva il fosfo-Ser473 di AKT1 e il fosfo-S474 di AKT2/phospho-Ser472 di AKT3.)

C) Ubiquitinazione

L'ubiquitinazione proteica significa che un'ubiquitina covalente viene aggiunta a lisina, cisteina, serina, treonina o direttamente alla proteina N-terminale. L'ubiquitina è una piccola proteina (+/-8.6 kDa) espressa in quasi tutti i tipi di tessuto. L'ubiquitinazione è una reazione enzimatica catalizzata da una cascata di tre enzimi (E1, E2 ed E3). Ciò fornisce la specificità del substrato e le fasi di attivazione, coniugazione e ligazione. Le proteine ​​possono essere monoubiquitinate (con una molecola di ubiquitina) o poliubiquitinate. La poliubiquitinazione avviene quando vengono aggiunte ulteriori molecole di ubiquitina alla molecola di ubiquitina iniziale. L'ubiquitinazione tramite il proteoma può contrassegnare le proteine ​​per la degradazione. È anche importante per la segnalazione cellulare, l'internalizzazione delle proteine ​​di membrana e lo sviluppo e la regolazione della trascrizione. L'ubiquitina può essere rimossa dalle proteine ​​mediante enzimi deubiquitinanti, che ne riducono il peso molecolare.

Figura 6: L'ubiquitina B (UBB) (10201-2-AP), un membro della famiglia dell'ubiquitina, è necessaria per la degradazione proteica intracellulare non lisosomiale ATP-dipendente di proteine ​​anormali e proteine ​​normali con un rapido turnover. Questo gene consiste di tre ripetizioni dirette della sequenza codificante dell'ubiquitina senza sequenza spaziatrice.

3. Complessi proteici

WB SDS-PAGE viene eseguito in condizioni riducenti. Ciò significa che la maggior parte dei complessi proteici composti da proteine ​​collegate tramite legami non covalenti si dissocia durante la preparazione del campione e l'elettroforesi e le proteine ​​(individuali) funzionano come monomeri. Tuttavia, alcune proteine ​​rimangono parzialmente o completamente presenti nei complessi omo o eteromerici, anche in presenza di SDS e -Mercaptoetanolo. In questo caso, il loro peso molecolare osservato può essere sostanzialmente superiore alla forma monomerica calcolata prevista. Alcune proteine, in particolare le proteine ​​transmembrana e le proteine ​​con domini idrofobici, possono aggregarsi durante la lisi cellulare quando vengono rilasciate dai loro complessi proteici nativi e dalle membrane lipidiche. Questi aggregati hanno pesi molecolari elevati e potrebbero non rappresentare interazioni che si verificano nei loro stati nativi.

Notare che: Il 20% di -Mercaptoetanolo (o 100 mM DTT) per il tampone campione 4X SDS potrebbe aiutare a rimuovere le bande non specifiche dovute alla dissociazione del complesso proteico.

Figura 7: NQO1 (11451-1-AP) è un enzima che funge da chinone reduttasi insieme alle reazioni di coniugazione degli idrochinoni coinvolti nelle vie di disintossicazione e nei processi biosintetici come la gamma-carbossilazione dipendente dalla vitamina K dei residui di glutammato nella sintesi della protrombina. NQO1 ha tre isoforme di 26, 27 e 31 kDa MW e la formazione di omodimeri (66-70 kDa) è necessaria per la sua attività enzimatica.

La proteina che interagisce con Mlx (MLXIP, nota anche come MONDOA) (13614-1-AP) agisce come fattore di trascrizione formando un eterodimero con la proteina MLX. Questo complesso si lega e attiva la trascrizione dalle scatole CACGTG E, svolgendo un ruolo nell'attivazione trascrizionale del bersaglio glicolitico e nella regolazione del gene sensibile al glucosio. MLXIP ha tre isoforme: 110, 57 e 69 kDa e il peso molecolare dell'eterodimero MLXIP-MLX è 130 kDa.

4. Isoforme proteiche

Molte proteine ​​codificate da un singolo gene esistono in più di una variante di sequenza, chiamate isoforme proteiche. Derivano da splicing alternativo durante la maturazione dell'mRNA. Gli esoni e gli introni selezionati possono essere inclusi/esclusi dal prodotto finale di mRNA. Le sequenze codificanti proteine ​​aggiuntive incluse possono riflettersi in prodotti proteici con MW più elevati. D'altra parte, l'aggiunta di sequenze può introdurre codoni di stop alternativi (prematuri), che portano a proteine ​​di peso molecolare inferiore. Alcune proteine ​​hanno più siti di inizio della traduzione, che danno origine a isoforme con diversi N-termini. Le isoforme proteiche possono avere una diversa emivita e localizzazione subcellulare. Possono interagire con diversi sottoinsiemi di proteine, formare complessi proteici distintivi e avere funzioni diverse, persino opposte.

Figura 8: GLS, noto anche come GLS1 e KIAA0838, appartiene alla famiglia delle glutaminasi. Tre isoforme di GLS, denominate KGA, GAM e GAC, variano nei loro modelli di espressione MW e tissutale (PMID: 11015561). KGA, glutaminasi di tipo renale, ha un MW di 65 kDa. GAC, glutaminasi C, è 58 kDa, essendo un prodotto dello splicing genico che provoca la perdita del dominio C-terminale presente in KGA. GAM è l'isoforma più corta senza attività catalitica e nasce dall'inclusione dell'introne 2 e del codone di stop prematuro. (12855-1-AP rileva le isoforme KGA e GAC, 20170-1-AP è specifico per KGA, 23549-1-AP è specifico per tutte e tre le isoforme (KGA, GAM, GAC) di GLS e 19958-1-AP è specifico per GAC.)

PARD3 (noto anche come ASIP, Par3 o Bazooka) è una delle proteine ​​della famiglia PARD coinvolte nella divisione cellulare asimmetrica e nella crescita polarizzata. PARD3 ha più isoforme di giunzione con tre principali: 100 kDa, 150 kDa e 180 kDa. (11085-1-AP riconosce tutte e tre le principali isoforme di PARD3.)

5. Ostacoli tecnici
A) Reattività crociata anticorpale

È possibile che l'anticorpo selezionato riconosca non solo la sua proteina bersaglio, ma anche una reazione crociata non specifica con altre proteine ​​nel campione analizzato. Per evitare questo problema, potremmo impostare un pannello di controllo appropriato e l'ottimizzazione del protocollo.

Controlli suggeriti:

- una proteina bersaglio purificata

- un lisato da una linea cellulare nota per esprimere la proteina bersaglio

- un lisato da una linea cellulare che sovraesprime la proteina bersaglio.

- lisati da linee cellulari con minore espressione della proteina bersaglio

- lisati da linee cellulari con la proteina bersaglio abbattuta (ad es. da siRNA o shRNA) o eliminata (ad es. da CRISPR).

Ottimizzazione sperimentale:
  • Tamponi di estrazione (ad es. tampone RIPA)
  • Tamponi bloccanti (ad esempio, latte scremato al 5%, caseina o BSA)
  • Tempi di incubazione e lavaggio (ad es. durante la notte a 4°C o 1,5 ore a temperatura ambiente)
  • Anticorpi secondari utilizzati per il rilevamento (ad es. fattore di diluizione)
  • Tipi di membrane (nitrocellulosa vs. PVDF).
B) Scissione proteolitica aspecifica e degradazione proteica

Le proteine ​​possono subire una digestione proteolitica non specifica se il campione proteico non viene gestito correttamente. Le proteasi rilasciate durante la lisi cellulare o l'estrazione dei tessuti possono causare la frammentazione delle proteine, con conseguente frammenti di peso molecolare inferiore. Alcune proteine ​​sono più suscettibili alla degradazione di altre. La scelta dei tamponi di lisi cellulare/tessuto e delle condizioni di lisi, insieme all'integrazione con inibitori della proteasi, sono elementi vitali per un'estrazione efficiente delle proteine.

Tabella riassuntiva

Peso molecolare osservato

Cause potenziali

Più alto del previsto

1. Modifiche post-traduzionali.

2. L'anticorpo sta rilevando un'isoforma proteica con una sequenza più lunga.

Inferiore al previsto

1. Scissione del peptide segnale.

2. L'anticorpo sta rilevando un'isoforma proteica con una sequenza più corta.

3. Scissione proteica non specifica.

Più di una banda osservata

2. Un prodotto proteico ma con diverse modificazioni post-traduzionali.

3. L'anticorpo sta rilevando proteine ​​con e senza pro-peptide.

5. Reattività crociata anticorpale, potenzialmente dovuta all'omologia della sequenza immunogena.


L'acaro della polvere Der p 1 riduce le difese del polmone inattivando gli inibitori dell'elastasi

Gli acari della polvere domestica (HDM) sono la fonte più comune di aeroallergeni e negli individui geneticamente predisposti possono causare sintomi che vanno dalla dermatite atopica all'asma bronchiale. Der p 1, uno dei principali bersagli delle risposte immunitarie umane all'HDM, attraverso le sue proprietà enzimatiche può modulare il sistema immunitario adattativo mediante la scissione di CD23 e CD25. Le conseguenze di ciò sarebbero promuovere risposte infiammatorie allergiche. Inoltre, interrompendo le giunzioni strette epiteliali Der p 1 facilita il trasporto dell'allergene attraverso l'epitelio. Qui, segnaliamo che Der p 1 ha effetti aggiuntivi sui meccanismi di difesa innati del polmone, inattivando in vitro e ex vivo gli inibitori dell'elastasi umano (h) inibitore dell'α1-proteinasi (h-A1-Pi), topo (m-), (ma non umano [h])-SLPI e h-elafin. Confermiamo che Der p 1 contiene sia cisteina che serina proteinasi ed estendiamo questa scoperta per dimostrare per la prima volta che l'h-elafina è particolarmente sensibile all'attività biologica di quest'ultima. Poiché questi inibitori dell'elastasi hanno attività antimicrobica e antielastasi, i nostri risultati suggeriscono che l'inattivazione di questi componenti innati del sistema di difesa polmonare da parte di Der p 1 può aumentare la suscettibilità alle infezioni dei pazienti con infiammazione allergica.

L'asma è una malattia ostruttiva cronica delle vie aeree inferiori caratterizzata da esacerbazioni intermittenti di ostruzione reversibile delle vie aeree, infiammazione delle vie aeree e iperreattività bronchiale (1). La risposta immunitaria cronica nell'asma e in altre malattie atopiche è caratterizzata da una risposta prevalentemente delle cellule T Th2, associata alla produzione di interleuchina (IL)-4, IL-5, IL-13 e IgE (1). Sebbene un terzo di tutti i casi di asma possa essere caratterizzato come non allergico intrinseco, dove l'agente scatenante è sconosciuto (2), è chiaro che nella maggior parte dei casi di asma (estrinseco) il fattore scatenante è di origine allergenica, con una forte componente atopica (3).

La prevalenza dell'asma varia negli studi tra il 5 e il 25% (1) ed è raddoppiata nel mondo industrializzato negli ultimi 20 anni (4). I fattori implicati in questo aumento della prevalenza includono un ambiente interno alterato come alloggi più caldi, un maggiore uso di antibiotici ad ampio spettro con profili di infezione batterica alterati, cambiamenti nella dieta e una maggiore esposizione agli aeroallergeni.

È stato dimostrato che l'esposizione a un certo numero di aeroallergeni contribuisce sia all'ipersensibilità immediata che all'asma cronico, tra questi i comuni allergeni indoor prodotti dall'acaro della polvere domestica (HDM). Nella malattia atopica umana, le risposte infiammatorie agli antigeni del gruppo I di Dermatophagoides pteronyssinus e Dermatophagoides farinae (Der p 1 e Der f 1) sono ben documentati (5-6).La Der p 1 cisteina proteasi è una glicoproteina di 25 kD presente in quantità significative nei pellet fecali HDM, e si suggerisce che abbia un ruolo digestivo nell'intestino dell'acaro. Numerosi studi recenti hanno dimostrato che Der p 1 è in grado di scindere le proteine ​​umane con potenziali effetti immunomodulatori tra cui l'inibitore dell'α1-proteinasi (A1-Pi), (7), CD23 (il recettore IgE umano a bassa affinità) (8), CD25 (la subunità α del recettore umano dell'IL-2) (9) e giunzioni strette dell'epitelio bronchiale, che portano ad un aumento della permeabilità epiteliale bronchiale (10). Oltre all'A1-Pi (11-12), il polmone secerne anche l'inibitore della proteinasi secretoria dei leucociti (SLPI) e l'elafina, che contribuiscono significativamente non solo all'attività antielastasi ma anche all'attivazione dell'immunità innata (13- 16). Ad esempio, utilizzando una strategia di sovraespressione di adenovirus, abbiamo recentemente riportato che l'elafin ha attività chemiotattiche per i neutrofili e protegge il polmone in modo Pseudomonas aeruginosa modello di infiammazione acuta (17-18).

Di conseguenza, abbiamo cercato di indagare nel presente studio se Der p 1 fosse in grado di inattivare queste importanti antiproteasi e di conseguenza potesse spostare l'"equilibrio elastasi-antielastasi" a favore di un ambiente proinfiammatorio per facilitare sia l'inizio che il mantenimento del risposta asmatica.

Abbiamo dimostrato qui che tutte e tre le antiproteasi studiate possono essere potenzialmente degradate da Der p 1 in vitro e ex vivo. Inoltre, abbiamo studiato in dettaglio le proprietà enzimatiche di Der p 1 contro substrati sintetici e inibitori selettivi per chiarire la natura delle proteasi che inattivano le difese antiproteasiche innate. Di conseguenza, abbiamo scoperto che oltre alla ben caratterizzata cisteina proteinasi presente in Der p 1, una serina proteasi co-purificante è estremamente attiva contro l'elafina umana.

L'A1-Pi umano (h) è stato acquistato da Sigma (Poole, Dorset, Regno Unito) e l'elafina sintetica umana (h) è stata prodotta da Albachem (Edimburgo, Regno Unito) come descritto in precedenza (19). Lo SLPI umano ricombinante (h) è stato acquistato da R&D Systems (Minneapolis, MN) e il murino ricombinante (m)-SLPI è stato un regalo del Dr. C. Wright (Amgen, Thousand Oaks, CA). L'elastasi neutrofila umana (HNE) è stata ottenuta da Elastin Products (Owensville, MO). E-64 (L-trans-epoxysuccinyl-leucyl-amido[4-guanidino]butane Sigma) è un inibitore irreversibile diretto al sito attivo delle proteasi della cisteina che inibisce Der p 1 (20).

Il fluido di lavaggio broncoalveolare umano (BALF) di sei pazienti con sindrome da distress respiratorio acuto accertato (21) è stato un dono generoso del Dr. S. Donnelly. I campioni sono stati raggruppati e incubati con Der p 1, come descritto di seguito.

Sessanta grammi di polvere di acari della polvere domestica (dono del Dr. T. Wayne, Università di Perth, Perth, Australia) sono stati sciolti in 1 litro di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) (senza calcio e magnesio) contenente 0,5 M NaCl, 0,01% (peso/peso) di sodio azide, pH 7,4. L'anticorpo monoclonale di topo anti-Der p1 4C1 (Indoor Biotechnologies, Clwyd, UK) è stato accoppiato a 5 g di Sepharose 4B attivato con cianogeno (Amersham Biosciences UK Limited, Pollard's Wood, Buck, UK), sospeso e lavato in una colonna di affinità secondo alle istruzioni del produttore. Alla colonna sono stati applicati cento millilitri di soluzione Der p 1 ad una portata di 20 ml/h. La colonna è stata lavata con 400 ml di PBS 0,5 M NaCl e l'eluizione è stata eseguita a 20 ml/h utilizzando glicina 5 mM in glicole etilenico 50% pH 10,0. Le frazioni sono state analizzate per l'assorbanza a 280 nm e sono state ampiamente dializzate per 18 ore contro 10 litri di PBS. Queste frazioni saranno indicate con CS-Der p 1 per il resto dello studio. Un'ulteriore purificazione è stata eseguita su metà del dializzato applicandolo su una colonna di affinità contenente 100 mg di inibitore della tripsina di soia (SBTI) accoppiato a 5 g di Sepharose 4B attivato con cianogeno (Pharmacia Biotech), secondo le istruzioni del produttore. Le frazioni sono state raccolte e riesaminate per l'assorbanza a 280 nm per raccogliere Der p1 impoverito di serina-proteasi e ridializzate ampiamente contro PBS. Der p 1, che era stata impoverita della serina proteasi da questo processo, è stata indicata come C-Der p 1 per il resto dello studio. La concentrazione proteica di entrambi C/CS-Der p 1 è stata valutata utilizzando un saggio su piastra di acido bicinconinico (Pierce and Warriner Ltd., Chester, Cheshire, UK). La purezza dei preparati è stata valutata utilizzando la migrazione su analisi SDS-PAGE al 12% (gel colorati con l'utilizzo di Biorad Silver Stain). I campioni sono stati conservati in aliquote a –20°C.

Una gamma di substrati fluorescenti sintetici (Novabiochem, Nottingham, UK) è stata utilizzata per analizzare la selettività del substrato Der p 1 e includeva Cbz-Arg-Arg-AMC, H-Arg-AMC, Cbz-Phe-arg-AMC, Boc-Gln -Ala-Arg-AMC, Tosyl-Gly-Pro-Arg- AMC, H-Pro-Phe-Arg-AMC, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC (22) e Suc-Gly-Pro-Leu- Gly-Pro-AMC (23). Sono stati sciolti in dimetilsolfossido (DMSO) per generare uno stock di 10 mM e l'idrolisi di ciascun substrato (10 μM finale) di 6 μg di CS-Derp1 è stata eseguita in triplicato in 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) contenente 5 mM cisteina e 2% di DMSO. L'idrolisi è stata misurata monitorando il rilascio di AMC ogni 10 s per 2 min, utilizzando un mini-fluorimetro Hoeffer TK 100 (lunghezza d'onda di eccitazione di 365 nm e rilevamento delle emissioni a 465 nm, San Francisco, CA). Le concentrazioni del substrato sono state mantenute costanti consentendo un'idrolisi non superiore al 5%. La velocità di idrolisi è stata determinata mediante analisi di regressione lineare utilizzando il programma software SIGMA PLOT, versione 4.00. La concentrazione di AMC è stata determinata dalla retta di regressione: [AMC] = (y − c)/m, dove y è l'unità fluorescente rilasciata dall'idrolisi, c è l'intercetta e m è la pendenza della retta di regressione.

Il profilo del pH di CS-Derp1 purificato rispetto ai substrati sintetici Boc-Gln-Ala-Arg-AMC e Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC è stato determinato nei seguenti tamponi:

Tampone acido citrico/citrato di sodio 0,1 M (pH 3–6), tampone fosfato 0,1 M (pH 6–8) e Tris-HCl 0,5 M (pH 8–9,5). Tutte le reazioni sono state eseguite in presenza di cisteina 5 mM.

La costante di velocità (Km) di CS-Der p 1 per substrati sintetici è stato determinato monitorando le velocità iniziali di idrolisi al pH ottimale per ciascun substrato. L'intervallo di concentrazioni di substrato utilizzato per Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, Tosyl-Gly-pro-Arg-AMC e Cbz-Phe-Arg-AMC era 0-600 μM, 0-10 μM e 0-100 μM, rispettivamente. I tassi iniziali di idrolisi (Vo) sono stati tracciati rispetto alle diverse concentrazioni di substrato [S] per garantire che fosse visibile la curvatura. I dati sono stati anche rappresentati come una linea retta utilizzando il diagramma di Hanes-Woolf, quindi è stato applicato all'equazione della velocità di Michaelis-Menten come descritto di seguito utilizzando un programma di analisi di regressione non lineare, in SIGMA PLOT versione 4.00, per ottenere il Km e velocità iniziale massima (Vmax).

Le attività enzimatiche di CS-Der p 1 e C-Der p 1 sono state ulteriormente caratterizzate dall'inibizione differenziale utilizzando rispettivamente E64 e APMSF, inibitori della cisteina e della serina proteinasi. CS-Der p 1 e C-Der p 1 sono stati preincubati con 10 μM E64 o 100 μM APMSF prima di analizzare l'attività residua come descritto sopra utilizzando Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (10 μM finale in tampone fosfato 0,1 M pH 6,0 ) o Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC (10 μM finale in 0,5 M Tris-HCl pH 8,0). Tutti i tamponi contenevano 5 mM di cisteina.

I campioni di proteine ​​sono stati inviati a SDS-PAGE e/o analizzati mediante analisi Western Blot come descritto (24). In breve, dopo il trasferimento elettroforetico su membrane di nitrocellulosa Hybond (Amersham, Bucks, UK), le membrane sono state sondate in sequenza con IgG di coniglio anti-h-elafina (diluizione 1:1.000, 1 h di incubazione a temperatura ambiente) e anti-capra coniugato con perossidasi di rafano. -coniglio IgG (diluizione 1:2.500, 20 min a temperatura ambiente Dako, Ely, Cambridgeshire, UK). I Western blot sono stati sviluppati mediante chemiluminescenza potenziata (kit ECL Amersham).

Tampone 50 mM Tris 0,5 M NaCl 0,1% Triton pH 8 è stato aggiunto a quantità definite di HNE su una piastra ELISA a 96 pozzetti (Linbro Flow Laboratories, McLean, VA) fino a un volume di 200 μl. Cinquanta microlitri di substrato di elastasi sintetica N-metossisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilide (Sigma) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e la scissione del substrato è stata monitorata attraverso la variazione dell'assorbanza (a 405 nm), misurata spettrofotometricamente, a punti temporali definiti, utilizzando un lettore di lastre Dynex MRX II (Dynatech, Billinghurst, UK).

L'attività anti-HNE delle soluzioni di prova (proteine ​​purificate o BALF) è stata valutata aggiungendo la soluzione alla miscela HNE/tampone, mantenendo un volume totale di 200 μl. La piastra è stata quindi incubata per 15 min a 37°C prima dell'aggiunta del substrato come descritto sopra. È stato dimostrato che le frazioni Der p 1, ditiotreitolo (DTT) e L-cisteina, da sole o in combinazione, non hanno influenzato il tasso di scissione HNE del substrato (dati non mostrati).

Abbiamo prima cercato di stabilire le specificità enzimatiche della nostra preparazione di CS-Der p 1, dopo la purificazione dalla colonna di cromatografia di affinità 4C1. Sono stati utilizzati diversi substrati sintetici come elencato nella Tabella 1

TABELLA 1 Specificità del substrato di CS-Der p 1

La specificità del substrato di CS-Der p 1 è stata analizzata utilizzando un numero di substrati fluorogenici sintetici (concentrazione finale di 10 μM). Tutti i saggi sono stati eseguiti in Tris-HCl 0,5 M pH 8,0 contenente cisteina 5 mM. I risultati sono espressi come nM di 7-amino-4-metilcumarina (AMC) rilasciati/s/mg ± DS.

L'affinità di queste proteasi è stata ulteriormente studiata nella Figura 1

Figura 1. Grafici di Michaelis-Menten e Hanes-Woolf per l'idrolisi di Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC e Cbz-Phe-Arg-AMC di CS-Der p 1. Il curve in UN, C, e E rappresentano il tasso iniziale di idrolisi (V0) di Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC e Cbz-Phe-Arg-AMC di CS-Der p 1. I corrispondenti grafici Hanes-Woolf sono mostrati in B, D, e F. Il Km e Vmax sono stati determinati adattando i dati alla forma iperbolica dell'equazione della velocità nel programma di regressione non lineare di SIGMAPLOT 4.00.

Figura 2. Profili inibitori di CS-Der p 1 (UN, B) e C-Der p 1 (C) attività di E64 e APMSF. CS-Der p 1 e C-Der p 1 sono stati inibiti in modo differenziale mediante preincubazione con 10 μM E64 e 100 μM APMSF prima di analizzare l'attività residua utilizzando Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (UN, C) o Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC (B) a pH 6.0 o pH 8.0, rispettivamente. Tutti i tamponi contenevano 5 mM di cisteina. I risultati sono espressi come tassi iniziali di idrolisi (pM/s) misurati in un periodo di 2 minuti. ND, non rilevato.

Avendo stabilito che CS-Der p 1 conteneva sia componenti della serina proteasi che della cisteina proteasi, abbiamo separato entrambe le attività sottoponendo la frazione CS-Der p 1 alla cromatografia di affinità SBTI.

Il risultante C-Der p 1 purificato è stato quindi testato sia su Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC che su Boc-Gln-Ala-Arg-AMC. Abbiamo scoperto che C-Der p 1 era attivo contro Boc-Gln-Ala-Arg-AMC e solo E-64 ha abolito tale attività (Figura 2C). Non c'era attività registrabile contro Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC (dati non mostrati), stabilendo che in effetti, C-Der p 1 conteneva solo l'attività della cisteina proteinasi.

Avendo dimostrato enzimaticamente che CS-Der p 1 conteneva attività sia di cisteina che di serina proteasi (Tabella 1 e Figure 1, 2A e 2B), mentre C-Der p 1 conteneva solo la prima (Figura 2C), l'attività di entrambe le frazioni sugli inibitori dell'elastasi polmonare h-A1-Pi, h-elafin, h-SLPI e m-SLPI è stato studiato.

L'interazione di Der p 1 (CS e C) con h-A1-Pi è stata analizzata mediante SDS-PAGE: Figura 3A

Figura 3. Inattivazione di h-A1-Pi da Der p 1. (UN) Degradazione di h-A1-Pi da Der p 1 (analisi SDS-PAGE). h-A1-Pi (2 μg) è stato incubato con C/CS-Der p 1 (2 h a 37°C), con o senza L-Cys (20 mM) ed E-64 (0,4 mM). Dopo precedenti esperimenti pilota (non mostrato) è stato scelto un rapporto molare Der p1/h-A1-Pi di 2.0:1. I campioni sono stati diluiti con tampone di caricamento (SDS e 2-mercaptoetanolo) ed è stata eseguita l'analisi SDS-PAGE (gel 12%). Corsia 1, solo h-A1-Pi corsia 2, h-A1-Pi + L-Cys corsia 3, h-A1-Pi + CS-Der p 1 + L-Cys corsia 4, h-A1-Pi + CS-Der p 1 + L-Cys + E-64 corsia 5, h-A1-Pi + C-Der p 1 + L-Cys corsia 6, h-A1-Pi + C-Der p 1 + L-Cys + standard E-64 i pesi molecolari (kD) sono indicati da frecce. (B) Inattivazione funzionale di h-A1-Pi da Der p 1 misurata dall'attività residua di HNE. h-A1-Pi è stato incubato (0, 1, 2, 4 h) a 37°C con Der p 1(C/CS) e L-Cys (20 mM), con o senza E-64 (0,4 mM). Sulla base dell'analisi del gel è stato scelto un rapporto molare Der p 1/h-A1-Pi di 2.0:1 (UN). Al termine dell'incubazione, la miscela è stata aggiunta all'HNE purificato (25 ng) per ulteriori 15 minuti di incubazione a 37°C, prima di aggiungere il substrato HNE N-metossisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide . Dopo 15 minuti, l'assorbanza è stata letta a 405 nm. I risultati sono espressi come % di attività HNE, dove HNE è stato incubato con il solo tampone di controllo (50 mM Tris 0,5 M NaCl, 0,1% Triton X, pH 8,0). Piazze, Do-Dr p 1 + MI-64 diamanti, CS-Dr p 1 + MI-64 cerchi, C-Der p 1 triangoli, CS-Der p 1.

Lo stesso rapporto Der p 1/A1-Pi è stato utilizzato per il saggio funzionale in cui è stata misurata l'attività anti-HNE residua di h-A1-Pi (Figura 3B).

In tutti i momenti (0, 1, 2, 4 h), i risultati sono espressi come percentuale dell'attività residua dell'HNE, rispetto all'HNE incubato con il solo tampone. Rispecchiando i risultati dell'analisi SDS-PAGE, abbiamo osservato che sia CS-Der p 1 che C-Der p 1 hanno inattivato funzionalmente h-A1-Pi (come determinato dall'aumento dell'attività HNE nel tempo). L'incubazione di Der p 1 con E-64 ha impedito l'inattivazione di h-A1-Pi perché l'attività di HNE è rimasta minima durante l'esperimento, dimostrando ancora una volta che in effetti la cisteina proteinasi di Der p 1 è responsabile dell'attività. È stato anche dimostrato che Der p 1 e L-cys, da soli o in combinazione, non influenzano l'attività dell'HNE (non mostrato).

L'interazione tra Der p 1 e h-elafin è stata analizzata come descritto sopra, utilizzando SDS-PAGE e analisi Western blot (Figura 4A)

Figura 4. Inattivazione di h-elafin da Der p 1. (UN) Scissione di elafin da Der p 1 (analisi SDS-PAGE/Western Blot). Superiore: 0,5 μg di h-elafin sono stati incubati con C-Der p 1 (2 h a 37°C) e L-Cys (20 mM). Sono stati utilizzati diversi rapporti molari C-Der p 1/elafin: 0,5:1 (corsia 4), 0.1:1 (corsia 5), 0.05:1 (corsia 6), 0.01:1 (corsia 7), e 0,005:1 (corsia 8). h-Elafin è stato anche incubato da solo (corsia 1), con L-Cys 20 mM (corsia 2), o con C-Der p 1 in assenza di L-Cys (corsia 3). I campioni sono stati diluiti con tampone di caricamento (SDS e 2-mercaptoetanolo) ed è stata eseguita l'analisi SDS-PAGE (gel al 15%). Dopo l'elettroblotting, le membrane sono state successivamente sondate con anticorpi IgG anti-h-elafina (1/1.000 diluizione, 1 h) e IgG anti-coniglio di capra (1/5.000 diluizione, 20 min) accoppiate a perossidasi di rafano. Le macchie sono state rivelate utilizzando il reagente ECL (Amersham). Parte inferiore: Come sopra, eccetto che CS-Der p 1 è stato utilizzato al posto di C-Der p 1. Rapporto molare CS-Der p1/elafin utilizzato: 0,5:1 (corsia 4), 0.1:1 (corsia 5), 0.05:1 (corsia 6), 0.01:1 (corsia 7), e 0,005:1 (corsia 8). Elafin è stato anche incubato da solo (corsia 1), con L-Cys 20 mM (corsia 2), o con CS-Der p1 in assenza di L-Cys (corsia 3, rapporto molare CS-Der p 1/elafin = 1:1). (B) Inattivazione funzionale di h-elafin da Der p 1 misurata dall'attività HNE residua. h-elafin è stata incubata (0, 1, 2, 4 h) a 37°C con Der p 1(C/CS) e L-Cys (20 mM), con o senza E-64 (0,4 mM). Sulla base dell'analisi del gel è stato scelto un rapporto molare Der p 1/h-elafin di 0,3:1 (UN). Al termine dell'incubazione, è stata misurata l'attività anti-HNE residua di h-elafina come descritto nella Figura 3 . Piazze, Do-Dr p 1 + MI-64 diamanti, CS-Dr p 1 + E-64 cerchi, C-Dr p 1 triangoli, CS-Der p 1.

La scissione di h-elafin è stata ottenuta con un rapporto CS-Der p1/h-elafin di 0,5:1 (Figura 4A, parte inferiore, corsia 4). La diminuzione del rapporto ha portato alla graduale conservazione dell'integrità dell'h-elafina (Figura 4A, parte inferiore, corsie 4–8). L-Cys da solo non ha influenzato la migrazione di h-elafina (corsia 2). In modo molto significativo, l'interazione tra CS-Der p 1 e h-elafin in assenza di L-Cys induceva ancora la degradazione di h-elafin (Figura 4A, parte inferiore, corsia 3), suggerendo che l'attività di degradazione dell'h-elafina è almeno in parte dovuta alla serina proteasi contenuta in CS-Der p 1.

Presumibilmente, C-Der p 1, che ha solo attività di cisteina proteinasi, necessitava di attivazione con L-Cys per essere in grado di degradare h-elafina (Figura 4A, superiore, corsie 4–8, paragonato a corsia 3, senza L-Cys). Presi insieme, i dati qui presentati suggeriscono che le attività di serina e cisteina di Der p 1 sono entrambe in grado di degradare l'h-elafina.

Per il saggio funzionale ( Figura 4B ), è stato scelto un rapporto molare "intermedio" Der p 1/h-elafin di 0,3:1 sulla base del fatto che un rapporto di 0,5:1 scinde la maggior parte della molecola nativa di elafina dopo 2 ore (Figura 4A, corsia 4), mentre un rapporto di 0,1:1 era meno efficiente ( Figura 4A , corsia 5).

I risultati rivelano che sia CS-Der p 1 che C-Der p 1 hanno inattivato funzionalmente h-elafina. L'incubazione di CS-Der p 1 con E-64 non è riuscita a prevenire l'inattivazione di h-elafina, supportando i risultati dell'analisi Western blot secondo cui la serina proteasi contribuisce in modo molto significativo all'attività di degradazione dell'h-elafina nella frazione CS. Tuttavia, C-Der p 1, che ha solo l'attività della cisteina proteinasi, ha perso la sua attività di inattivazione dell'h-elafina dopo l'incubazione con E-64, suggerendo che sia la serina che la cisteina proteasi hanno la capacità di inattivare l'h-elafina.

Figura 5. Interazioni Der p1/h-SLPI. (UN) Incubazione di C-Der p 1 con h-SLPI nativo (analisi SDS-PAGE). Due microgrammi di h-SLPI sono stati incubati (2 h a 37°C) con C-Der p 1 e L-Cys (20 mM), con (corsia 4) o senza (tutte le altre corsie) E-64. Sono stati utilizzati due diversi rapporti molari C-Der p1/h-SLPI: 0,5:1 (corsie 3-5) e 1 (corsia 6). h-SLPI è stato anche incubato da solo (corsia 1) o con L-Cys (corsia 2). I campioni sono stati quindi analizzati mediante SDS-PAGE (15% gel) come spiegato sopra. (B) Incubazione di CS-Der p 1 con h-SLPI nativo (analisi SDS-PAGE). Rapporti molari CS-Der p 1/h-SLPI: 0,5:1 (corsie 3-5), 1:1 (corsia 6) e 0,25:1 (corsia 7). Corsia 1, h-SLPI da solo corsia 2, h-SLPI + L-Cys corsia 3, h-SLPI + CS-Der p 1 corsia 4, h-SLPI + CS-Dr p 1 + E-64 corsia 5, h-SLPI + CS-Der p 1 + L-Cys corsie 6 e 7, come corsia 5 (ma diversi rapporti molari, vedi sopra). N.B.: La banda contrassegnata con an asterisco è un contaminante rilevato in alcune preparazioni di ricerca e sviluppo h-SLPI. I numeri 7.2 e 32 rappresentano il peso molecolare (kD) degli standard. (C) Incubazione di CS/C-Der p 1 con h-SLPI nativo o denaturato (senza o con incubazione con DTT) (analisi SDS-PAGE). Sinistra: nessuna preincubazione DTT: 2 μg di h-SLPI sono stati incubati (2 ore a 37 ° C) con C/CS-Der p 1 e L-Cys (20 mM), con o senza E-64. Il rapporto molare C/S-Der p1/h-SLPI era 0,5:1. Corsia 1, h-SLPI da solo corsia 2, h-SLPI + L-Cys + C-Der p 1 corsia 3, h-SLPI + C-Der p 1 + L-Cys + E-64 corsia 4, h-SLPI + CS-Der p 1 + L-Cys corsia 5, h-SLPI + CS-Der p 1 + L-Cys + E-64. I campioni sono stati quindi analizzati mediante SDS-PAGE (gel al 15%) come sopra. Destra: Preincubazione DTT: 2 μg di h-SLPI sono stati preincubati per 30 minuti a 37 ° C con DTT 2 mM. La miscela h-SLPI è stata quindi incubata (2 ore a 37°C) con le stesse molecole di cui sopra. Corsie: come sopra. N.B.: Il contaminante R&D in h-SLPI, sebbene presente, è qui meno evidente. I numeri 7.2 e 32 rappresentano, come sopra, standard di peso molecolare (kD).

Utilizzando un rapporto molare C/CS-Der p 1/SLPI di 0,5: 1, la preincubazione di h-SLPI con 2 mM DTT lo ha reso suscettibile a un'ulteriore scissione da parte di entrambi C-Der p 1 (confrontare la Figura 5C, sinistra e Giusto, corsia 2) e CS-Der p 1 (confronta la Figura 5C , sinistra e Giusto, corsia 4). Alle diluizioni del DTT utilizzate nell'esperimento, abbiamo verificato che il DTT stesso non influisse sull'attività di Der p 1 (non mostrato). È interessante notare che sia C-Der p 1 ( Figura 5C , Giusto, corsia 3) e CS-Der p 1 attività ( Figura 5C , Giusto, corsia 5) sono stati aboliti in misura simile con E-64, suggerendo che è la cisteina proteasi di Der p 1, che svolge un ruolo nella degradazione dell'h-SLPI trattato con DTT.

Contrariamente a h-SLPI (Figura 5), ​​m-SLPI era molto sensibile all'inattivazione di CS-Der p 1 (Figura 6)

Figura 6. Degradazione dell'm-SLPI nativo da Der p 1 (analisi SDS-PAGE). Sono stati incubati due microgrammi di m-SLPI (2 ore a 37°C) con o senza CS-Der p 1 e con o senza L-Cys (20 mM). Un rapporto molare CS-Der p 1/m-SLPI di 0,5:1 è stato scelto da precedenti esperimenti pilota. Corsia 1, m-SLPI da solo corsia 2, m-SLPI + CS-Der p 1 corsia 3, come corsia 2 + L-Cis corsia 4, m-SLPI + L-Cis corsia 5, CS-Der p 1 da solo. I campioni sono stati diluiti e sottoposti ad analisi SDS-PAGE (15% acrilammide) come sopra. N.B.: m-SLPI corre come doppietta. I pesi molecolari standard (kD) sono indicati da frecce.

Poiché i tre inibitori dell'elastasi umani A1-Pi, elafin e SLPI studiati sopra sono gli unici tre principali inibitori dell'elastasi finora identificati nel polmone, ci è stato chiesto di verificare se Der p 1 fosse in grado di inattivare la capacità di inibizione dell'elastasi nell'uomo BALDO. Poiché i pazienti con sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) hanno un livello molto alto di antiproteasi attive nel loro BALF (21), abbiamo scelto di studiare un pool di sei campioni di BAL.

Come dimostrato nel nostro studio precedente (21), mostriamo qui che il BALF non trattato ha avuto una marcata attività anti-HNE nel corso del tempo dell'esperimento, con un'inibizione dell'HNE compresa tra l'85 e il 98%. L'incubazione di BALF con L-Cys da sola non ha modificato questa attività. Al contrario, sia C-Der p 1 che CS-Der p 1, quando incubati con L-Cys, hanno degradato l'attività anti-HNE di questo pool di BALF (Figura 7)

Figura 7. Inattivazione di campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare umano (BALF) con Der p 1. Venti microlitri di BALF da pazienti con ARDS accertata (vedere M ateriali e metodi) sono stati incubati (0, 1, 2, 4 h) con 7,5 μg (1,2 μM) Der p 1 (C/CS) e L-Cys (20 mM), con o senza E-64 (0,4 mM), in un volume finale di 250 μl. Dopo l'incubazione, 10 μL della miscela di incubazione sono stati aggiunti a 10 ng di HNE nei pozzetti della micropiastra e, dopo un'ulteriore incubazione di 15 minuti a 37 ° C, è stato aggiunto il substrato di HNE come spiegato sopra. Piazze, BALF da solo diamanti, BALF + L-Cis cerchi, BALF + CS-Der p 1 + L-Cys + E-64 triangoli, BALF + CS-Der p 1 + L-Cys quadrati con segni più, BALF + C-Der p 1 + L-Cis.

Der p 1 è uno degli aeroallergeni più comuni associati all'asma atopico (25-26). Numerosi studi recenti hanno implicato l'attività della cisteina proteasi di Der p 1 nella patogenesi dell'asma (7-10). Nel presente articolo abbiamo esplorato ulteriori questioni relative alle proprietà enzimatiche di Der p 1 in relazione alla sua attività sulle molecole di difesa polmonare A1-Pi, SLPI ed elafin.

La principale proteina presente nel Der p 1 purificato per affinità convenzionalmente, che qui abbiamo chiamato CS-Der p 1, è senza dubbio una proteinasi cisteina, come evidenziato dalla purezza del gel colorato con argento e dal sequenziamento N-terminale (7, 27). Tuttavia, lavori precedenti suggerivano la presenza di un contaminante di proteasi serina minore in quella preparazione, che è stato rimosso con un ulteriore passaggio di cromatografia di affinità SBTI (28-30). I nostri risultati confermano ed estendono questi risultati mostrando, utilizzando un'ampia varietà di substrati sintetici, che effettivamente le attività di cisteina e proteasi coesistono in CS-Der p 1 e che il passaggio aggiuntivo SBTI ha rimosso il contaminante della serina proteasi, perché la proteina rimanente (C -Der p 1) è stato solo in grado di degradare il substrato di cisteina proteasi (Figura 2). Tuttavia, non siamo stati in grado di purificare e identificare il componente serina proteasi, probabilmente a causa della sua altissima affinità per SBTI, che rende molto difficile l'eluizione dalla colonna (A. Brown, dati non pubblicati).

A causa dell'importanza degli inibitori dell'elastasi A1-Pi, elafin e SLPI come molecole chiave nella difesa del polmone (13), siamo stati spinti a determinare se CS-Der p 1 e C-Der p 1 fossero in grado di per inattivare biochimicamente e funzionalmente queste molecole.

In accordo con il nostro precedente studio (7), abbiamo scoperto che CS-Der p 1 potrebbe inattivare h-A1-Pi e abbiamo ulteriormente stabilito che è la proteinasi cisteina di Der p 1 che è responsabile dell'h-A1-Pi –attività degradante, perché CS- e C-Der p 1 hanno attività simili. Al contrario, per h-elafin, abbiamo scoperto che la serina proteasi aveva la più potente attività inattivante, come illustrato dal fatto che anche in presenza di una cisteina proteasi inattiva (senza L-Cys) h-elafin era quasi completamente degradata. Inoltre, quando la cisteina proteasi è stata inibita da E-64, l'attività di h-elafina è stata ancora degradata nella stessa misura di quando non è stato aggiunto E-64. Questi risultati suggeriscono che la serina proteasi, anche se probabilmente presente come contaminante minore nella frazione CS-Der p1, ha un'affinità molto maggiore per l'h-elafina rispetto alla cisteina proteasi.

È interessante notare che h-SLPI e m-SLPI non erano ugualmente sensibili a Der p 1. In effetti, m-SLPI era molto più sensibile di h-SLPI (confronta le figure 5 e 6), con quest'ultimo che diventa solo suscettibile alla scissione da parte di Der p 1 dopo pretrattamento con DTT, che disgrega la molecola riducendo i suoi legami disolfuro interni. Questa differenza di sensibilità è notevole in considerazione delle significative omologie tra m-SLPI e h-SLPI (58% complessivo) (31) e tra elafin umana (che è sensibile a Der p 1) e SLPI umana (che non lo è, 47 % omologia) (13). È interessante che le tre molecole trovate nel presente studio come sensibili a Der p 1 (h-elafin, h-A1-Pi e m-SLPI) abbiano un'alanina in corrispondenza o in prossimità del sito reattivo all'antiproteasi (nelle posizioni P1 , P4 e P4, rispettivamente) mentre non c'è alanina in h-SLPI. Infatti, quando sono stati studiati i siti di scissione di Der p 1 su h-A1-Pi (7), è stato dimostrato che gli enzimi scindono su entrambi i lati del residuo di alanina. Inoltre, m-SLPI ha un motivo alanina-arginina nella posizione P3-P4, presente anche nel substrato sintetico della cisteina proteinasi Boc-Gln-Ala-Arg-AMC utilizzato in questo studio.

Indipendentemente dal meccanismo di inibizione differenziale Der p 1 delle antiproteasi polmonari, il nostro in vitro esperimenti condotti sulle proteine ​​umane isolate SLPI, A1-Pi ed elafin hanno rivelato che queste ultime due molecole erano maggiormente suscettibili alle proteinasi cisteina e serina presenti rispettivamente in Der p 1, mentre le in vitro la resistenza di h-SLPI a Der p 1 suggerirebbe che il primo potrebbe non essere un substrato significativo di Der p 1 in vivo.

Per determinare l'importanza di questi risultati ex vivo in campioni di polmone umano, abbiamo ottenuto BALF da pazienti con ARDS accertata, con la consapevolezza che questi pazienti avrebbero alti livelli di antiproteasi (21) e fornirebbero un buon marker per la sensibilità polmonare a Der p 1. Infatti, l'incubazione del fluido BALF con Der p 1 di entrambe le preparazioni (C/CS-Der p 1) rivela che entrambe le proteasi portano a una marcata perdita di attività antielastasi nel fluido. Questo risultato è in linea con i nostri dati, che mostrano l'elevata suscettibilità delle antielastasi umane A1-Pi e dell'elafina alla scissione da parte delle proteasi degli acari. Poiché sono state rilevate concentrazioni superiori a 3 ng/ml di Der p 1 nel BAL di soggetti allergici (32) e le antiproteasi qui studiate sono presenti anche in ng/ml nel BAL (21), rapporti molari simili di Der p 1 :antiproteasi come quelle usate in vitro è probabile che siano presenti in vivo, rendendo i nostri risultati fisiopatologicamente rilevanti. Gli studi qui presentati si aggiungono alle nostre conoscenze sulle attività biologiche di Der p 1 e sul ruolo delle sue funzioni enzimatiche sullo sviluppo e sulla persistenza dell'asma compromettendo le difese antiproteasiche del polmone. Inoltre, Der p 1 ha un effetto diretto su alcuni dei componenti del sistema immunitario adattativo, tra cui CD23 sulle cellule B e CD25 sulle cellule T, che aumenterebbero la sintesi di IgE interrompendo un segnale di feedback negativo e favorendo un Th1 a Th2 modificando rispettivamente le risposte dell'interferone-γ (8, 9, 20, 27). La conseguenza di ciò sarebbe promuovere risposte infiammatorie allergiche. Inoltre, Der p 1 ha attività distruttive sulle cellule strutturali in quanto interrompe le giunzioni delle cellule epiteliali (10), facilitando il trasporto dell'allergene attraverso l'epitelio.

Nel complesso, questi risultati hanno potenziali implicazioni ad almeno tre livelli. In primo luogo, suggeriscono che in seguito all'esposizione della mucosa bronchiale al pellet fecale HDM, le risultanti proteasi dell'acaro solubilizzate possono accedere all'interstizio polmonare, promuovere le risposte Th2 e distorcere l'equilibrio elastasi/antielastasi verso l'elastasi e quindi uno stato proinfiammatorio. Infatti, l'elastasi, oltre a scindere una varietà di substrati all'interno del polmone (33), può sovraregolare la potente chemochina neutrofila IL-8 (34-35), con conseguente infiammazione neutrofila, che in casi estremi potrebbe innescare l'insorgenza di asma fatale (36-40).

In secondo luogo, l'inibitore HNE h-A1-Pi può inibire l'iperreattività delle vie aeree mediata da proteasi (AHR) in un modello allergico (41). Ne consegue quindi che l'inattivazione di A1-Pi da parte di Der p 1 può essere deleteria facilitando l'AHR.

In terzo luogo, A1-Pi, SLPI ed elafina possiedono proprietà in aggiunta alla loro attività antielastasi. Possono funzionare come antimicrobici, direttamente o indirettamente (15-16, 18-19, 42) e, almeno per elafin e SLPI, possono “innescare” il sistema immunitario innato (17, 43). Pertanto, l'inattivazione di queste funzioni immunitarie innate aggiuntive può contribuire alle esacerbazioni infettive riscontrate nei pazienti con asma (44-45).

Inoltre, il nostro rapporto suggerisce per la prima volta che la serina proteasi di Der p 1 può anche essere un importante bersaglio terapeutico e identifica l'elafina, una molecola chiave nella difesa polmonare come un importante substrato per questa proteasi (13-14, 46).

Saranno necessari ulteriori lavori per stabilire in vivo se un doppio blocco delle proteasi cisteina e serina di Der p 1 sarà vantaggioso per i pazienti con infiammazione allergica indotta da HDM, modulando le risposte di tipo 2 e/o ripristinando le funzioni antimicrobiche polmonari.


RISULTATI

SLC25A46 si associa a diverse proteine ​​OM, in particolare componenti nella dinamica mitocondriale

In uno studio precedente, abbiamo scoperto che rari casi di PCH erano probabilmente causati da una delezione nell'esone 1 (che causa la distruzione del gene) o una mutazione puntiforme nell'esone 8 nella proteina mitocondriale OM SLC25A46 (la leucina in posizione 341 è sostituita con prolina, designata L341P (Pallido et al., 2016) SLC25A46 L341P non era stabile e i mitocondri mostravano mitocondri iperfusi e altre morfologie aberranti (Wan et al., 2016). Per studiare la potenziale funzione di SLC25A46, abbiamo eseguito immunoprecipitazioni e analisi di spettrometria di massa su mitocondri isolati da una linea cellulare stabile HEK293T che esprime SLC25A46 wild-type (WT) etichettato con un epitopo 2 × emoagglutinina (HA) all'N-terminale. Un tag posizionato all'estremità N o C non ha interferito con l'inserimento nell'OM mitocondriale (Figura supplementare S1A Abrams et al., 2015 Janer et al., 2016 Wan et al., 2016). Dopo lisi in digitonina all'1%, SLC25A46 ha interagito principalmente con proteine ​​coinvolte nella fissione e fusione come MFN1/2 o OPA1 e con componenti del complesso MICOS (Tabella supplementare S1). Un sottoinsieme di questi potenziali partner di interazione è stato confermato da una varietà di approcci. Innanzitutto, abbiamo solubilizzato i mitocondri che contenevano SLC25A46 con un tag HA N-terminale in digitonina all'1% e abbiamo utilizzato gradienti di glicerolo per esaminare la distribuzione delle proteine ​​mitocondriali (Figura 1A). SLC25A46 WT per lo più migrato vicino al centro del gradiente nelle frazioni 7-13. Anche la migrazione delle proteine ​​OM MFN1 e MTCH2 è stata arricchita in frazioni simili alla proteina SLC25A46 WT. Invece, MIC60, MIC27 e MIC19 del complesso MICOS e TOMM40 sono migrati in frazioni più pesanti (Bohnert et al., 2015 Friedman et al., 2015). Ulteriori controlli includevano PNPase e YME1L dello spazio intermembrana, TIMM23 nell'IM e PreP e LRP130 localizzati nella matrice, che mostravano tutti un modello di distribuzione diverso rispetto a SLC25A46. Per valutare il legame di SLC25A46 e MFN1, l'analisi delle frazioni di coimmunoprecipitazione (coIP) 9, 11 e 13 ha rivelato che un sottoinsieme di MFN1 e MFN2 ha effettivamente interagito con SLC25A46 (Figura 1B). Le interazioni tra SLC25A46 e MFN1/MFN2 erano specifiche perché la proteina OM MID51 non si copurificava con SLC25A46 WT o L341P in esperimenti simili di coIP (Figura 2A). Abbiamo anche utilizzato il sistema del gradiente di glicerolo per sondare l'assemblaggio di SLC25A46 L341P da una linea cellulare simile, una linea cellulare HEK293T stabile che esprime 2xHA-SLC25A46 L341P. Al contrario, SLC25A46 L341P era meno abbondante e sedimentava nelle frazioni 17-23, vicino al fondo del gradiente (Figura 1A e Figura supplementare S1B). I complessi di TOMM40, MFN1 e MIC60 non sono stati alterati nei mitocondri con SLC25A46 L341P (Figura supplementare S1B).

FIGURA 1: SLC25A46 commigra con la dinamica mitocondriale e le proteine ​​MICOS. (A) Centrifugazione a densità di gradiente di glicerolo di estratti mitocondriali generati da una linea cellulare stabile che esprime 2xHA-SLC25A46 WT. I mitocondri sono stati solubilizzati in digitonina all'1% e i lisati sono stati caricati su un gradiente lineare di glicerolo 10-50% e centrifugati durante la notte. Le frazioni 1-23 sono state analizzate con gli anticorpi indicati. È stato incluso un campione simile e l'anticorpo HA è stato utilizzato per determinare l'assieme SLC25A46 L341P. SM, materiale di partenza. (B) Immunoprecipitazione (IP) con l'anticorpo HA di 2xHA-SLC25A46 WT dalle frazioni indicate (1, 9, 11,13) della centrifugazione a densità di gradiente di glicerolo in A. I campioni di input corrispondono al 10% di ciascuna frazione. Sono stati utilizzati anticorpi contro HA, MFN1 e MFN2. (C) I mitocondri isolati da cellule HEK293T che esprimono stabilmente 2xHA-SLC25A46 WT o L341P sono stati solubilizzati con digitonina e gli estratti mitocondriali sono stati risolti mediante BN-PAGE bidimensionale. Per l'immunoblotting sono stati utilizzati anticorpi contro MFN1, TOMM40, PreP e HA. Per MFN1, TOMM40 e PreP, viene mostrata l'analisi dai mitocondri WT e i complessi sono migrati in modo identico nei mitocondri dalla linea cellulare SLC25A46 L341P. ( ▪) Il complesso MFN1-SLC25A46. (D, E) I mitocondri sono stati isolati dalle cellule LAN5 e poi lisati in digitonina all'1%. Gli estratti mitocondriali sono stati risolti da anticorpi BN-PAGE mono (D) o bidimensionali (E) per SLC25A46 endogeno, sono stati inclusi MIC19, MIC60, MFN2 e MTCH2. In D, vengono mostrate esposizioni più brevi e più lunghe per SLC25A46 per evidenziare il complesso più grande che commigra con il complesso MICOS. ( ▪) Il complesso MFN1-SLC25A46 (▴) il complesso MICOS-SLC25A46 (*) il complesso MTCH2-SLC25A46.

FIGURA 2: SLC25A46 interagisce con proteine ​​importanti per la biogenesi e la morfologia mitocondriale. (A) IP con l'anticorpo HA da estratti di cellule intere di HEK293T o cellule HEK293T stabili che esprimono 2xHA-SLC25A46 WT o 2xHA-SLC25 L341P. Le cellule sono state reticolate con ditiobis (succinimidil propionato) prima della lisi. I campioni sono stati analizzati con gli anticorpi indicati. I campioni di input rappresentano il 2% del materiale utilizzato per l'IP. Sono contrassegnate le forme corte (S) e lunghe (L) di OPA1. (B) Livello allo stato stazionario dei partner di interazione SLC25A46 in HCT116 WT o SLC25A46 tramortire (SLC25A46 − / ) sono state determinate le cellule. I mitocondri di ciascuna linea cellulare sono stati isolati, solubilizzati, separati mediante SDS-PAGE e analizzati con immunoblotting. Tre diversi cloni knockout a cellula singola designati 1.7, 4.1 e 4.3, utilizzando due diversi gRNA. L'asterisco contrassegna una banda non specifica dell'anticorpo. (C) Livelli allo stato stazionario di MFN1 e MFN2 in HEK293 T-REx Flp-In WT, e SLC25A46 -/- le cellule sono state misurate in tre esperimenti indipendenti. I mitocondri di ciascuna linea cellulare sono stati isolati, solubilizzati, separati mediante SDS-PAGE e analizzati con immunoblotting. TOMM40 è stato incluso come controllo di caricamento. (D) Analisi densitometrica di C. I risultati sono mostrati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. T test, P < 0.05. (E) Analisi di MFN1 e MFN2 espressione in HEK293 T-REx Flp-In WT e SLC25A46 –/– cellule mediante qPCR (media ± SEM, n = 3). (F) Knockout di SLC25A46 non altera la composizione fosfolipidica dei mitocondri. I fosfolipidi sono stati estratti da 0,75 mg di mitocondri nelle linee cellulari come in B, separati mediante cromatografia su strato sottile e visualizzati mediante colorazione con blu di molibdeno. Le immagini scansionate sono state analizzate utilizzando il software Quantity 1 e l'abbondanza relativa di ciascun fosfolipide è stata calcolata come percentuale del fosfolipide totale in ciascun campione (media ± SEM, n = 3). CL, cardiolipina PA, acido fosfatidico PC, fosfatidilcolina PE, fosfatidiletanolamina PI, fosfatidilinositolo PG, fosfatidilglicerolo PS, fosfatidilserina.

Utilizzando gel nativi blu (BN), abbiamo anche studiato la migrazione di SLC25A46 WT e L341P, nonché quella delle proteine ​​partner. La maggior parte di SCL25A46 WT aveva una massa molecolare di 70-200 kDa, ma sono stati identificati anche complessi più grandi (Figura 1C). Al contrario, la maggior parte di SCL25A46 L341P è migrata a una dimensione maggiore, >600 kDa, ma SLC25A46 L341P potrebbe essere rilevato in tutto il gel. Nei mitocondri delle cellule neuronali LAN5 (Figura 1D), l'SLC25A46 endogeno è migrato in complessi di dimensioni simili come nelle cellule HEK293T che esprimono HA-SCL25A46.Anche MFN1, MFN2 e MTCH2 sono migrati con SLC25A46 (Figura 1, complesso C–E MFN1/2–SLC25A46 [§] e MTCH2–SLC25A46 [▴]) e una piccola quantità di SLC25A46 è stata rilevata nel complesso più grande che è stato migrato con MIC19 e MIC60 (Figura 1, D ed E Il complesso MICOS–SLC25A46 è contrassegnato da un asterisco). TOMM40 non è migrato con SLC25A46 (Figura 1C). I complessi di TOMM40, MFN1 e MIC60 non sono stati alterati nei mitocondri con SLC25A46 L341P (Figura supplementare S1B). Quindi il saggio BN-gel supporta che la mutazione L341P in SLC25A46 altera la sua formazione complessa. Inoltre, il WT SLC25A46 è migrato con le proteine ​​dinamiche MFN1 e MFN2 oltre a MTCH2, e una piccola quantità di SLC25A46 è migrata con il complesso MICOS. In sintesi, SLC25A46 si associa a diverse proteine ​​e può funzionare come impalcatura per l'assemblaggio di proteine ​​coinvolte nell'ultrastruttura mitocondriale.

Poiché le interazioni tra SLC25A46 e i partner proteici possono essere transitorie o deboli, abbiamo eseguito il cross-linking intracellulare seguito da solubilizzazione cellulare e saggi coIP (Figura 2A). Questo sembrava intrappolare le interazioni perché SLC25A46 coprecipitato con OPA1 (forme corte e lunghe DeVay et al., 2009), MFN1, MFN2 e componenti MICOS MIC60 e MIC19. Questo concorda con il nostro studio precedente (Wan et al., 2016) e pubblicazioni recenti che SLC25A46 è un componente simile al lievito Ugo1, che mantiene la morfologia mitocondriale (Abrams et al., 2015 Janer et al., 2016). Inoltre, TOMM40 ha interagito con SLC25A46, il che potrebbe riflettere un ruolo per TOMM40 nell'assemblaggio di SLC25A46. Anche SCL25A46 L341P si è legato a proteine ​​simili ma ha mostrato un aumento del legame con TOMM40, MTCH2 e MULAN, una ubiquitina ligasi E3 che funziona nel turnover delle proteine ​​OM (Braschi et al., 2009 Ambivero et al., 2014 Yun et al., 2014). Tuttavia, SLC25A46 non ha mostrato un forte legame con MIC27. Per confermare la specificità delle interazioni SLC25A46 con le proteine ​​OM, abbiamo scoperto che MID51 non ha copurificato con SLC25A46 (Figura 2A). Questo esperimento di immunoprecipitazione in condizioni di reticolazione supporta che le interazioni di SLC25A46 con le proteine ​​partner possono essere transitorie e richiedono un metodo come la reticolazione per la stabilizzazione.

Il sistema cluster di ripetizioni palindromiche corte regolarmente interspaziate (CRISPR)/Cas9 è stato utilizzato per eliminare SLC25A46 dalla linea cellulare HCT116. SLC25A46 è stato eliminato con successo e tre linee cellulari monoclonali rappresentative (designate 1.7, 4.1, 4.3 SLC25A46 − / − ) sono stati scelti per una caratterizzazione aggiuntiva. L'analisi dei livelli allo stato stazionario delle proteine ​​partner identificate nella Figura 2A è stata testata mediante immunoblotting (Figura 2B). L'abbondanza della maggior parte di queste proteine ​​non è stata alterata, indicando che SLC25A46 non è una proteina partner in buona fede con il complesso MICOS. Tuttavia, abbiamo osservato un leggero aumento dei livelli delle proteine ​​​​della dinamica mitocondriale MFN1 e MFN2 (Figura 2B). Abbiamo anche osservato un aumento dei livelli allo stato stazionario di MFN1 e MFN2 nei mitocondri quando SLC25A46 è stato eliminato nella linea cellulare HEK293 T-REx Flp-In (Figura 2, C e D). In particolare, l'abbondanza di MFN1/2 è aumentata rispettivamente di ∼ 1,6 e 2 volte (Figura 2D). Per analizzare se questi livelli elevati fossero causati da un aumento dell'importazione di proteine, abbiamo importato MFN1-13myc e MFN2-20myc radiomarcati (Chen et al., 2003) in mitocondri isolati da WT e SLC25A46 − / − HEK293 T-REx Flp-In e ha analizzato l'importazione tramite SDS-PAGE e BN-PAGE (Figura supplementare S2, A e B). La presenza dei tag myc aggiuntivi sul C-terminale di MFN1 e MFN2 non interferisce con la funzione o l'assemblaggio (Chen et al., 2003) ma determina un aumento del peso molecolare (Figura supplementare S2, A e B). MFN1 e MFN2 importati sono stati recuperati nella frazione pellet dopo estrazione alcalina. Per entrambe le proteine, non abbiamo osservato alcun cambiamento nell'importazione di proteine. Abbiamo anche incluso reazioni di importazione di controllo prive di mitocondri per confermare che MFN1 e MFN2 non si frazionavano in modo aspecifico nel pellet dopo l'estrazione degli alcali MFN1 e MFN2 non sono stati recuperati nella frazione di pellet in assenza di mitocondri (Figura supplementare S2A). Inoltre non abbiamo notato differenze in MFN1 e MFN2 espressione in HEK293 T-REx Flp-In SLC25A46 cellule knockout mediante PCR quantitativa (qPCR Figura 2E). Quindi il knockout di SLC25A46 stabilizza MFN1 e MFN2 sui mitocondri a causa della ridotta degradazione di MFN1 e MFN2.

SLC25A46 non funziona nella biogenesi mitocondriale dei fosfolipidi e nelle vie di traffico

Poiché il complesso MICOS è stato implicato nella biogenesi e nel traffico dei lipidi e si credeva che l'omologo del lievito SLC25A46 Ugo1 regolasse la composizione lipidica locale dell'OM (Hoppins et al., 2009 Anton et al., 2011), abbiamo valutato se i livelli di lipidi mitocondriali fossero alterati in SLC25A46 − / − cellule. È stato analizzato il contenuto totale di fosfolipidi nei mitocondri e non sono state rilevate differenze (Figura supplementare S3A). Il profilo lipidico è stato valutato utilizzando la cromatografia su strato sottile (Figura supplementare S3B) e i singoli fosfolipidi sono stati quantificati (Figura 2F). Il profilo dei singoli lipidi non era diverso nel SLC25A46 − / − linee cellulari rispetto alle cellule WT HCT116. Pertanto SLC25A46 non svolge un ruolo diretto nella biogenesi dei lipidi o nel traffico dei lipidi.

L'abbondanza di MFN1 e MFN2 è aumentata nelle cellule prive di SLC25A46

Poiché abbiamo osservato livelli più elevati di MFN1 e MFN2 allo stato stazionario nelle cellule prive di SLC25A46, abbiamo studiato l'assemblaggio di queste proteine. Poiché SLC25A46 è altamente espresso nel tessuto neuronale e il mutante SLC25A46 compromette la funzione neuronale (Haitina et al., 2006 Abrams et al., 2015 Wan et al., 2016), abbiamo utilizzato RNA a forcina corta (shRNA) per abbattere SLC25A46 nelle cellule LAN5 (Figura 3, A e B). Come osservato in HCT116 e HEK293 T-REx Flp-In SLC25A46 − / − cellule, i livelli allo stato stazionario di MFN1 e MFN2 erano leggermente elevati dopo l'atterramento di SLC25A46 (Figura 3A). Ciò ha portato a un'elevata abbondanza di complessi MFN1 e MFN2 nelle cellule prive di SCL25A46 quando i mitocondri isolati sono stati solubilizzati in digitonina e separati da BN-PAGE (Figura 3B). Ancora una volta, non abbiamo osservato cambiamenti marcati nell'espressione dei trascritti per MFN1 e MFN2 (Figura 3C). Abbiamo ottenuto risultati simili in HCT116 SLC25A46 − / − cellule (Figura supplementare S4).

FIGURA 3: I livelli di SLC25A46 influenzano i livelli di stato stazionario e l'assemblaggio di MFN1 e MFN2. (A) L'oligomerizzazione di MFN1 e MFN2 è stata determinata in mitocondri isolati da linee cellulari LAN5 in cui SLC25A46 è stato abbattuto con diversi costrutti di shRNA dopo induzione di doxiciclina utilizzando BN-PAGE e immunoblotting. (B) I livelli allo stato stazionario delle proteine ​​indicate sono stati determinati utilizzando gli stessi estratti mitocondriali caricati su BN-PAGE in A. (C) Analisi di MFN1 e MFN2 espressione in cellule LAN5 in cui SLC25A46 è stato abbattuto con uno specifico costrutto shRNA mediante qPCR (media ± SEM, n = 3). (D) La rete mitocondriale nelle linee cellulari LAN5 in cui SLC25A46 è stato abbattuto dopo l'induzione di doxiciclina è stata studiata mediante colorazione di immunofluorescenza utilizzando un anticorpo contro la proteina di matrice Mortalin o la proteina OM TOMM20. Per colorare il nucleo è stato utilizzato il 4′,6-Diamidino-2-fenilindolo. Barra della scala, 10 μm. (E) Quantificazione della rete mitocondriale da D. Per ogni esperimento, sono state contate 100 cellule (media ± SEM, n = 3). (F) Le cellule vive sono state quantificate utilizzando un test tripan blue nelle linee LAN5 e HEK294 T-REx Flp-In. È stato placcato un numero uguale di cellule da ciascuna linea e quindi le cellule vive sono state contate dopo 4 giorni. L'espressione di SLC25A46 in LAN5 è stata abbattuta per 2 settimane prima dell'esperimento. I dati rappresentano la media ± SEM. (n = 3). (G) Come in A, ma l'oligomerizzazione di MFN1 e MFN2 è stata analizzata in cellule HEK293 T-REx Flp-In prive di SLC25A46. Il knockout di SLC25A46 è stato salvato esprimendo 2xHA-SLC25A46 WT o L341P per 48 ore dopo l'induzione con 10 ng/ml di doxiciclina. (H) I lisati da G sono stati separati da SDS-PAGE e i livelli di proteine ​​indicate allo stato stazionario sono stati studiati mediante immunoblot. 2xHA-SLC25A46 e SLC25A46 endogeno sono stati rilevati con anti-SLC25A46 è stata inclusa un'esposizione più lunga per rilevare HA-SLC25A46 L341P del pannello. È stato incluso anche un pannello con anti-HA per rilevare HA-SLC25A46 WT e L341P espressi.

Per determinare se gli stati di oligomerizzazione potenziati di MFN1 e MFN2 portano a mitocondri iperfusi, abbiamo abbattuto SLC25A46 nelle cellule LAN5 mediante interferenza dell'RNA (RNAi) e visualizzato i mitocondri mediante colorazione di immunofluorescenza utilizzando un anticorpo contro la proteina della matrice Mortalin e la proteina OM TOMM20. Come previsto, i mitocondri sono apparsi allungati e iperfusi nelle cellule con SLC25A46 abbattuto, come riportato in precedenza (Figura 3D Abrams et al., 2015 Janer et al., 2016 Wan et al., 2016). Per confermare che la rete mitocondriale era effettivamente iperfusa nelle cellule knockdown SLC25A46, abbiamo quantificato la rete mitocondriale (Figura 3E). Nelle cellule prive di SLC25A46, la rete era costituita da ∼65% di mitocondri iperfusi e ∼30% di mitocondri normali. Al contrario, le cellule di controllo avevano una rete con ∼70% di mitocondri normali e ∼25% di mitocondri iperfusi. Quindi la rete mitocondriale nelle cellule LAN5 prive di SLC25A46 è aberrante, contrassegnata da una rete iperfusa.

L'oligomerizzazione di MFN1 e MFN2 può essere confermata mediante reticolazione con un reticolante cisteina-cisteina, che produce complessi ad alto peso molecolare nei gel SDS. In SLC25A46 − / − Nelle cellule knockdown HCT116 o LAN5 SLC25A46, è stata rilevata una maggiore abbondanza di oligomeri MFN1 e MFN2 mediante reticolazione (Figura supplementare S5, A e B). I nostri risultati supportano l'osservazione che la ridotta espressione di SLC25A46 porta a mitocondri iperfusi (Figura 3, D ed E Abrams et al., 2015 Wan et al., 2016), che è correlato all'aumento dei livelli di stato stazionario e all'oligomerizzazione dei complessi MFN1 e MFN2 nei mitocondri iperfusi.

Poiché i mitocondri iperfusi potrebbero influenzare la vitalità cellulare, abbiamo analizzato la crescita cellulare di HEK293 T-REx Flp-In SLC25A46 − / − e cellule LAN5 in cui l'espressione di SLC25A46 è stata silenziata da uno specifico shRNA (Figura 3F). Tuttavia, in queste linee non sono stati rilevati cambiamenti nella vitalità cellulare (Figura 3F). I nostri risultati contrastano con un recente studio di Janer et al. (2016) in cui le linee di fibroblasti derivate da un paziente o abbattute per SLC25A46 hanno mostrato un aumento della senescenza cellulare.

L'espressione di SLC25A46 L341P non salva livelli elevati di MFN1 e MFN2 nelle cellule prive di SLC25A46

Successivamente abbiamo analizzato se il mutante SLC25A46 L341P è in grado di salvare il fenotipo nelle cellule knockout SLC25A46 perché i nostri studi precedenti indicavano che la mutazione L341P destabilizzava SLC25A46, causando mitocondri iperfusi e PCH letale (Wan et al., 2016). SLC25A46 è stato eliminato nelle cellule HEK 293 T-REx Flp-In ed è stato introdotto 2xHA-SLC25A46 WT o L341P inducibile da doxiciclina. I mitocondri isolati da queste linee cellulari sono stati sottoposti a SDS- e BN-PAGE come in Figura 3, A e B. Ancora una volta, MFN1 e MFN2 hanno mostrato un aumento dei livelli di stato stazionario e oligomerizzazione quando SLC25A46 è stato eliminato (Figura 3, G e H) . Mentre l'induzione di 2xHA-SLC25A46 WT ha salvato il knockout, l'induzione di 2xHA-SLC25A46 L341P è fallita e ha invece aumentato i livelli di stato stazionario e ha prevalso l'oligomerizzazione di MFN1 e MFN2 (Figura 3, G e H). Si noti che l'espressione delle proteine ​​HA-SLC25A46 è stata confermata mediante immunoblotting con un anticorpo anti-HA. Inoltre, l'anti-SLC25A46 è stato utilizzato per rilevare l'espressione di SLC25A46 endogeno e SLC25A46 etichettato con HA poiché 2xHA-SLC25A46 L341P viene rapidamente degradato, questo pannello è stato sovraesposto per verificare che fosse presente 2xHA-SLC25A46 L341P (Figura 3H). Quindi le cellule che esprimono SLC25A46 L341P hanno un fenotipo identico a quello del knockout SLC25A46.

SLC25A46 L341P non è stabile

Poiché il rapido turnover di una specifica proteina OM mitocondriale è una base molecolare inaspettata per una malattia, abbiamo studiato in dettaglio questo percorso di degradazione. Abbiamo transfettato transitoriamente linee cellulari HEK293T con costrutti che esprimevano la proteina mutante SLC25A46 WT o L341P contenente un epitopo 2xHA all'N-terminale. Abbiamo trattato le cellule con cicloesimide per bloccare la traduzione citosolica e abbiamo rimosso le aliquote in un inseguimento temporale (Figura 4A). SLC25A46 è stato rilevato con un anticorpo anti-HA. La proteina OM mitocondriale TOMM40 è stata inclusa come controllo. L'abbondanza di SLC25A46 è stata quantificata mediante densitometria (Figura 4B). Mentre TOMM40 e WT SLC25A46 erano stabili durante l'inseguimento, SLC25A46 L341P non è stato rilevato, tranne quando il blot era sovraesposto rispetto a WT SLC25A46. Si noti che l'apparente aumento dell'abbondanza di SLC25A46 ai punti temporali di 40 e 60 minuti è inaspettato ma probabilmente indicativo della normale variabilità associata alla proteina stabile in questi tipi di esperimenti che abbiamo osservato in precedenza (Hwang et al., 2007). Per determinare se sono state tollerate diverse sostituzioni di amminoacidi, sono state apportate modifiche a SLC25A46 in posizione 341, tra cui una sostituzione basica (arginina, R), acida (glutammato, E) e conservativa idrofobica (valina, V), e la stabilità è stata testata come nella Figura 4A (Figura 4C). Di nuovo, le sostituzioni di arginina e glutammato hanno notevolmente ridotto la stabilità, simile alla mutazione della prolina, e anche la sostituzione conservativa della valina ha diminuito la stabilità di SLC25A46, ma la proteina era rilevabile con un'esposizione più breve del film. Pertanto la mutazione in posizione 341 diminuisce fortemente la stabilità di SLC25A46.

FIGURA 4: SLC25A46 L341P è molto instabile nelle cellule in coltura e non raggiunge la sua conformazione nativa. (A) L'emivita di WT SLC25A46 o SLC25A46 L341P è stata determinata mediante esperimenti di inseguimento con cicloesimide (CHX). Le cellule HEK293T sono state transfettate in modo transitorio con costrutti per 2xHA-SLC25A46 WT o 2xHA-SLC25A46 L341P. A 24 ore dalla trasfezione, è stato aggiunto CHX e sono stati prelevati campioni nei punti temporali indicati. I mitocondri sono stati isolati e analizzati con anticorpi contro il tag HA e il controllo TOMM40. (B) Densitometria di immunoblot da A. (C) Come in A, i costrutti sono stati generati con le mutazioni indicate nella posizione 341. (D) Come in A, i costrutti sono stati generati con le mutazioni indicate nelle posizioni 341, 333 e 340. (E) 2xHA-SLC25A46 WT, L341P e R340C radiomarcati sono stati importati per 10 minuti in mitocondri isolati da cellule HEK293 T-REx Flp-In. Dopo l'importazione, metà del campione è stata trattata con 1,25 µg/ml di tripsina per 15 minuti su ghiaccio e le proteine ​​inserite sono state recuperate nel pellet dopo l'estrazione con alcali. Come controllo, l'altra metà è stata incubata per 15 minuti in ghiaccio, seguita da estrazione con alcali. Tutti i campioni sono stati risolti mediante SDS-PAGE e visualizzati mediante autoradiografia. Le frecce etichettate 1-3 indicano diversi prodotti di scollatura che erano prominenti nel pannello che è stato esposto per un tempo più lungo.

Mutazioni in SLC25A46 sono state identificate anche in pazienti con disturbo dello spettro dell'atrofia ottica (Abrams et al., 2015). Queste mutazioni sono state associate a difetti nella morfologia mitocondriale, ma il destino della proteina SLC25A46 mutante non è stato determinato. Due mutazioni, P333L e R340C, erano vicine a L341P e localizzate nel presunto quinto dominio di membrana, in base all'omologia con i portatori mitocondriali (Wan et al., 2016). Come in Figura 4C, l'abbondanza di queste proteine ​​è stata determinata utilizzando studi di cycloheximide-chase (Figura 4D). È stato rilevato SLC25A46 R340C, ma le varianti L341P e P333L sono state identificate solo quando la macchia è stata esposta per un tempo più lungo. Il paziente con il mutante P333L è morto a 15 settimane di vita, mentre il paziente con la mutazione R340C aveva 51 anni al momento dello studio (Abrams et al., 2015). Pertanto, il rapido ricambio di SLC25A46 durante lo sviluppo è probabilmente associato all'inizio precoce della morte.

Per determinare se la rapida degradazione di SLC24A46 L341P fosse il risultato del mancato raggiungimento della conformazione nativa della proteina mutante nell'OM dopo l'importazione, abbiamo importato SLC25A46 WT, L341P e R340C radiomarcati in mitocondri isolati e abbiamo trattato metà del campione con una bassa quantità di tripsina per eseguire una proteolisi limitata. L'inserimento della membrana è stato confermato dall'estrazione di alcali (Figura 4E). In assenza di trattamento con tripsina, tutte e tre le proteine ​​sono state importate nella stessa misura. Il confronto dei prodotti di scissione dopo una proteolisi limitata ha mostrato che le tre proteine ​​avevano modelli di scissione differenti. Tre importanti prodotti di degradazione sono stati rilevati ed etichettati sul pannello con l'esposizione più lunga. SLC25A46 WT e R340C avevano un prodotto di scollatura prominente in posizione 2 e un prodotto minore in posizione 1, con l'eccezione che R340C aveva meno di questi prodotti rispetto a WT. Al contrario, SLC25A46 L341P aveva un prodotto di scollatura aggiuntivo in posizione 3 che era più prominente rispetto a WT e R340C. Pertanto concludiamo che SLC25A46 L341P viene importato normalmente ma non raggiunge la conformazione nativa, con conseguente rapido degrado. Il fatto che SLC25A46 L341P non si pieghi nella sua conformazione finale è supportato anche dall'osservazione che SLC25A46 L341P ha mostrato un modello di distribuzione diverso nei gradienti di glicerolo e BN-PAGE rispetto a WT SLC25A46 (Figura 1, A e C).

SLC25A46 L341P è poliubiquitilato e degradato dal proteasoma

La forte interazione di SLC25A46 L341P con MULAN implica che il mutante SLC25A46 può essere rapidamente degradato dall'UPS (Figura 2A). Tuttavia, è stato suggerito che le proteine ​​OM mitocondriali siano capovolte solo dalla mitofagia con la rimozione definitiva dell'intero organello (Ling e Jarvis, 2013). Pertanto abbiamo studiato il processo di turnover in modo più dettagliato. Le cellule che esprimono SLC25A46 L341P sono state trattate con i due inibitori del proteasoma MG132 e bortezomib e con l'inibitore dell'autofagia di fase tardiva bafilomicina A1 (Figura 5A). Poiché MG132 a una concentrazione 10 volte superiore può anche inibire le calpaine e le catespin proteolitiche (Tsubuki et al., 1996 Kisselev e Goldberg, 2001), è stato utilizzato anche bortezomib, che è specifico del proteasoma (Moore et al., 2008). Il livello allo stato stazionario di SLC25A46 L341P è stato aumentato solo quando le cellule sono state trattate con MG132 o bortezomib (Figura 5A). Le proteine ​​degradate dal proteasoma sono tipicamente ubiquitilate, determinando una ridotta mobilità nei gel SDS. Una frazione di SLC25A46 L341P ha mostrato mobilità ridotta dopo l'inibizione del proteasoma, suggerendo l'ubiquitilazione (Figura 5A la frazione monoubiquitilata è contrassegnata da un asterisco). Al contrario, SLC25A46 L341P non è stato stabilizzato con il trattamento con bafilomicina A1, sebbene il marcatore di autofagia LC3-II si sia accumulato, indicando che l'autofagia era effettivamente inibita (Figura 5A).Quando abbiamo analizzato i mitocondri da cellule HEK293T che sono state transfettate in modo transitorio con HA-SLC25A46 WT o mutante L341P, abbiamo scoperto che il trattamento con MG132 ha nuovamente stabilizzato notevolmente HA-SLC25A46 L341P, mentre HA-SLC25A46 WT è stato solo leggermente stabilizzato (Figura 5B). Inoltre, una frazione di SLC25A46 WT e L341P delle cellule trattate con MG132 ha mostrato anche una ridotta mobilità dopo una maggiore esposizione, supportando l'ubiquitilazione delle proteine ​​(Figura 5B). Nelle cellule HeLa transfettate transitoriamente con SLC25A46 WT o L341P marcato con HA, il mutante SLC25A46 era appena rilevabile (Figura supplementare S6) e localizzato nei mitocondri e nel citosol, tuttavia, non sono stati osservati grandi aggregati. In confronto, SLC25A46 WT era abbondante ed esclusivamente localizzato nei mitocondri. Quando le cellule sono state trattate con MG132, SLC25A46 L341P e WT si sono accumulati sui mitocondri e nel citosol. Concludiamo che SLC25A46 L341P non forma grandi aggregati ma viene importato nei mitocondri e quindi viene rapidamente retrotraslocato nel citosol a causa dell'instabilità. WT SLC25A46 segue un percorso simile ma con una cinetica più lenta.

FIGURA 5: SLC25A46 L341P è poliubiquitilato e degradato dal proteasoma. (A) Le cellule HEK293 T-REx Flp-In che esprimono 2xHA-SLC25A46 L341P sono state trattate con MG132, bortezomib, bafilomicina A1 o DMSO (0,1%) per 6 ore. Le cellule sono state lisate e gli estratti totali sono stati analizzati mediante SDS-PAGE. Anticorpi contro LC3 e ubiquitina sono stati inclusi come controlli per verificare rispettivamente l'inibizione dell'autofagia e la degradazione delle proteine. TOMM40 fungeva da controllo del carico. L'asterisco indica 2xHA-SLC25A46 L341P monoubiquitilato. (B) SLC25A46 L341P si accumula sui mitocondri dopo l'inibizione del proteasoma. Le cellule HEK293T sono state trasfettate come in A e quindi trattate con 10 μM di MG132 (M) o controllo DMSO (D) per 6 ore. I mitocondri sono stati isolati e lisati SLC25A46 L341P marcati con HA è stato rilevato mediante immunoblotting. (C) SLC25A46 WT o L341P ubiquitilato è stato immunoprecipitato in condizioni denaturanti con un anticorpo Flag proveniente da cellule che esprimono transitoriamente HA-ubiquitina-GFP e 3xFlag-SLC25A46 WT o L341P. L'ubiquitina è stata rilevata con un anticorpo anti-HA. GFP scisso da HA-ubiquitina è servito come controllo della trasfezione e TOMM40 è stato incluso come controllo del caricamento. (D) Il rapporto tra SLC25A46 WT e L341P ubiquitilati e non ubiquitilati è stato determinato dopo l'analisi densitometrica di entrambi i pool di proteine ​​di C. Media ± SEM n = 3. (E) L'inibizione del proteasoma blocca la rapida degradazione di SLC25A46 L341P nei mitocondri. HEK293T sono stati transfettati transitoriamente con costrutti per 2xHA-SLC25A46 WT o L341P per 24 ore e quindi raccolti prima (0) e 15 o 30 minuti dopo l'aggiunta di cicloesimide. I mitocondri sono stati isolati e analizzati mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Per bloccare la degradazione dipendente dal proteasoma, 25 μM MG132 è stato aggiunto al momento come aggiunta di cicloesimide.

Per confermare l'ubiquitilazione di SLC25A46, abbiamo trasfettato transitoriamente cellule con SLC25A46 WT o L341P con tag Flag, nonché con un costrutto per ubiquitin-GFP con tag HA (e come controllo, un vettore vuoto Figura 5C). SLC25A46 dai lisati è stato immunoprecipitato con anti-Flag seguito da immunoblotting con anti-HA. Come previsto, SLC25A46 era ubiquitilato, con il mutante L341P che possedeva una maggiore modifica (Figura 5, C e D).

Per verificare il coinvolgimento dell'UPS nel turnover di SLC25A46, sono state sottoposte cellule trasfettate transitoriamente con SLC25A46 WT o L341P a un inseguimento con cicloesimide in presenza di MG132 per valutare la stabilità di SLC25A46 (Figura 5E). SLC25A46 WT era stabile, mentre SLC25A46 L341P era presente a livelli inferiori, ma è stata rilevata una degradazione in caso di esposizione più lunga al film. L'aggiunta di MG132 ha stabilizzato l'SLC25A46 L341P, confermando che il mutante L341P degradato dal proteasoma. TOMM40 era stabile e incluso come controllo di caricamento. Così SCL25A46 L341P nell'OM mitocondriale è ampiamente ubiquitilato e degradato dal proteasoma, indipendentemente dalla mitofagia.

MULAN e MARCH5 ubiquitano in modo coordinato SLC25A46 L341P e P97 media la degradazione di SLC25A46

Abbiamo determinato i componenti che mediano il turnover di SLC25A46 sfruttando gli inibitori, i mutanti e il silenziamento dell'RNAi. Quando le cellule HEK293T che esprimono stabilmente SLC25A46 L341P sono state trattate con l'inibitore del proteasoma MG132 (M) o l'inibitore P97 NMS873 (N Magnaghi et al., 2013), i test coIP hanno rivelato una robusta interazione di SCL25A46 L341P con MULAN e un'interazione più debole con P97 (Figura 6A). Non è stata rilevata una forte interazione con MARCH5, perché MARCH5 non è riuscito a coimmunoprecipitare con SCL25A46 L341P (Figura 6A). Si noti che gli immunoblot con l'anticorpo per MARCH5 endogeno producono uno sfondo ed è stata rilevata una banda non specifica che migra a un peso molecolare più elevato di MARCH5 (contrassegnata con un asterisco nella Figura 6A).

FIGURA 6: Il rapido turnover di SLC25A46 L341P dipende fortemente da P97. (A) SLC25A46 si lega a P97, MARCH5 e MULAN. Le cellule HEK293T stabili che esprimono 2xHA-SLC25A46 L341P sono state trattate con DMSO (controllo del veicolo), 25 μM MG132 (M) o 5 μM NMS873 (N) per 3 ore prima della lisi cellulare. Le cellule sono state lisate in digitonina e SLC25A46 è stato immunoprecipitato da estratti di cellule intere con anticorpi anti-HA. Per l'immunoblotting sono stati utilizzati anticorpi contro HA, P97, MULAN e il controllo matrice LRP130. I campioni di input corrispondono al 2% della quantità di lisato utilizzato per l'IP. L'asterisco contrassegna un segnale non specifico nelle corsie IP per MARCH5. (B) L'inibizione di P97 altera la degradazione di SLC25A46 L341P. Le stesse cellule di A sono state trattate con DMSO e 5 o 10 μM NMS873 in combinazione con CHX. Ai tempi indicati, le cellule sono state raccolte e i mitocondri sono stati isolati. La degradazione di SLC25A46 L341P è stata rilevata mediante immunoblotting e TOMM40 è stato incluso come controllo di caricamento. L'asterisco indica le specie poliubiquitilate. (C) Le cellule HEK293T che esprimono stabilmente lo shRNA inducibile dalla doxiciclina (Doxy) che ha come bersaglio P97 sono state trasfettate con un costrutto per 2xHA-SLC25A46 L341P. Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con CHX e i campioni sono stati rimossi ai tempi indicati. Le cellule sono state separate in un pellet mitocondriale e un surnatante postmitocondriale uguale quantità di proteine ​​da ciascuna frazione è stata analizzata mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Il trattamento con doxiciclina è stato iniziato 24 ore prima della trasfezione e mantenuto durante l'analisi. L'asterisco indica SLC25A46 monoubiquitilato. (D) L'emivita di SLC25A46 L341P è stata determinata in cellule HEK293T che esprimono transitoriamente 2xHA-SLC25A46 L341P in combinazione con WT P97, P97-QQ mutante del sito attivo o vettore vuoto. Le cellule sono state trattate con CHX e analizzate come descritto in C. L'asterisco segna SLC25A46 monoubiquitilato.

Abbiamo seguito questa indagine con esperimenti di cycloheximide-chase per fermare la traduzione citosolica e abbiamo studiato la stabilità di SLC25A46 L341P in condizioni che diminuivano la proteolisi (Figura 6, B–D). Le aliquote sono state rimosse prima del trattamento con cicloesimide e 15 e 30 minuti dopo il trattamento, e i lisati mitocondriali sono stati sottoposti a immunoblotting. Il trattamento con NMS873 per inibire P97 prima dell'inseguimento della cicloesimide ha provocato l'accumulo di SLC25A46 L341P in complessi di massa molecolare grande (contrassegnati da un asterisco), indicando un accumulo di mutante SLC25A46 L341P poliubiquitilato sui mitocondri (Figura 6B). Non ci aspettiamo che questa frazione di SLC25A46 (contrassegnata con un asterisco) sia un aggregato non specifico perché 1) la forma ad alto peso molecolare di SLC25A46 non è stata rilevata quando le cellule sono state finte trattate con dimetilsolfossido (DMSO) 2) i campioni sono stati preparato per SDS–PAGE con un tampone campione che conteneva SDS, con conseguente solubilizzazione prevista di SLC25A46 e 3) SLC25A46 preparato in tampone campione contenente SDS non si osserva nel gel di impilamento e la frazione SLC25A46 nella parte superiore del gel ( contrassegnato con un asterisco) è entrato nel gel di separazione. L'espressione della proteina P97 è stata ridotta utilizzando un sistema shRNA inducibile dalla doxiciclina (Figura 6C). Diminuzione dei livelli di proteina P97 correlata con una maggiore stabilità di SLC25A46 L341P sui mitocondri e un leggero aumento della stabilità di un pool citosolico. Ciò supporta un percorso in cui SLC25A46 viene prima inserito nell'OM mitocondriale e quindi successivamente degradato. Inoltre, l'espressione del mutante P97-QQ del sito attivo rispecchiava l'induzione di shRNA (Figura 6D), in cui SLC25A46 L341P era stabilizzato sulla membrana mitocondriale inoltre, è stata rilevata una forma monoubiquitilata di SLC25A46 L341P (contrassegnata con un asterisco) e una frazione del mutante P97-QQ associato al mutante SLC25A46 sui mitocondri. Al contrario, la sovraespressione di P97 attivo non ha aumentato l'accumulo di SLC25A46 mutante (Figura 6D). Si noti che nella Figura 6C con anti-P97, è stata rilevata una frazione del pool P97 nella frazione mitocondriale, che probabilmente riflette un pool di P97 che potrebbe essere coinvolto nella degradazione di SLC25A46. Allo stesso modo, una piccola frazione del mutante P97-QQ è stata identificata nella frazione mitocondriale, questo pool potrebbe essere più grande perché l'anticorpo anti-istidina non è robusto come l'anticorpo P97.

Abbiamo manipolato l'espressione MULAN. La sovraespressione di MULAN ha determinato un aumento della monoubiquitilazione di SLC25A46 L341P (contrassegnato da un asterisco). Tuttavia, MULAN H319A "ligasi-morto" ha aumentato la stabilità di SLC25A46 L341P ma mancava di ubiquitilazione (Zhang et al., 2008 Figura 7A). Inizialmente, abbiamo previsto che la sovraespressione di WT MULAN comporterebbe un aumento del turnover di SLC25A46 L341P, simile alle condizioni del controllo del vettore vuoto. Tuttavia, la sovraespressione di MULAN probabilmente non è ben tollerata dalle cellule perché i rapporti indicano che la sovraespressione di WT MULAN inibisce la crescita cellulare e provoca la morte cellulare (Zhang et al., 2008 Bae et al., 2012). Pertanto interpretiamo questo risultato come indicazione che una maggiore abbondanza di MULAN attivo provoca un aumento della degradazione delle proteine ​​chiave necessarie per la sopravvivenza cellulare, come Akt (Bae et al., 2012) e la sovraespressione di MULAN a lungo termine porta all'apoptosi tramite l'attivazione delle caspasi (Zhang et al., 2008). In effetti, la sovraespressione a lungo termine di MULAN porta alla morte cellulare in questi esperimenti. Concludiamo che in condizioni apoptotiche, il percorso di controllo della qualità per proteine ​​come SLC25A46 L341P non funziona in modo efficiente e quindi il turnover di SLC25A46 non è così robusto come nel caso dell'espressione del vettore vuoto. Inoltre, un risultato simile è stato trovato con l'ubiquitina ligasi del reticolo endoplasmatico (ER) HRD1. La sovraespressione del mutante HRD1 non è riuscita a degradare la catena leggera dell'immunoglobulina non secreta (Ig LC), ma la sovraespressione di WT HRD1 ha anche inibito la degradazione delle Ig LC non secrete (Okuda-Shimizu e Hendershot, 2007). Quindi i risultati con HRD1 rispecchiano quelli con sovraespressione di WT MULAN.

FIGURA 7: MARCH5 e MULAN mediano l'ubiquitilazione e la degradazione di SLC25A46 L341P. (A) Aumento dell'emivita di SLC25A46 L341P sovraesprimendo il mutante RING-finger MULAN H319A. Una linea cellulare stabile che esprime 2xHA-SLC25A46 L341P è stata transfettata in modo transitorio con un vettore vuoto, WT MULAN o MULAN H319A e trattata con CHX per i punti temporali indicati. I mitocondri sono stati isolati e MULAN è stato rilevato con un anticorpo anti-myc. L'asterisco indica SLC25A46 monoubiquitilato. (B) Come in A, con l'eccezione che le cellule sono state transfettate transitoriamente con WT MARCH5 o con il mutante RING MARCH5 H43W. (C) Le cellule HEK293T che esprimono stabilmente shRNA di controllo inducibile da Doxy o un shRNA che mira a MULAN sono state trasfettate con costrutti per shRNA di controllo o shRNA che hanno come bersaglio MARCH5 e 2xHA-SLC25A46 L341P. Durante la trasfezione è stata aggiunta doxiciclina (1 μg/ml). Dopo 48 ore, è stato aggiunto CHX e le cellule sono state raccolte appena prima dell'aggiunta di CHX (0) e dopo 15 e 30 minuti. I mitocondri sono stati isolati e analizzati mediante SDS-PAGE e immunoblotting. (D) Come in C, ma le cellule sono state trasfettate con 3xFlag-SLC25A46 L341P e HA-Ubiquitin-GFP. Dopo il trattamento delle cellule con 25 μM di MG132 per 3 ore, le proteine ​​ubiquitilate marcate con HA sono state immunoprecipitate in condizioni di denaturazione con anti-HA. L'ubiquitilato 3xFlag-SLC25A46 L341P è stato rilevato con un anticorpo anti-Flag. L'asterisco indica le specie poliubiquitilate. TOMM40 è un controllo di carico. (E) Determinazione dell'abbondanza di SLC25A46 L341P in cellule knockout HEK293 T-REx Flp-In WT, MARCH5, MULAN o MARCH5/MULAN. Le cellule sono state trasfettate con un costrutto 2xHA-SLC25A46 L341P. I mitocondri dalle linee cellulari sono stati isolati, solubilizzati, separati mediante SDS-PAGE e analizzati mediante immunoblotting. PreP è stato incluso come controllo del caricamento. (F) Come in E, con trattamento CHX per i tempi indicati. Le cellule sono state raccolte in ogni momento e i mitocondri sono stati isolati. SLC25A46 L341P e SLC25A46 endogeno sono stati rilevati mediante immunoblotting e TOMM40 è stato incluso come controllo di caricamento. (G) Sotto l'espressione fisiologica di WT SLC25A46, i livelli di MFN1, MNF2 e dimeri sono mantenuti costanti in modo da non disturbare il sottile equilibrio tra fissione e fusione, che è importante per lo sviluppo e la sopravvivenza (a sinistra). Tuttavia, quando il gene SLC25A46 viene interrotto da delezioni o il prodotto genico destabilizzato da mutazioni puntiformi come L341P, che viene rapidamente degradato dalla degradazione associata all'OM, ​​i dimeri MFN1 e MFN2 si accumulano sull'OM e spostano l'equilibrio verso la fusione. Questo porta all'ipoplasia pontocerebellare e alla morte precoce (a destra).

Abbiamo usato un approccio simile con la manipolazione dell'espressione MARCH5. La trasfezione transitoria di WT MARCH5 ha provocato la degradazione di SLC25A46 L341P simile alla trasfezione con un vettore vuoto (Figura 7B). Al contrario, la trasfezione con il mutante del dominio dell'anello MARCH5 H43W ha portato alla stabilizzazione di SLC25A46 L341P in misura minore (Karbowski et al., 2007).

Utilizzando l'approccio shRNA per ridurre l'espressione di MULAN e MARCH5, abbiamo scoperto che SLC25A46 L341P era notevolmente stabilizzato quando l'espressione di entrambi era ridotta (Figura 7C). Per confermare l'ubiquitilazione di SLC25A46 L341P specificamente da MULAN e MARCH5, abbiamo combinato SLC25A46 L341P con tag Flag e la trasfezione della proteina fluorescente verde HA-ubiquitina-verde (GFP) con il trattamento MULAN e MARCH5 RNAi come nella Figura 5C. Ancora una volta, il knockdown di MULAN e MARCH5 ha spostato il pool di SLC25A46 L341P poliubiquitilato in una coorte meno ubiquitaria (Figura 7D, asterisco). Come nella Figura 6B, non ci aspettiamo che la frazione di Flag-SLC25A46 L341P che migra ad alta massa molecolare (asterisco) sia un aggregato non specifico perché questa frazione non è stata rilevata nel campione trattato con lo shRNA di controllo. Inoltre, sulla base del test, abbiamo prima immunoprecipitato proteine ​​che sono state ubiquitilate con HA e poi blotted per Flag-SLC25A46 L341P con anti-Flag. Pertanto la frazione di Flag-SLC25A46 L341P che migra ad alta massa molecolare (asterisco) è poliubiquitilata.

Per verificare il ruolo di MULAN e MARCH5 sulla degradazione di SLC25A46 L341P, abbiamo generato HEK293 T-REx Flp-In MULAN − / − , MARZO5 − / − , e MULAN − / − /MARZO5 − / − linee cellulari e ha analizzato l'abbondanza di SLC25A46 L341P quando trasfettata in modo transitorio (Figura 7E). Ancora una volta, solo in assenza di MARCH5 e MULAN i livelli di SLC25A46 L341P allo stato stazionario sono aumentati rispetto ai singoli knockout della ligasi E3. Come osservato nell'approccio shRNA, SLC25A46 L341P è stato notevolmente stabilizzato quando entrambe le ligasi E3 sono state eliminate nelle linee cellulari HEK293 T-REx Flp-In (Figura 7F). Il singolo knockout di MULAN o MARCH5 ha avuto scarso effetto sull'emivita di SLC25A46.

La famiglia di ligasi Cullin RING non ubiquitila SLC25A46 L341P

Un'altra classe di ligasi ubiquitina E3 che può svolgere un ruolo nella degradazione di SLC25A46 L341P è la famiglia delle ligasi Cullin RING (CRL) (Figura supplementare S7). In precedenza SLC25A46 è stato identificato come un potenziale substrato CRL3 (Emanuele et al., 2011). La piccola molecola MLN4924, che inibisce l'enzima attivante NEDD8 e quindi impedisce l'attivazione delle ligasi Cullin RING, è stata aggiunta alle cellule prima della caccia alla cicloesimide (Soucy et al., 2009). SLC25A46 L341P non è stato stabilizzato in queste condizioni. Tuttavia, l'inibitore era attivo perché impediva la nedilazione di Cul4a da parte di Nedd8 (Brownell et al., 2010). Pertanto, delle ubiquitina ligasi, MARCH5 e MULAN coordinano la degradazione di SLC25A46 e sembrano avere funzioni ridondanti.


Gli oligomeri tossici contengono una struttura a fogli α, non una struttura a fogli β

La struttura secondaria di Aβ è stata quindi valutata in funzione del tempo mediante dicroismo circolare (CD) (Fig. 1C). Coerentemente con il profilo ThT, l'aggregazione è iniziata da una conformazione a bobina casuale non strutturata (0 h) e ha proceduto alla struttura del foglio nel corso dell'aggregazione (48 ore e oltre). È interessante notare che la curva si è sollevata e appiattita nella fase di ritardo prima della formazione di fogli (mostrata per 8-36 h). Pertanto, gli oligomeri esamero e dodecamero popolati durante la fase di latenza non contengono una struttura secondaria convenzionale misurabile, mentre le specie tardive a peso molecolare più elevato (48 ore e oltre) contengono una struttura coerente con l'inferenza del saggio di legame ThT. Gli spettri CD senza caratteristiche degli oligomeri intermedi (sia in dimensione che in tempo) sono simili a quelli che abbiamo proposto e confermato sperimentalmente per la struttura del foglio α (29, 38 ⇓ -40). I peptidi a foglio α progettati (denotati come AP#, per peptide alternato) producono un "segnale nullo" a causa delle loro caratteristiche strutturali uniche che portano alla cancellazione del segnale CD, come mostrato in Fig. 1C per il disegno α-sheet AP407, che è distinto dagli spettri random coil, α-helical e -sheet CD (29, 38 ⇓ –40). Contrariamente ai nostri risultati, molti presumono che gli oligomeri solubili in Aβ adottino una struttura a fogli nella fase di latenza, ma numerosi altri studi riportano spettri CD molto simili agli spettri a fogli α forniti qui (17, 31, 41, 42). Sebbene siano stati ottenuti spettri simili, non sono stati riconosciuti come fogli α a causa della sua novità, poiché i composti modello sono fondamentali per l'assegnazione degli spettri. Qui abbiamo usato i nostri progetti di fogli α sintetici, come AP407, a tale scopo, ma per farlo era necessaria un'ulteriore caratterizzazione della struttura.

Per ottenere informazioni strutturali più dettagliate per i nostri progetti di fogli α, sono stati eseguiti esperimenti 2D NMR di AP407, che hanno portato a 455 interazioni nucleari di effetto Overhauser (NOE) distinte tra i protoni per questo peptide a 23 residui (Dataset S1), consentendo il calcolo e collaudo dei modelli strutturali di AP407 (SI Appendice, Fig. S4UN). Gli spostamenti chimici dall'NMR e dall'insieme strutturale derivato dall'NMR sono in ottimo accordo (SI Appendice, Fig. S4B). Gli spostamenti chimici secondari, che sono spesso usati per determinare le regioni della struttura secondaria, sono coerenti con la struttura α-elicoidale mentre le costanti di accoppiamento che riflettono gli angoli diedri non lo sono (SI Appendice, Fig. S4C). Invece, le costanti di accoppiamento sono indicative di -sheet o struttura estesa.Pertanto, i risultati NMR indicano sia l'α-elica che la struttura del foglio esteso, come ci aspetteremmo per un foglio α composto da valori elicoidali locali (Φ, ) di chiralità alternata (SI Appendice, Fig. S1) formando una struttura a foglio a forcina. I NOE forniscono ulteriore supporto a questa conclusione. sequenziale Hn-Hn Sono stati osservati i NOE previsti per la struttura del foglio α, mentre i modelli NOE della catena principale standard previsti per le strutture del foglio α-elicoidale e non erano presenti (SI Appendice, Fig. S4 D e E), che è coerente con lo spettro CD piatto per AP407 (Fig. 1C, con una delle strutture NMR fornite nel inserto). In uno studio precedente, abbiamo ottenuto NOE per altri due progetti di fogli α, ma non un numero sufficiente per calcolare una struttura (38). Qui, tuttavia, abbiamo ottenuto un numero maggiore di NOE, compresi i NOE a catena laterale, utilizzando un design più vincolato con un legame disolfuro che collega i filamenti α. Il cento per cento dei 455 NOE sono soddisfatti dall'ensemble presentato in SI Appendice, figura S4. Come è generalmente il caso con piccoli peptidi, tuttavia, AP407 mantiene la flessibilità conformazionale, come è particolarmente evidente nella regione di rotazione a causa dell'imballaggio alternativo della catena laterale (SI Appendice, Fig. S4UN).

La spettroscopia di modulazione microfluidica (MMS) è stata utilizzata per caratterizzare ulteriormente le caratteristiche strutturali di Aβ durante l'aggregazione. L'MMS misura gli spettri di assorbimento del peptide mediante scansione ottica attraverso la banda dell'ammide I, che riflette una combinazione di modelli di legame idrogeno, interazioni dipolo-dipolo e orientamenti geometrici in tutto il peptide. Poiché si tratta di una nuova tecnica e il foglio α è una struttura non standard, abbiamo utilizzato forcine per fogli α progettati in modo sintetico come composti modello per aiutare a interpretare gli spettri, insieme ai controlli per altre strutture secondarie convenzionali: forcine per fogli α progettati (AP5, AP90 , AP407 e AP421), peptidi -sheet (P411) e α-elica (PSMα1) (sequenze e mappatura dei colori fornite in SI Appendice, Tabella S2). Ogni classe di peptidi ha prodotto caratteristiche spettrali distintive, come mostrato nei grafici secondari derivati ​​della regione dell'ammide I (Fig. 1D). Ciò è ulteriormente illustrato sottraendo lo spettro del peptide α-sheet AP407 dagli altri campioni, evidenziando le somiglianze tra i diversi peptidi α-sheet con la più grande differenza a 1.680 nm, che supponiamo sia dovuto al migliorato allineamento del dipolo dalla stabilizzazione del Struttura del foglio α nella forcina a causa della reticolazione disolfuro (Fig. 1E). Inoltre, si prevedeva che questa banda fosse dominante per la struttura del foglio α non solvatato (43) e confermata sperimentalmente dalla spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier convenzionale (FTIR) di film secchi (29, 38, 39).

Dopo aver stabilito le caratteristiche spettrali dei composti modello, abbiamo analizzato il campione di Aβ più tossico (24 h) e abbiamo riscontrato che il suo spettro è coerente con il foglio α e distinto dal foglio e dall'α-elica (Fig. 1 D e E). In effetti, lo spettro dell'oligomero Aβ si sovrappone bene agli altri spettri del foglio α. Con l'aumentare del tempo di aggregazione, lo spettro Aβ si è spostato ed era più simile al nostro controllo del foglio (P411) piuttosto che a uno qualsiasi dei nostri progetti di fogli α (120 h, Fig. 1 D e E), ma si noti lo spostamento nel campione Aβ di 120 ore rispetto al tornante β monomerico P411. Tali spostamenti sono osservati di routine tra la struttura β convenzionale e le fibrille mediante FTIR (44). Coerentemente con i risultati di ThT e CD, la struttura del foglio α ha preceduto la formazione del foglio . Inoltre, è stato recentemente scoperto che le fibrille di un frammento di una variante della proteina amiloidogenica transtiretina contengono segnali spettroscopici di entrambe le strutture α-sheet e β-sheet mediante FTIR, fornendo ulteriore supporto per la presenza di α-sheet nei sistemi amiloidi e la possibilità di coesistenza di un foglio α e (27, 45).


Domande frequenti - Autofagia e LC3

Atg4 scinde pro-LC3 per formare LC3-I che poi viene coniugato a PE (da Atg7) per la generazione di LC3-II. Quest'ultimo viene reclutato nella membrana autofagosomica per aiutare l'allungamento della membrana. ATG7 media anche la formazione del complesso ATG5-ATG12-ATG16 e quest'ultimo insieme a LC3-II è altamente critico per la formazione dell'autofagosoma. La proteina adattatore p62/SQSTM1 si lega alle proteine ​​ubiquitinate e LC3-II per mediare l'autofagia tramite la localizzazione in compartimenti autofagici, trasportando proteine ​​ubiquitinate e organelli per la degradazione.

Finora sono stati studiati diversi marcatori molecolari dell'autofagia, ma la conversione di LC3-I in LC3-II tramite la coniugazione con fosfatidiletanolammina (PE) è stata accettata come il gold standard per la formazione di autofagosomi. Anche p62/SQSTM1 è importante poiché è un substrato per LC3 che facilita la degradazione selettiva durante l'autofagia. Alcune delle principali proteine ​​coinvolte nella segnalazione dell'autofagia sono:

Alcune delle principali proteine ​​coinvolte nella segnalazione dell'autofagia

Che cos'è LC3 e in che modo è correlato o diverso da Atg8?
LC3 è stato originariamente identificato come una subunità delle proteine ​​1A e 1B associate ai microtubuli (MAP1LC3) ed è stato successivamente scoperto che presenta somiglianze con la proteina di lievito Atg8 (chiamata anche Apg8, Aut7 o Cvt5). I mammiferi omologhi del lievito sono suddivisi in due grandi sottofamiglie: MAP1LC3/LC3 (LC3A, LC3B e LC3C) e GABARAP (GABARAP, GABARAPL1 e GABARAPL2/GATE-16). Sia LC3 che GABARAP sono espressi come proteine ​​precursori che subiscono scissione seguita da lipidazione/coniugazione PE per generare rispettivamente LC3-II e GABARAP-PE. Oltre a GABARAPL2, è stato documentato che tutti gli omologhi Atg8 dei mammiferi svolgono un ruolo nella biogenesi dell'autofagosoma. Inoltre, a causa delle caratteristiche uniche nella distribuzione delle loro cariche di superficie molecolare, è stato suggerito che LC3 e GABARAP riconoscano insiemi distinti di carichi per l'autofagia selettiva. Torna alle FAQ

Qual è la differenza tra LC3A, LC3B e LC3C o LC3-I e LC3-II?
LC3 è una proteina solubile con una massa molecolare di ∼17 kDa ed è distribuita ubiquitariamente negli eucarioti. È espresso come le varianti di giunzione LC3A, LC3B e LC3C che mostrano una distribuzione tissutale unica. Tutte le isoforme LC3 subiscono modifiche post-traduzionali, in particolare la coniugazione PE (lipidazione) durante l'autofagia. Al segnale autofagico, la forma citosolica di LC3 (LC3-I) è coniugata a PE per formare il coniugato LC3-PE (LC3-II), che viene reclutato nelle membrane autofagosomiche. Torna alle FAQ

Analisi WB di HeLa (1), HeLa + Clorchina/CQ (2), SHSY5Y (3), SHSY5Y +CQ (4), A431 (5), A431 +CQ (6) e Ntera2 (7) utilizzando l'anticorpo policlonale di coniglio LC3 alla concentrazione di 2 ug/ml.

ICC/IF di cellule HeLa trattate con CQ utilizzando anticorpi LC3B (NBP2-46892) e tubulina (NB100-690) con rilevamento tramite Dylight 488 (verde) e Dylight 550 (rosso) rispettivamente secondari. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI (blu).

È possibile distinguere i pool di LC3-I e LC3-II in saggi di immunocolorazione con due diversi anticorpi marcati con fluorescenza?
No, poiché la principale differenza tra LC3-I e LC3-II è il loro stato di lipidazione (la frazione PE coniugata), è noto che tutti gli anticorpi LC3 disponibili in commercio rilevano entrambe le forme. A nostra conoscenza, non esistono anticorpi che rilevano solo un'isoforma. Torna alle FAQ

Quando si esegue il Western blot di LC3, quale percentuale di gel dovrebbe essere selezionata per la sua separazione efficace?
Il peso molecolare previsto di LC3 è

17kDa e le forme elaborate LC3-I/II si presentano tra 14-18kDa nell'analisi WB. Per un'efficace separazione delle due forme, si consiglia di utilizzare un gel con gradiente 16% o 4-20%. Se si esegue un gel al 16%, assicurarsi che il gel non venga sovraccaricato. La proteina LC3 può fuoriuscire dal gel a causa della sua rapida mobilità/basso peso molecolare. L'utilizzo di una percentuale di gel inferiore, il caricamento di quantità elevate di campione e l'esecuzione del gel ad alta tensione può causare una separazione/sovrapposizione inappropriata delle bande LC3-I e LC3-II, il che rende molto difficile distinguere tra le due bande target e complica l'interpretazione dei dati. Torna alle FAQ

Ci sono suggerimenti per la fase di trasferimento nel saggio Western blot di LC3?
Dopo l'esecuzione della fase, equilibrare correttamente il gel nel tampone di trasferimento per rimuovere l'intero tampone in esecuzione dal gel. È importante sottolineare che assicurarsi di non aggiungere nemmeno tracce di SDS al buffer di trasferimento. Alcuni ricercatori trovano migliore utilizzare la membrana PVDF rispetto alla membrana di nitrocellulosa per il rilevamento di LC3. Quando si sceglie una membrana, si consiglia una dimensione dei pori di 0,2 um. Poiché LC3 è una proteina significativamente piccola, non dovrebbero essere utilizzate membrane con una dimensione dei pori di 0,45 um (LC3 può attraversare la membrana). La tensione/corrente per il trasferimento dovrebbe essere mantenuta bassa e dovrebbe anche essere evitato un trasferimento prolungato per evitare che la proteina bersaglio attraversi la membrana. Dopo aver eseguito il trasferimento, si dovrebbe usare la colorazione Amido black o Ponceau S per visualizzare il trasferimento proteico e per assicurarsi che le proteine ​​si siano effettivamente trasferite nella regione a basso peso molecolare (intervallo 15-20 kDa). Torna alle FAQ

Qual è il miglior tampone bloccante per il saggio Western blot LC3?
Nei nostri test di convalida degli anticorpi, le condizioni con cui abbiamo avuto il maggior successo sono il 5% di latte in polvere scremato in TBST come tampone bloccante. Si consiglia almeno 1 ora di blocco su agitatore lento a temperatura ambiente. Il tampone bloccante deve essere preparato fresco perché il vecchio tampone bloccante (con potenziale contaminazione microbica) può portare a problemi come sfondo elevato o comparsa di grandi punti sul blot. Torna alle FAQ

Quale controllo positivo posso usare per il Western blot di LC3?
Novus offre il lisato cellulare trattato/non trattato con clorochina HeLa (NBP2-49689) e il lisato cellulare trattato/non trattato con clorochina Neuro2a (NBP2-49688), che sono controlli positivi altamente raccomandati per il dosaggio WB di LC3. I lisati di sovraespressione di LC3 come NBP2-04906, o un lisato cellulare totale da cellule affamate di siero che mostrano un'eccessiva vacuolizzazione sono altre opzioni da utilizzare come controllo positivo quando si esegue l'analisi WB di LC3. Torna alle FAQ

- Le cellule Neuro2A (neuroblastoma di topo) sono state trattate con (+) e senza (-) 50 uM di clorochina durante la notte. Approssimativamente 10 ug di ciascun lisato cellulare intero in 1x tampone campione Laemmli (NBP2-49688) sono stati separati su un gel gradiente mediante SDS-PAGE, trasferiti su una membrana PVDF da 0,2 um e bloccati in latte scremato al 5% in TBST. La membrana è stata sondata con 1 ug/ml di anticorpo anti-LC3 (NB100-2220) e 1 ug/ml di anti-alfa tubulina (NB100-690) e rilevata con gli anticorpi secondari appropriati mediante chemiluminescenza.

– Le cellule HeLa (carcinoma cervicale umano) sono state trattate con (+) e senza (-) 50 uM di clorochina durante la notte. Approssimativamente 10 ug di ciascun lisato di cellule intere in tampone campione 1x Laemmli (NBP2-49689) sono stati separati su un gel gradiente mediante SDS-PAGE, trasferiti su una membrana PVDF da 0,2 um e bloccati in latte scremato al 5% in TBST. La membrana è stata sondata con 1 ug/ml anti-LC3 (NB100-2220) e 1 ug/ml anti-alfa tubulina (NB100-690), e rilevata con gli anticorpi secondari appropriati mediante chemiluminescenza.

Per quanto tempo le cellule dovrebbero essere affamate di siero per indurre l'autofagia?
A seconda del tipo di cellula, la fame di siero può richiedere da poche ore a un massimo di due giorni per indurre l'autofagia. Tuttavia, sottoporre le cellule a mezzi come la soluzione salina bilanciata di Earle o la soluzione salina bilanciata di Hank può indurre l'autofagia in punti temporali che vanno da pochi minuti a un paio d'ore. La chiave sarebbe osservare le cellule per i cambiamenti morfologici e la comparsa di un gran numero di vacuoli nelle cellule è un buon indicatore dell'induzione della morte autofagica. Torna alle FAQ

Non vedo la banda LC3-II nella mia macchia. Come posso risolvere questo problema?
L'espressione di LC3-II è correlata all'induzione dell'autofagia e verrà rilevata solo quando è presente una significativa attività autofagica nei campioni da testare. Prima di produrre lisati da cellule in coltura, assicurati di cercare i cambiamenti morfologici che sono caratteristiche della morte autofagica (in particolare l'eccessiva vacuolizzazione). Se si lavora sui tessuti, va notato che le cellule autofagiche vengono eliminate più rapidamente in vivo e l'inclusione di un controllo positivo basato sul blocco del flusso autofagico (come NBP2-49688 o NBP2-49689) può essere utile nell'analisi dell'entità di attività autofagica nei tessuti in esame. Torna alle FAQ

I miei campioni di controllo mostrano anche livelli molto elevati di LC3II. Cosa significa?
Alcune linee cellulari possono avere livelli basali di autofagia più elevati di altre e in questi casi il campione di controllo mostrerà livelli elevati di LC3-II. Un'eccessiva fame prima dei trattamenti di interesse può anche portare alla rilevazione di alti livelli di LC3-II nei campioni di controllo. Torna alle FAQ

Nell'analisi Western blot, posso visualizzare le bande di controllo del caricamento, ma non vedo nessuna banda per LC3. C'è qualcosa che non va con il mio anticorpo primario?
Può essere anche un problema relativo all'anticorpo primario, ma prima di trarre questa conclusione, si possono considerare anche altre potenziali ragioni. Prima di produrre i lisati dalle cellule in coltura, assicurati di esaminare la morfologia delle cellule per confermare se l'autofagia viene indotta o meno (un'eccessiva vacuolizzazione è un buon indicatore di autofagia). Utilizzare il gel al 4-20% per la separazione e non eseguire il gel ad alta tensione. La dimensione dei pori della membrana di trasferimento dovrebbe essere

0.2 um, e il buffer di trasferimento non deve contenere SDS. Dopo il trasferimento, utilizzare la colorazione Amido black o Ponceau S per vedere se sono state trasferite proteine ​​nella regione a basso peso molecolare (intervallo 15-20 kDa). Al fine di fornire temperatura/tempo ottimale per l'interazione antigene-anticorpo, eseguire l'incubazione primaria a temperatura ambiente per un paio d'ore, seguita da un'incubazione notturna a 4°C. Torna alle FAQ

Oltre alle bande LC3-I/II, vedo un segnale sopra

40kDa anche nei miei campioni. È una banda non specifica o potenzialmente un dimero di LC3?
In letteratura, è stato dimostrato che l'omologo LC3 GABARAP assume una conformazione dimerica necessaria per legarsi ai microtubuli e ai recettori GABA (Nymann-Andersen et al. 2002). Baisamy et al. Il 2009 ha dimostrato che LC3 con tag FLAG e GFP sono in grado di co-immunoprecipitare dai lisati cellulari HEK-293, suggerendo che LC3 può formare oligomeri all'interno delle cellule. Hanno inoltre proposto che in questa configurazione, il legame di LC3 potrebbe promuovere un cambiamento conformazionale che influisce sull'attività Rho-GEF di AKAP-Lbc. Pertanto, riteniamo che nei blot LC3, le bande che corrono sopra la posizione di 40 kDa potrebbero provenire dalle potenziali forme dimeriche/oligomeriche di LC3. Torna alle FAQ

Anticorpo ATG5 [NB110-53818] Analisi WB di lisati da cellule staminali/ES embrionali di topo wild-type (atg+/+) e cellule ES di topo knockout ATG5 (controllo negativo atg-/-) che mostrano una banda specifica del coniugato Atg5-Atg12 a Posizione 56 kDa.

Anticorpo p62/SQSTM1 [NBP1-48320] Le cellule HeLa sono state trattate con (+) o senza (-) 50 uM di clorochina per 24 ore e i lisati cellulari interi sono stati analizzati in WB utilizzando anti-p62/SQSMT1 e anti-alfa tubulina ( NB100-690 controllo caricamento).

Dove posso trovare inibitori o induttori dell'autofagia?
Tocris (un marchio bio-techne) è un nome affermato nel campo delle piccole molecole bioattive e offre diversi inibitori/induttori dell'autofagia:

Novus offre peptidi per l'induzione dell'autofagia?
Sì, offriamo il peptide Tat-D11 (NBP2-49888) utile per l'induzione in vitro e in vivo dell'autofagia. Strutturalmente, Tat-D11 è una versione più breve di Tat-Beclin 1 che è stata progettata da Shoji-Kawata et al 2013 come un peptide composto dalla regione di Beclin 1 che induce l'autofagia fusa con la proteina HIV-Tat. Meccanicisticamente, questi peptidi inducono l'autofagia attraverso l'interazione con il regolatore negativo dell'autofagia GAPR-1/GLIPR2. In particolare, rispetto a Tat-Beclin 1, Tat-D11 aumenta l'induzione di autofagosomi e autolisosomi di oltre cinque volte. Torna alle FAQ

Analisi al microscopio a fluorescenza di GFP-puncta in cellule HeLa che esprimono GFP-LC3B trattate con scrambled peptide Tat-L11S (NBP2-49887) o peptide Tat-D11 (NBP2-49888).

Per l'immunocitochimica/immunofluorescenza (ICC/IF) di LC3, come devo riparare le mie cellule? Devo permeabilizzare le cellule?
Nel nostro test di convalida QC degli anticorpi LC3, fissiamo regolarmente varie cellule in paraformaldeide/PFA al 4% (cioè formalina tamponata al 10%) per 10 minuti a temperatura ambiente. Sì, la permeabilizzazione è un passaggio necessario perché LC3 si localizza nel citosol e nelle membrane degli autofagosomi. Nel nostro laboratorio, usiamo 0,1-0,5% triton X100 per 10 minuti per permeabilizzare le cellule fissate con paraformaldeide. È importante sottolineare che la fase di permeabilizzazione non è richiesta quando si fissano le cellule in metanolo per 5 minuti poiché il metanolo stesso agisce come agente permeabilizzante. Torna alle FAQ

Devo includere una fase di recupero dell'antigene durante l'esecuzione dell'IHC-P di LC3?
Il recupero dell'antigene è generalmente un passaggio necessario quando i tessuti sono fissati in PFA al 4% (cioè formalina tamponata al 10%) per più di 4-6 ore. Per i metodi di routine IHC-P, il tempo di fissazione varia da 6 a 24 ore e si dovrebbe evitare una fissazione eccessiva poiché può portare a un'eccessiva reticolazione delle proteine ​​nei tessuti fissati. I tessuti troppo fissati richiederanno un recupero dell'antigene più rigoroso che può portare allo sviluppo di falsi segnali. Nel nostro laboratorio, usiamo abitualmente un metodo basato su tampone citrato di sodio 10 mM (pH 6,0) per il recupero dell'antigene indotto dal calore, in cui incubare i vetrini nel tampone a una temperatura di sub-ebollizione per 10 minuti seguito dal raffreddamento dei vetrini (mentre nel recupero tampone) per 30 minuti a temperatura ambiente. Torna alle FAQ

Quale pattern di colorazione devo aspettarmi nel dosaggio IHC-P di LC3?
LC3-I si trova nel citosol mentre LC3-II si localizza negli autofagosomi e in IHC-P si può osservare una colorazione citoplasmatica diffusa (LC3-I) con colorazione puntiforme (LC3-II) nelle cellule in fase di morte autofagica. Per le immagini di riferimento sulla colorazione LC3 IHC, suggeriamo di controllare pubblicazioni come Parajuli e MacMillan-Crow 2013, Kang et al. 2013, Guo et al. 2011, Shintaku 2011, e altri elencati nella sezione Recensioni e pubblicazioni delle schede tecniche dei nostri anticorpi LC3. Torna alle FAQ

Vedo una colorazione diffusa di LC3 in IHC-P. Come posso confermare se è LC3 e non uno sfondo non specifico?
Per LC3 dovrebbe essere previsto un pattern di colorazione da diffuso a puntato e, al fine di confermare la specificità dell'immunoreattività, suggeriamo i seguenti controlli nel test IHC-P: controllo negativo (nessun primario, nessun controllo secondario), solo controllo negativo secondario ( nessun primario aggiunto) e controllo del blocco peptidico (Peptide Competition Protocol). A seconda dell'esito della colorazione nei campioni di test/controllo, è possibile adottare misure aggiuntive seguendo i suggerimenti per la risoluzione dei problemi appropriati dalla nostra pagina Supporto per applicazione. Torna alle FAQ

Per la colorazione di LC3 IHC-P, è normale ottenere un segnale nel nucleo delle cellule?
La maggior parte delle pubblicazioni di ricerca suggerisce che la forma LC3-I è citosolica mentre la forma LC3-II si localizza sulle membrane autofagosomiche delle cellule in fase di morte autofagica. Ci sono alcuni rapporti di ricerca, tuttavia, che mostrano la localizzazione nucleare di LC3. Per ulteriori informazioni sulla localizzazione/la rilevanza biologica del pool nucleare di LC3, si consiglia vivamente di rivedere le seguenti pubblicazioni – Hasui et al. 2011, Drake et al. 2010, Martinez-Lopezand et al. 2013, e Karim et al. 2007. Dal punto di vista del dosaggio, è utile controllare il tempo di fissazione poiché una fissazione inappropriata/sotto fissazione può portare alla dispersione di LC3 nei nuclei cellulari dei tessuti dissezionati o delle cellule in coltura. L'ottimizzazione delle ricette/tempi di permeabilità e della concentrazione o del tempo di incubazione dell'anticorpo primario può anche migliorare la localizzazione e la sensibilità. Torna alle FAQ

Esistono altre risorse o linee guida sui suggerimenti per lavorare con LC3?
Sì, una delle migliori risorse sono le "Linee guida per l'uso e l'interpretazione dei test per il monitoraggio dell'autofagia (3a edizione)" recentemente documentate (Klionsky et al. 2016). Raccomandiamo anche "Come interpretare l'immunoblotting LC3" di Mizushima e Yoshimori 2007 e "Autophagy: assays and artefacts" di Barth et al. 2010. Torna alle FAQ


Risultati

La segnalazione mediata da TCR sostenuta è correlata alla proliferazione, mentre la segnalazione transitoria è parallela alla mancanza di risposta

Le cellule T umane periferiche sono state stimolate utilizzando sAbs o iAbs. Questi stimoli inducono cinetiche di attivazione e risposte cellulari notevolmente diverse (Figura 1). La stimolazione con sAbs ha determinato un'induzione forte e transitoria della fosforilazione globale della tirosina, nonché di ZAP70, LAT e PLCγ-1. Al contrario, quando le cellule T umane primarie sono state trattate con iAbs, la fosforilazione globale della tirosina e la fosforilazione di ZAP70, LAT e PLCγ-1 erano deboli, ma sostenute (Figura 1A, B). Inoltre, la fosforilazione di TCRζ è stata notevolmente e rapidamente migliorata su sAbs. Al contrario, la stimolazione di iAbs induce solo una debole fosforilazione del TCRζ (Figura 1C). È interessante notare che la cinetica di fosforilazione di PAG/Cbp, una proteina adattatrice transmembrana che funziona a circa 70 KDa che viene defosforilata alla stimolazione con TCR [9], è paragonabile in entrambe le condizioni di stimolazione (Figura 1A). Successivamente abbiamo analizzato la cinetica di segnalazione della cascata di Erk. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che Erk era fortemente attivato in entrambe le condizioni di stimolazione. Tuttavia, l'attivazione indotta da iAbs è stata sostenuta ed è durata fino a 90 minuti mentre, dopo la stimolazione con sAbs, l'attivazione di Erk è stata transitoria, ha raggiunto il picco a 1-5 minuti e successivamente è diminuita rapidamente (Figura 1D). Pertanto, nonostante la debole attivazione delle molecole di segnalazione prossimali, gli iAb sono in grado di indurre un'attivazione forte e prolungata delle vie di segnalazione a valle.

Analisi della firma di segnalazione e degli effetti funzionali della stimolazione di sAbs e iAbs. ANNO DOMINI) Le cellule T umane purificate sono state trattate con mAb CD3xCD28 solubili (sAbs) o immobilizzati (iAbs) per i periodi di tempo indicati. lisati cellulari totali (A, B, e D) o TCRζ immunoprecipitati C) sono stati preparati e analizzati mediante Western blotting utilizzando gli Abs indicati. Viene mostrato un immunoblot rappresentativo di almeno 3 esperimenti indipendenti. La fosforilazione di TCRζ è stata quantificata utilizzando il software 1D ImageQuant e i valori sono stati normalizzati al corrispondente segnale TCRζ totale. I dati rappresentano la media dei livelli di fosforilazione mostrati come unità arbitrarie ± SEM di 3 esperimenti indipendenti. E) Le cellule T sono state etichettate con CFSE e stimolate come indicato. La proliferazione è stata valutata dopo 72 ore analizzando il contenuto di CFSE su un FACS Calibur. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di tre esperimenti indipendenti.

È generalmente accettato che i segnali transitori innescati da anticorpi solubili non possano indurre risposte produttive delle cellule T. Infatti, noi e altri abbiamo dimostrato che le cellule T periferiche umane, le cellule T transgeniche OT-I di topo e i cloni di linfociti T citotossici non sono attivati ​​e non si differenziano dopo stimolazione con anticorpi reticolati in sospensione [7, 8, 10] . Qui, abbiamo stimolato le cellule T umane primarie con sAbs o iAbs e analizzato le loro risposte funzionali. Il trattamento con sAbs non è riuscito a indurre la proliferazione delle cellule T (Figura 1E). Al contrario, la Figura 1E mostra che il trattamento delle cellule T con iAbs ha portato a una forte risposta proliferativa.

La segnalazione transitoria è regolata tramite feedback normativi negativi

I dati presentati sopra, mostrano che sAbs ha indotto una cinetica di segnalazione mediata da TCR rapida, ma transitoria, che non può indurre una risposta produttiva delle cellule T, mentre la stimolazione con iAbs ha provocato un'attivazione prolungata di una varietà di molecole di segnalazione e ha portato alla proliferazione. Questi dati indicano che potrebbero esserci diversi meccanismi regolatori indotti dalla stimolazione di sAbs vs. iAbs. Pertanto, abbiamo successivamente studiato come la segnalazione mediata da TCR è regolata in modo differenziale nelle due condizioni. Abbiamo ipotizzato che una rapida internalizzazione delle molecole di TCR disponibili dopo stimolazione con sAbs potrebbe fornire una spiegazione per la rapida cessazione della segnalazione mediata da TCR. Pertanto, abbiamo confrontato i livelli di espressione del TCR dopo la stimolazione con sAbs o iAbs mediante citometria a flusso. La Figura 2A mostra che gli sAb inducono una bassa velocità di downregulation del TCR, che è diventata evidente dopo 30 minuti di stimolazione. È importante notare che la maggior parte delle molecole di segnalazione che abbiamo testato sono tornate allo stato defosforilato/inattivo già 15 minuti dopo la stimolazione sAbs (Figura 1). Pertanto, la cessazione della segnalazione mediata dal TCR si verifica prima dell'internalizzazione del TCR. D'altra parte, i dati presentati nella Figura 2A mostrano che la stimolazione con iAbs non riduce, ma aumenta leggermente i livelli di TCR. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che l'Abs legato a una matrice solida limita l'internalizzazione del TCR, ma non interferisce con il suo trasporto alla membrana plasmatica. Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che la segnalazione e la proliferazione mediate dal TCR possono verificarsi in condizioni di stimolazione che inducono la downregulation del TCR [7]. Pertanto, sulla base di queste osservazioni, escludiamo che l'internalizzazione del TCR indotta da sAbs sia la causa del segnale transitorio.

sAbs, ma non iAbs, inducono cicli di feedback inibitori. Le cellule T umane purificate sono state trattate con mAb CD3xCD28 solubili (sAbs) o immobilizzati (iAbs) per i punti temporali indicati. UN) Misurazione dell'internalizzazione del TCR. L'espressione del TCR è stata valutata mediante analisi della colorazione di mAb anti-TCRαβ coniugato con PE mediante citometria a flusso. I dati rappresentano la % dell'intensità di fluorescenza media (MFI) dell'espressione del TCR rispetto al tempo 0 di 4 esperimenti indipendenti. B) La fosforilazione di c-Cbl su Y 731 e Dok2 su Y 351 è stata determinata mediante Western blotting. Le bande c-Cbl e Dok2 fosforilate sono state quantificate utilizzando il software 1D ImageQuant e i valori sono stati normalizzati al segnale -actina corrispondente. I dati rappresentano la media dei livelli di fosforilazione mostrati come unità arbitrarie ± SEM di almeno 4 esperimenti indipendenti. C) L'espressione di ZAP70 è stata determinata mediante Western blotting. Lo stesso carico viene mostrato riprovando immunoblot con anticorpi specifici per -actina. Le bande ZAP70 sono state quantificate come sopra. I dati rappresentano la media dei livelli di espressione mostrati come unità arbitrarie ± SEM di 6 esperimenti indipendenti. D) La fosforilazione in tirosina di Fyn e Lck nell'ansa di attivazione è stata determinata mediante Western blotting utilizzando l'anticorpo pSrc (Y 416). Le bande sono state quantificate utilizzando il software 1D ImageQuant e i valori sono stati normalizzati ai corrispondenti segnali Fyn e Lck totali. I dati sul grafico rappresentano la media dei livelli di fosforilazione mostrati come unità arbitrarie ± SEM di 4 esperimenti indipendenti. Gli asterischi (*) indicano la catena pesante Ig. Analisi statistica ** P<0.01 ns, non statisticamente significativo.

Dopo aver escluso questa possibilità, ci siamo quindi concentrati sull'analisi degli eventi di regolazione del feedback, che hanno dimostrato di svolgere un ruolo cruciale nell'attivazione delle cellule T [11-13]. Gli anelli di retroazione prossimali negativi possono essere attivati ​​dal segnale del TCR e possono regolare l'ampiezza, la durata e la specificità del segnale (rivisto in Acuto et al. [13]). Abbiamo posto la domanda se la stimolazione con sAbs abbia indotto l'attivazione di molecole regolatrici negative che possono terminare la segnalazione, determinando così il segnale transitorio osservato sopra. Tra le molte molecole inibitorie che organizzano circuiti regolatori negativi, abbiamo deciso di concentrarci su c-Cbl, una ubiquitina ligasi E3 appartenente alla famiglia CBL, e la proteina adattatrice Dok2, che regolano la segnalazione mediata da TCR attraverso due diversi meccanismi. Mentre i membri della famiglia CBL sono coinvolti nella downregulation delle molecole di segnalazione tramite ubiquitinazione [14], Dok2 e il suo omologo Dok1 inibiscono l'attivazione delle vie di segnalazione competendo per il legame con i domini SH2 o reclutando altri regolatori negativi, come SHIP1 e RasGAP , al segnale TCR [15]. È stato riportato che l'attività di c-Cbl e Dok2 è regolata dalla fosforilazione della tirosina [15-17] e può essere facilmente monitorata utilizzando rispettivamente anticorpi fosfospecifici anti-c-Cbl e anti-Dok2. La Figura 2B mostra che dopo la stimolazione di sAbs, le cellule T hanno fosforilato molto rapidamente e fortemente sia c-Cbl che Dok2, mentre il trattamento delle cellule T umane con iAbs ha determinato solo una fosforilazione molto debole di entrambe le molecole.

c-Cbl prende di mira molte molecole di segnalazione per la degradazione, incluso ZAP70 [18]. Pertanto, abbiamo successivamente testato se sAbs, oltre a indurre una forte fosforilazione di c-Cbl, indurrebbe anche l'ubiquitinazione e la degradazione di ZAP70. Abbiamo precedentemente dimostrato in cellule T OT-I di topo che l'ubiquitinazione di ZAP70 porta alla comparsa di bande ZAP70 che mostrano una migrazione ritardata in SDS-PAGE [7]. Abbiamo verificato se la stimolazione con CD3xCD28 Abs solubili ha portato anche alla comparsa di bande ZAP70 che funzionano a un peso molecolare più elevato nelle cellule T umane primarie e abbiamo scoperto che l'attivazione/fosforilazione di c-Cbl dopo la stimolazione con sAbs è effettivamente correlata con la migrazione ZAP70 ritardata (Figura 2C). Inoltre, i dati presentati nella Figura 2C suggeriscono che la stimolazione con sAbs ha anche indotto la degradazione di ZAP70. Al contrario, la stimolazione con iAbs non ha indotto in modo significativo né la fosforilazione di c-Cbl né la migrazione e la degradazione ritardate di ZAP70 (Figura 2C). Pertanto, sembra che la stimolazione con sAbs attivi cicli di feedback inibitori che potrebbero essere responsabili della terminazione della segnalazione mediata dal TCR.

Oltre a indurre una forte fosforilazione della tirosina di c-Cbl e Dok2, la stimolazione con sAbs comporta anche una forte fosforilazione delle molecole di segnalazione prossimale del TCR tra cui TCRζ, ZAP70 e LAT (Figura 1B, 1C). Pertanto, abbiamo studiato se gli sAbs inducono un'attivazione più forte delle tirosin chinasi Lck e Fyn rispetto agli iAbs. Abbiamo immunoprecipitato il TCRζ e valutato il livello di Lck e Fyn attivi associati al TCR. Come mostrato nella Figura 2D, la stimolazione sAbs aumenta significativamente il livello di Lck e Fyn fosforilati sul ciclo di attivazione, che si ritiene sia un segno di un enzima attivo. Al contrario, questo aumento significativo della fosforilazione di Lck e Fyn non si osserva dopo la stimolazione di iAbs. Quindi, i dati suggeriscono che, in netto contrasto con iAbs, la stimolazione con sAbs migliora l'attivazione di Lck e Fyn. Ipotizziamo che l'attivazione potenziata di Lck e Fyn possa comportare una più forte fosforilazione della tirosina delle molecole a valle (compresi i regolatori negativi, come c-Cbl e Dok2), che potrebbero sbilanciare la segnalazione mediata dal TCR, attenuando così l'attivazione delle cellule T.

L'attivazione sostenuta è regolata da circuiti di feedback positivi

Successivamente abbiamo studiato se i loop di feedback positivi possono essere attivati ​​da iAbs, portando così all'attivazione prolungata della segnalazione mediata da TCR. In particolare, abbiamo esplorato il circuito regolatorio che coinvolge la fosforilazione di Lck da parte di Erk attivato [11]. Questo modello si basa su osservazioni che mostrano che la fosforilazione di Lck mediata da Erk sulla serina 59 altera la mobilità di Lck e la capacità del dominio SH2 di Lck di legare le fosfotirosine [19-21]. Stefanova et al. ha inoltre dimostrato che la fosforilazione di Lck mediata da Erk impedisce il legame di SHP-1, interferendo così con l'inattivazione di Lck mediata da SHP-1 [11]. Secondo questo modello, l'Erk attivo darebbe un feedback a Lck per sostenere la segnalazione. Per valutare se la stimolazione con iAbs innesca questo ciclo di feedback positivo mediato da Erk, le cellule T sono state stimolate con iAbs e sAbs e la fosforilazione di Lck su S 59 è stata rilevata dalla comparsa di una nuova banda Lck in esecuzione a 59 kDa mediante Western blot [11 ]. Come mostrato nelle Figure 3A e B, la stimolazione delle cellule T con iAbs ha chiaramente portato alla formazione di p59 Lck (fino al 50% della Lck totale), mentre questo spostamento nel peso molecolare di Lck era appena rilevabile durante il trattamento con sAbs.

Gli iAbs inducono un ciclo di feedback positivo mediato da Erk. UN) Le cellule T umane purificate sono state trattate con mAb CD3xCD28 solubili (sAbs) o immobilizzati (iAbs) per i punti temporali indicati. L'espressione di Lck è stata rilevata nei lisati cellulari mediante immunoblotting anti-Lck. B) Le bande corrispondenti a p56 o p59 Lck sono state quantificate come descritto nella Figura 2. I dati rappresentano il rapporto tra i livelli di p56 e p59 e la Lck totale (p56+p59) mostrata come unità arbitrarie ± SEM di 5 esperimenti indipendenti. C) Le cellule T umane purificate sono state trattate con mAbs CD3xCD28 immobilizzati (iAbs) per i periodi di tempo indicati in presenza o assenza di MEK Inhibitor I o U0126. I campioni sono stati analizzati mediante Western blot utilizzando gli Abs indicati. Viene mostrato un immunoblot rappresentativo di 4 esperimenti indipendenti. D) Le cellule J.CaM1.6 sono state trasfettate con vari costrutti portatori di mutazioni differenti (S42A, S42D, S59A, S59D, S42A/S59A). Dopo la trasfezione, le cellule sono state lasciate non stimolate o stimolate con iAbs per 45 minuti. I campioni sono stati analizzati mediante Western blotting utilizzando gli Abs indicati. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di cinque esperimenti indipendenti.

Per dimostrare che l'aspetto di p59 Lck dipende effettivamente dalla fosforilazione mediata da Erk, le cellule T sono state stimolate con iAbs per 30 minuti in presenza o assenza di U0126 o MEK Inhibitor I, inibitori dell'attivatore di Erk MEK. In precedenza è stato dimostrato che questo trattamento abolisce la conversione di Lck nella forma p59 [11]. In accordo con queste osservazioni, abbiamo anche scoperto che il trattamento delle cellule T stimolate da iAbs con U0126 o MEK Inhibitor I ha completamente abolito sia l'attivazione di Erk che lo spostamento di Lck alla forma p59 (Figura 3C). Successivamente abbiamo testato se lo spostamento molecolare di Lck sulla stimolazione di iAbs è effettivamente indotto dalla fosforilazione di S 59 . Per valutare questo problema, abbiamo sfruttato i costrutti Lck che trasportano mutazioni da S a D e da S ad A in questa posizione, che imitano la fosforilazione costitutiva o prevengono la fosforilazione, rispettivamente. Abbiamo usato i seguenti mutanti S59D, S59A, S42D, S42A e S42A/S59A, che sono stati espressi nella linea di cellule T Jurkat con deficit di Lck J.CaM1.6. Come mostrato nella Figura 3D, le mutazioni di S 42 non influenzano lo spostamento della mobilità di Lck né nelle cellule non stimolate né in quelle stimolate con iAbs. Al contrario, la mutazione S59D determina uno spostamento costitutivo a p59 Lck, indicando così che la fosforilazione in questo sito svolge un ruolo importante nella regolazione della mobilità Lck. Di conseguenza, la sostituzione S59A, che si traduce in un mutante non fosforilabile, impedisce la generazione della forma 59 kDa di Lck su stimolazione iAbs (Figura 3D). In sintesi, questi dati dimostrano che la fosforilazione di Lck mediata da Erk a S 59 si traduce nella sua mobilità ritardata su SDS-PAGE.

Per verificare se l'inibizione della fosforilazione di Lck mediata da Erk abbia comportato anche una riduzione della sua attività, abbiamo studiato i livelli di fosforilazione delle molecole di segnalazione a valle che sono substrati di Lck, come la tirosina chinasi ZAP70 e la proteina adattatrice LAT la cui fosforilazione dipende da ZAP70 . Le cellule T sono state stimolate per 30 minuti con iAbs. Successivamente, l'attività di Erk è stata bloccata dall'aggiunta dell'inibitore MEK U0126. I dati presentati in (Figura 4A, B) mostrano che la fosforilazione di ZAP70 e LAT è ridotta all'inibizione di MEK, indicando così che la fosforilazione di Lck mediata da Erk può migliorare la sua risposta. Al contrario, il trattamento delle cellule T stimolate da sAbs con l'inibitore MEK ha ridotto la fosforilazione di Erk, come previsto, ma non la fosforilazione di ZAP70 o LAT (Figura 4C, D).

Un ciclo di feedback Erk-Lck regola la segnalazione mediata dal TCR. UN) Le cellule T umane purificate sono state trattate con iAbs da soli per 30 minuti e quindi è stato aggiunto DMSO o l'inibitore MEK U0126 e incubate per altri 30-60 minuti. I campioni sono stati analizzati mediante Western blot utilizzando gli Abs indicati. B) Le bande in A) sono state quantificate e i valori sono stati normalizzati come descritto. I grafici mostrano la media dei livelli di fosforilazione di Erk1/2, ZAP70 e LAT o il livello di p59 Lck come unità arbitrarie ± SEM di 4 esperimenti indipendenti. C) Le cellule T umane purificate sono state preincubate in presenza di DMSO o dell'inibitore MEK U0126 e successivamente stimolate con sAbs per i punti temporali indicati. I campioni sono stati analizzati mediante Western blot utilizzando gli Abs indicati. D) bande in C) sono stati quantificati come descritto sopra e sono mostrati i dati di almeno due esperimenti indipendenti.

Collettivamente, questi dati suggeriscono che la stimolazione con iAbs attiva un ciclo di feedback positivo mediato da Erk che è necessario per una corretta risposta e proliferazione delle cellule T. È importante sottolineare che il circuito regolatorio indotto da iAbs sembra imitare un meccanismo precedentemente descritto che viene indotto nelle cellule T dopo stimolazione fisiologica [11].

Il miglioramento della fosforilazione delle chinasi Src converte il segnale sostenuto in un segnale transitorio

I dati presentati sopra suggeriscono che sAbs e iAbs inducono segnali qualitativamente diversi e regolazione del feedback che vengono tradotti in risposte cellulari distinte. Il modo in cui la cellula percepisce la qualità del segnale non è ancora completamente compreso. I nostri dati suggeriscono che gli sAbs inducono una più forte attivazione delle chinasi Src e un modello di fosforilazione della tirosina più forte rispetto alla stimolazione degli iAbs (Figura 1). Queste osservazioni possono suggerire che le chinasi Src siano coinvolte nella decifrazione della natura del segnale. Per testare il contributo di Lck, la principale chinasi Src nelle cellule T, nella regolazione della dinamica del segnale, abbiamo soppresso la sua espressione da parte dell'RNAi nelle cellule T Jurkat e valutato gli effetti sull'attivazione di Erk. La Figura 5A mostra che le cellule che esprimono una bassa quantità di Lck hanno mostrato un'attivazione prolungata di Erk1/2.Queste osservazioni sono in linea con studi precedenti che mostrano che il knockdown di Lck in Jurkat e le cellule T umane primarie hanno prolungato la fosforilazione di Erk e l'attivazione trascrizionale [22, 23].

La fosforilazione di Lck è correlata alla ridotta attivazione delle cellule T. UN) Le cellule T Jurkat sono state trasfettate con Lck siRNA duplex o siRNA control (Ctrl) e coltivate per 48 ore. Successivamente, le cellule sono state stimolate con CD3 mAbs solubili (clone OKT3) per i tempi indicati. I lisati cellulari sono stati analizzati mediante immunoblotting utilizzando gli Abs indicati. Viene mostrato l'immunoblot che verifica la downregulation di Lck. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. B)-D) Cellule CD4 + T umane purificate sono state trattate con mAb CD3xCD28 immobilizzati (iAbs) in presenza o assenza di mAb CD4 reticolato come indicato. B) I livelli di fosforilazione delle chinasi Erk1/2 e Src sono stati determinati mediante Western blotting. Le bande fosfo-specifiche sono state quantificate utilizzando il software 1D ImageQuant e i valori sono stati normalizzati al corrispondente segnale di -actina. I dati sul grafico rappresentano la media dei livelli di fosforilazione mostrati come unità arbitrarie ± SEM di 3 esperimenti indipendenti. C) 24 ore dopo la stimolazione, l'attivazione delle cellule CD4 + T è stata analizzata mediante colorazione con CD69 e citometria a flusso. I dati sul grafico rappresentano la media dei livelli di espressione mostrati come unità arbitrarie ± SEM di 3 esperimenti indipendenti. D) Le cellule CD4 + T sono state etichettate con CFSE e stimolate come indicato. La proliferazione è stata valutata dopo 72 ore analizzando il contenuto CFSE su un LSRFortessa. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti.

Successivamente abbiamo deciso di indagare se una forte fosforilazione di Lck e Fyn possa convertire un segnale sostenuto in un segnale transitorio. A questo scopo, le cellule T umane primarie CD4 + sono state stimolate con iAbs per un breve periodo di tempo e successivamente CD4 è stato reticolato utilizzando mAbs anti-CD4 solubili. È noto che la reticolazione CD4 risulta in trans-fosforilazione di Lck, potenziandone così fortemente l'attività. Come presentato nella Figura 5B, la reticolazione CD4 ha effettivamente provocato una forte induzione della fosforilazione di Lck misurata utilizzando un anticorpo anti-pY 416 Src. Ancora più importante, la fosforilazione di Lck migliorata è stata parallela a una significativa riduzione della fosforilazione di Erk (Figura 5B). Di conseguenza, abbiamo scoperto che anche l'espressione e la proliferazione di CD69 erano fortemente ridotte in seguito alla reticolazione di CD4 (Figura 5C, D). Questi dati suggeriscono che una forte attività della chinasi della famiglia Src può provocare l'attivazione di segnali inibitori che sopprimono l'attivazione delle cellule T.

In sintesi, abbiamo dimostrato che la stimolazione con iAbs induce una diversa regolazione del feedback rispetto al trattamento con sAbs (Figura 6). I sAbs portano a una forte e rapida attivazione delle chinasi Src e successivamente alla fosforilazione di molecole inibitorie (ad esempio c-Cbl, Dok2), che terminano la segnalazione. D'altra parte, gli iAbs inducono solo un leggero aumento dell'attività della chinasi e un ciclo di feedback positivo Erk-Lck, che potrebbe essere necessario per prevenire una rapida defosforilazione di Lck da parte di SHP-1 o altre fosfatasi, e quindi portare a un'attivazione prolungata.

Regolazione in retroazione della segnalazione mediata da TCR. La stimolazione sAbs innesca una forte fosforilazione delle chinasi Src, come Lck, e porta a una forte attivazione delle vie di segnalazione a valle. Oltre all'attivazione di regolatori positivi, i sAbs inducono anche molecole inibitorie (c-Cbl, Dok2), che potrebbero sbilanciare la segnalazione mediata da TCR, interrompendo così rapidamente l'attivazione delle cellule T (a sinistra). D'altra parte, la stimolazione iAbs provoca l'attivazione di un ciclo di feedback positivo Erk-Lck, che è necessario per sostenere la segnalazione (lato destro).


Discussione

Assegnazione delle frazioni AEC separate

Sulla base della determinazione delle proteine ​​mediante SDS-PAGE e spettrometria di massa, le frazioni AEC da 2 a 4 potrebbero essere assegnate a PSII e PSI. Sebbene la Frazione 1 contenesse subunità proteiche di PSII, le basse quantità di proteine, ma le alte concentrazioni di pigmenti, in questa frazione rendono improbabile che la Frazione 1 sia costituita da complessi proteici di pigmenti specifici. La dominanza delle subunità proteiche PSII nella Frazione 2 sostiene la presenza di un'elevata quantità di complessi core PSII in questa frazione. La frazione 3 conteneva subunità proteiche di PSII e PSI e sembra rappresentare una frazione con una popolazione mista di complessi core PSII e PSI. La frazione 4, d'altra parte, era caratterizzata da un numero inferiore di proteine ​​PSII rispetto alle frazioni 2 e 3 ma conteneva ancora le tre subunità PSI che sono state tipicamente osservate nel presente studio. Ciò suggerisce una maggiore concentrazione di complessi core PSI nella Frazione 4. La Frazione 5, che rappresentava il picco principale del cromatogramma AEC, era caratterizzata da un forte arricchimento di proteine ​​FCP e quindi rappresenta molto probabilmente i complessi FCP periferici di T. pseudonana. L'arricchimento dei complessi core PSII nella Frazione 2 e PSI nella Frazione 4 era in linea con la caratterizzazione spettroscopica di queste frazioni. La frazione 2 conteneva molecole di Chl a che assorbono a lunghezze d'onda più corte nella parte rossa dello spettro che sono tipiche per PSII. La frazione 4, d'altra parte, è stata caratterizzata dalla presenza di molecole Chl che assorbono ed emettono fluorescenza a lunghezze d'onda maggiori tipiche del PSI. La frazione 5 conteneva molecole di Chl a che stavano assorbendo a lunghezze d'onda più corte nella parte rossa dello spettro che è in linea con la presenza di complessi FCP in questa frazione. L'elevata emissione di fluorescenza della frazione 5 nella regione a lunga lunghezza d'onda è molto probabilmente causata da una forte aggregazione degli FCP dall'elevata concentrazione di sale necessaria per l'eluizione come negli esperimenti di Schaller et al. [30] che hanno utilizzato ioni Mg 2+ per aggregare i complessi FCP. In alcuni casi è stata osservata un'emissione a lunghezza d'onda corta per la Frazione 5. In questo caso è ragionevole ritenere che i complessi FCP nella Frazione 5 abbiano mostrato un'aggregazione più debole. Differenze nello stato di aggregazione dei complessi FCP nella Frazione 5 possono essere state causate da lievi differenze nelle condizioni di solubilizzazione delle membrane tilacoidi, che, in generale, non potevano essere isolate con una riproducibilità così elevata come ad es. tilacoidi di spinaci. La frazione 5 ha mostrato elevati rapporti Fx per Chla e Fx per DD che è tipico per i complessi FCP con una funzione primaria di raccolta della luce. Sebbene la Frazione 5 contenesse la maggior parte dei complessi FCP di T. pseudonana, i complessi FCP erano presenti anche nelle frazioni da 2 a 4. Tuttavia, le concentrazioni più elevate di β-carotene delle frazioni da 2 a 4 indicano che i complessi core PSI e PSII e non i complessi FCP erano arricchiti in queste frazioni. La presenza di complessi FCP nei complessi core isolati PSII osservati nel presente studio è in linea con gli studi di Nagao et al. [26, 28]. In questi studi le membrane tilacoidi della diatomea centrica C. gracilis sono stati solubilizzati con Triton X-100 e i complessi core PSII in evoluzione dell'ossigeno sono stati isolati mediante centrifugazione differenziale [26]. Questi preparati FCP contenenti PSII potrebbero quindi essere ulteriormente purificati mediante cromatografia a scambio anionico [28]. Come nella nostra attuale separazione AEC, Ikeda et al. [17, 18] complessi del nucleo PSI isolati con complessi FCP associati dalle diatomee centriche C. gracilis e T. pseudonana con l'aiuto della centrifugazione in gradiente di saccarosio e cromatografia ad esclusione dimensionale [17] o centrifugazione in gradiente di saccarosio in combinazione con AEC [18]. Le procedure di isolamento hanno portato alla purificazione dei complessi del nucleo PSI con due diversi complessi FCP che sono stati denominati FCPI-1 e FCPI-2. FCPI-2 sembra essere strettamente associato al complesso centrale PSI mentre FCPI-1 viene perso dopo un trattamento detergente più severo. Ikeda et al. [18] ha proposto che il complesso FCPI-2 media il trasferimento di energia di eccitazione tra il FCPI-1 più periferico e il nucleo PSI.

Secondo i recenti dati di Gundermann et al. [16] che purificò i complessi FCP della diatomea centrica C. meneghiniana con una combinazione di AEC e centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio è possibile che durante la separazione AEC descritta nel presente studio si sia verificata una coeluizione dei complessi FCPa e dei complessi core PSII e PSI. Il profilo di eluizione AEC presentato da Gundermann et al. [16] mostra un picco pronunciato ad alte concentrazioni di sale che è stato assegnato al complesso FCPb. Ulteriori picchi più piccoli sono stati eluiti dalla colonna a concentrazioni di sale inferiori e sono stati caratterizzati come diversi sottotipi dei cosiddetti complessi FCPa. Mentre il picco FCPb ad alte concentrazioni di sale molto probabilmente corrisponde alla Frazione 5 della presente separazione AEC, i picchi FCPa più piccoli mostrano tempi di ritenzione che sono paragonabili ai tempi di ritenzione delle frazioni PSII e PSI, cioè frazioni da 2 a 4, della nostra separazione proteica . La possibile coeluizione dei complessi FCPa e delle frazioni PSII/PSI rende difficile decidere se gli FCP trovati nelle presenti frazioni PSII e PSI rappresentano proteine ​​antenna che sono strettamente associate ai complessi core del fotosistema o se queste proteine ​​sono subunità di i diversi complessi FCPa di T. pseudonana.

Separazione dei complessi proteici del pigmento di T. pseudonana con il metodo presentato in questo studio è stato confrontato con la separazione delle proteine ​​del pigmento fotosintetico degli spinaci (file aggiuntivo 2A). La separazione delle proteine ​​del pigmento degli spinaci ha portato alla comparsa di un picco maggiore e di diversi picchi minori. Il picco maggiore, che eluiva a 12-15 mL, mostrava pronunciati massimi Chl a e Chl b nella parte blu e rossa dello spettro e poteva essere assegnato inequivocabilmente all'LHCII (File aggiuntivo 3). Il breve tempo di ritenzione dell'LHCII indica che il principale complesso di raccolta della luce delle piante superiori mostra una carica netta negativa piuttosto bassa e quindi potrebbe essere eluito dalla colonna AEC con basse concentrazioni di sale. Il FCP periferico di T. pseudonana, d'altra parte, è stato caratterizzato dal tempo di ritenzione più lungo dei complessi proteici del pigmento di diatomee separati ed eluito solo ad alte concentrazioni di NaCl, il che indica un'elevata carica negativa dei complessi FCP. Confrontando l'LHCII con i complessi FCP periferici è possibile che le regioni esposte delle proteine, che interagiscono con la matrice carica positivamente della colonna AEC, mostrino differenze nella loro carica negativa. È anche possibile che differenze nello stato di oligomerizzazione dei complessi di raccolta della luce portino a differenti cariche nette negative e quindi a differenti tempi di ritenzione. L'LHCII delle piante superiori viene solitamente isolato come LHCII trimerico. Stati oligomerici superiori dei complessi FCP sono tipici per le diatomee centriche come C. meneghiniana o la diatomea utilizzata nel presente studio, T. pseudonana. In queste alghe i complessi FCPb, che rappresentano l'ultima frazione proteica nella purificazione dei complessi FCP mediante AEC [16], e quindi sono paragonabili alla Frazione 5 della presente separazione, sembrano essere composti da nonameri FCP mentre i complessi FCPa mostrano un struttura [3, 13, 27]. L'aumento della carica superficiale negativa degli FCP può essere visto in combinazione con l'elevata concentrazione del lipide SQDG caricato negativamente nelle membrane tilacoidi delle diatomee [22]. La repulsione pronunciata tra FCP e SQDG può portare alla separazione di PSI in regioni della membrana tilacoide esterna arricchite di SQDG e PSII e FCP periferico nelle lamelle della membrana interna composte principalmente da MGDG. Tale separazione del fotosistema è stata proposta da Lepetit et al. [22] ed è stato recentemente supportato dai dati di Bina et al. [4] e Flori et al. [10].

Applicabilità del presente metodo di separazione AEC

Il metodo AEC presentato in questo studio consente la pre-purificazione del nucleo PSI e PSII e dei complessi FCP della diatomea centrica T. pseudonana. È stato anche testato per la separazione delle proteine ​​del pigmento della ben caratterizzata diatomea centrica C. meneghiniana. Queste analisi hanno prodotto un frazionamento comparabile delle membrane tilacoidi solubilizzate (vedi file aggiuntivo 2B). I complessi proteici del pigmento isolati possono servire come materiale di partenza per la purificazione finale dei rispettivi complessi utilizzando un metodo di purificazione proteico separato come la cromatografia ad esclusione dimensionale o la centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. La purificazione parziale, cioè l'isolamento delle frazioni del core complex PSI e PSII che contengono complessi FCP, permette di differenziare tra i complessi FCP che sono più strettamente associati ai core complex PSI e PSII e i complessi FCP che formano i complessi di antenna periferici , a condizione che la presenza di FCP nelle frazioni PSI e PSII non rappresenti una coeluizione dei complessi FCP-A e dei complessi centrali PS.

Eterogeneità dei FCP

La frazione 5 della presente separazione AEC conteneva i complessi FCP periferici che non erano associati ai complessi centrali PSI e PSII. I complessi FCP periferici erano dominati dalla presenza della banda proteica 21 kDa e la banda FCP 18 kDa è stata rilevata solo a bassa concentrazione. Secondo l'analisi mediante spettrometria di massa la banda 21 kDa era composta esclusivamente dalle proteine ​​Lhcf8 e Lhcf9. È interessante notare che anche Lhcf8 e Lhcf9 sono stati trovati nella banda dei 18 kDa ma, in base ai dati dell'analisi 1 del presente studio, non in tutte le frazioni dell'AEC. Ulteriori proteine ​​Lhc non sono state rilevate nel FCP periferico. Secondo la separazione AEC presentata da Gundermann et al. [16] La frazione 5 corrisponde ai complessi FCPb di C. meneghiniana. Gundermann et al. [16] hanno rilevato Fcp5/Lhcf3 come la proteina Lhc più importante nei complessi FCPb. Lhcf3 è stato accompagnato da basse concentrazioni di Lhcf1 e Lhcf4/Lhcf6. Quest'ultimo, tuttavia, è stato trovato solo nel complesso FCPb2. Tenendo conto che in T. pseudonana i geni simili Lhcf3, Lhcf8 e Lhcf9 codificano per una proteina identica, i dati del presente studio sulla composizione proteica dei complessi FCP periferici sono in accordo con i dati di Gundermann et al. [16] concernente il FCPb. Oltre alle proteine ​​Lhcf, Gundermann et al. [16] hanno osservato la presenza delle proteine ​​Lhcx1 e Lhcx6_1 nell'FCPb che è stato purificato da colture ad alta luminosità. Queste proteine ​​non sono state rilevate nel presente studio come componenti del FCP periferico. La presenza della proteina Lhcf8 nella banda FCP 21 kDa è in linea con i dati pubblicati da Nagao et al. [27] che hanno rilevato la proteina Lhcf8 nelle bande da 21 kDa della FCP oligomerica e trimerica di T. pseudonana. La proteina Lhcf9, che è stata rilevata come componente aggiuntivo della banda 21 kDa nel presente studio, non è stata osservata da Nagao et al. [27]. Tuttavia, questa proteina è probabilmente identica al prodotto del gene Lhcf8. Il FCP oligomerico di T. pseudonana, che è stato purificato da Nagao et al. [27] da clear-native PAGE, è stato caratterizzato dalla singola presenza della banda FCP 21 kDa. È quindi paragonabile ai complessi FCP periferici isolati nel presente studio, anch'essi dominati dalla banda 21 kDa. I risultati del presente studio sono anche in linea con le recenti osservazioni di Calvaruso et al. [6] che il complesso FCPb periferico di T. pseudonana è costituito dalle proteine ​​Lhcf8/Lhcf9. Come la banda 21 kDa della Frazione 5, le bande 21 kDa delle altre frazioni AEC contenevano solo Lhcf8 e Lhcf9. Come la banda 21 kDa, la banda 18 kDa ha mostrato una composizione proteica comparabile nelle diverse frazioni ad eccezione di Lhcf8 e Lhcf9 che, secondo l'analisi 1, sono state trovate solo nella banda 18 kDa delle frazioni 2 e 5. Lhcf1, Lhcf2, Lhcf5, e Lhcf6 invece, sono state trovate in tutte le frazioni e quindi sembrano rappresentare le principali proteine ​​Lhcf della banda dei 18 kDa. Mentre nella prima analisi MS eseguita nel presente studio Lhcf4 è stato rilevato solo nella banda 18 kDa della Frazione 2, la seconda analisi MS ha indicato la presenza della proteina Lhcf4 nella banda 18 kDa delle Frazioni 2-4. La presenza di Lhcf5 nella banda FCP di 18 kDa è in linea con i dati di Nagao et al. [27] che hanno osservato due bande FCP nella regione di 18 kDa di complessi FCP trimerici di T. pseudonana. Secondo la loro analisi spettrometrica di massa, la banda principale di 18 kDa conteneva Lhcf5 e inoltre Lhcf1 e Lhcf4. Nel presente studio sia Lhcf1 che Lhcf4 sono stati rilevati anche nella banda di 18 kDa delle frazioni da 2 a 4. La banda minore di 18 kDa nello studio di Nagao et al. [27] è stato caratterizzato dalla presenza aggiuntiva di Lhcf6, Lhcf7 e Lhcf11. Lhcf6 rappresentava un componente delle frazioni da 2 a 4 della presente separazione AEC, mentre Lhcf7 è stato rilevato solo nella seconda analisi mediante spettrometria di massa e si è verificato solo nella frazione 2. Lhcf11, tuttavia, non è stato osservato nelle rispettive frazioni del presente studio. L'assenza di Lhcf11 è molto probabilmente spiegata dal fatto che nelle presenti separazioni proteiche mediante SDS-PAGE non è stata risolta una banda FCP minore di 18 kDa. La presenza di Lhcf4 nella banda 18 kDA della Frazione 2, che sembra arricchita in PSII, è in linea con il recente isolamento di un supercomplesso PSII-FCP di C. gracilis [35]. Sulla base dei dati strutturali è stato proposto che il monomero FCP-E, che è piuttosto strettamente associato al complesso centrale PSII e media l'interazione di uno dei tetrameri FCP-A con il nucleo, rappresenta una subunità simile a Lhcf4. È interessante notare che il monomero FCP-D, che è anche coinvolto nell'interazione dell'FCP-A periferico con il complesso centrale PSII, sembra essere una proteina LHC correlata a Lhca.

Tenendo conto che una coeluizione dei complessi core PSII e PSI e dei complessi FCPa potrebbe aver avuto luogo nella separazione AEC del presente studio, un confronto con la composizione proteica dei diversi complessi FCPa pubblicato da Gundermann et al. [16] sembra prezioso. Nel presente studio Lhcf1, Lhcf2, Lhcf5 e Lhcf6, con un'ulteriore presenza di Lhcf8 e Lhcf9, sembravano rappresentare le principali proteine ​​delle frazioni AEC da 2 a 4, che corrisponderebbero ai diversi complessi FCPa. Gundermann et al. [16] hanno osservato che i complessi FCPa di C. meneghiniana erano dominati dalle proteine ​​Lhcf1, Lhcf4/Lhcf6 e Lhcf3. Secondo la loro analisi mediante spettrometria di massa, FCPa1, FCPa3 e FCPa4 contengono Lhcf1 come principale proteina Lhcf mentre FCPa2 è caratterizzata da un'alta concentrazione di Lhcf4/Lhcf6.

Ulteriori proteine ​​FCP che sono state rilevate da Gundermann et al.[16] come costituenti dei complessi FCPa erano la proteina Lhcx1 e Lhcx6_1. Nel presente studio sono state trovate quattro diverse proteine ​​Lhcx, ovvero Lhcx1, Lhcx2, Lhcx5 e Lhcx6_1. Le proteine ​​Lhcx1, Lhcx2 e Lhcx5 sono state osservate nella frazione 2 della separazione AEC, che in base alla sua composizione proteica, rappresenta una frazione arricchita in complessi core PSII. Lhcx6_1 era un costituente della Frazione 1 che, per la sua elevata concentrazione di DD, Dt e Fx, deve essere considerata come una frazione mista di proteine ​​e pigmenti liberi.

Le frazioni 3 e 4 non contenevano proteine ​​Lhcx ma, oltre alle proteine ​​Lhcf, erano caratterizzate dalla presenza di due proteine ​​Lhcr in ciascuna frazione. Mentre la Frazione 3 conteneva Lhcr3 e Lhcr14, Lhcr1 e Lhcr3 sono stati trovati nella Frazione 4. Inoltre, Lhcr3 è stato rilevato nella Frazione 2. La presenza di proteine ​​Lhcr nelle frazioni AEC contenenti proteine ​​del complesso core PSI è in linea con i dati della letteratura che descrivono le proteine ​​Lhcr come proteine ​​antenna PSI-specifiche [13, 18]. Mentre nel presente studio sono stati rilevati Lhcr1, Lhcr3 e Lhcr14, Grouneva et al. [13] hanno osservato Lhcr1, Lhcr3, Lhcr4, Lhcr7, Lhcr10, Lhcr11 e Lhcr14 nella loro analisi del proteoma tilacoide di T. pseudonana. L'analisi dei complessi PSI-FCPI di T. pseudonana isolati mediante una combinazione di centrifugazione in gradiente di saccarosio e AEC [18] hanno mostrato la presenza di Lhcr1, Lhcr3, Lhcr4, Lhcr10, Lhcr13 e Lhcr14 come proteine ​​antenna PSI.

Assegnazione di altre proteine ​​importanti

La frazione 2 della presente separazione AEC, che è arricchita in complessi core PSII, contiene un'altra proteina interessante, vale a dire la DD de-epossidasi (DDE). Il DDE è l'enzima che catalizza la reazione diretta del ciclo delle xantofille delle diatomee, la de-epossidazione della DD a Dt (per una rassegna sui cicli delle xantofille e NPQ vedi [11]). Dt è uno dei componenti responsabili del processo di NPQ. Un altro fattore importante per NPQ è la presenza di proteine ​​Lhcx che si verificano anche nella frazione 2 contenente PSII del gradiente AEC. Si pensa che le proteine ​​Dt e Lhcx svolgano un ruolo nel sito di estinzione Q2 che si trova nelle vicinanze del complesso centrale PSII e, insieme al sito di estinzione Q1, fornisce protezione del PSII contro i danni causati dall'eccessiva energia di eccitazione.


Materiali e metodi

Tensioni

Un epitopo myc è stato introdotto presso l'NH2 capolinea del maturo Emp24p. Il myc-tag emp24-E178A mutante è stato costruito sostituendo un appropriato frammento di EMP24 con la versione mutata sequenziata ottenuta mediante tecniche di PCR. RH4443 (MATα, ura3, leu2, his4, bar1, emp24:: KanMx) è stato ottenuto sostituendo l'intero EMP24 sequenza di codifica di RH1959 (STUOIAa, ura3, leu2, his4, bar1) con un KanMx cassetta. EMP24 gli alleli sono stati clonati in un plasmide YCplac111 (CEN/ARS). Il S. cerevisiae ceppo RH696-2B (STUOIAα, sec18-20 gap1Δ::LEU2 ura3 ade2 leu2 lys2Δ201 pPL269) è stato ottenuto incrociando PLY129 (pPL269) (MATα gap1Δ::LEU2 ura3 ade2 leu2 lys2Δ201 pPL269) (Kuehn et al. 1996), con RH478 (STUOIAα sec18-20 leu2 his4). I citosol sono stati preparati da RH732 (MATα his4 leu2 ura3 lys2 pep4::URA3 bar1) e RH2043 (MATα sec18-20 his4 leu2 ura3 pep4::URA3 bar1).

Tecniche proteiche

I livelli di proteine ​​sono stati determinati mediante estrazione di colture in fase logaritmica e Western blotting (Sütterlin et al. 1997) utilizzando anticorpi generati contro la coda citosolica di Emp24p o l'epitopo myc. L'analisi del trasporto di Gas1p in vivo è stata effettuata mediante un protocollo di pulse-chase (Sütterlin et al. 1997). La maturazione di Gas1p è stata analizzata utilizzando un impulso di 4 minuti e il successivo inseguimento a 30°C, seguito da immunoprecipitazione, SDS-PAGE e fluorografia. Le forme immature (105 kD) e mature (125 kD) di Gas1p sono state quantificate utilizzando un densitometro. La percentuale di Gas1p maturo è stata utilizzata come indicazione del trasporto all'apparato del Golgi. La determinazione della ripartizione del Gas1p tra le fasi acquosa e detergente di Triton X-114 è stata eseguita come descritto (Nuoffer et al. 1993), tranne per il fatto che le frazioni dei mezzi non sono state analizzate. Dopo la separazione nelle fasi detergente e acquosa, Gas1p è stato denaturato, immunoprecipitato, risolto mediante SDS-PAGE, visualizzato e quantificato utilizzando un PhosphorImager.

Saggio in vitro ER-in erba

Il saggio di imballaggio del carico ER permeabilizzato, basato su cellule, è stato eseguito come descritto (Kuehn et al. 1996) con alcune modifiche. I ceppi RH1959, RH4438 e RH696-2B sono stati trasformati con pCNYG1 per sovraesprimere Gas1p (circa cinque volte) (Nuoffer et al. 1991). La sovraespressione non ha influenzato la cinetica di trasporto di Gas1p o la dipendenza da EMP24. L'acido 2-mercaptoetansolfonico 10 mM ha sostituito il ditiotreitolo 10 mM. Le reazioni di germogliamento contenevano 30 μl di membrane (da 12 × 10 7 cellule), 300 μg di citosol grezzo, 3 μg di Sar1p, 1 × ATP mix e 0,2 mM GTP in un volume di 150 μl. Dopo 2 h a 25°C, una parte del campione è stata prelevata per l'analisi (totale), l'aliquota rimanente è stata sedimentata (14.000 rpm, 2 min, 4°C), e 125 µl di surnatante raccolti e sottoposti a flottazione su un gradiente a gradini Nycodenz® (Barlowe et al. 1994). 100 μl dalla parte superiore sono stati scartati e gli 800 μl successivi sono stati trasferiti in una nuova provetta. 400 μl sono stati diluiti tre volte con B88 e centrifugati (100.000 G, 1 ora, 4°C). Il pellet di membrana è stato sciolto in SDS all'1% in tampone TEPI (Sütterlin et al. 1997) per 10 minuti a 55°C, sottoposto a immunoprecipitazione e analizzato mediante SDS-PAGE con successiva esposizione e quantificazione mediante PhosphorImager.

Immunoisolamento delle vescicole

Le vescicole sono state prodotte in una reazione di germogliamento usando sec18 membrane e citosol. Il sec18 le membrane sono state preparate come sopra, eccetto che gli ultimi 5 minuti di esaurimento e l'etichettatura dell'impulso erano a 32°C. Il sec18 il citosol è stato preincubato (32°C, 10 min) prima dell'uso. Le vescicole sono state immunoisolate con o senza l'anticorpo anti-coda Emp24p e processate secondo Kuehn et al. 1996.

Collegamento incrociato

Le vescicole purificate con Nycodenz prodotte in una reazione di germogliamento sono state regolate a 2,5 M di urea in B88 e incubate con 1 mM di ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP) o varie quantità di disuccinimidil glutarato (DSG Pierce) (20 °C, 20 min). La reazione di reticolazione è stata spenta mediante aggiunta di glicina (50 mM finale, 5 min, 20°C). Le vescicole sono state sedimentate a 100.000 G (1 h, 4°C), disciolto con SDS 1% in TEPI (5 min, 95°C per Gas1p e fattore proα glicosilato [gpαF], o 55°C per Gap1p), e immunoprecipitato con anticorpo anti-coda Emp24p o l'anticorpo Erv25 (Belden e Barlowe 1996) e la proteina A–Sepharose. Il materiale precipitato è stato eluito dalle sfere di Sepharose mediante incubazione con SDS all'1% in TEPI (5 min, 95 o 55°C) e reimmunoprecipitato con anticorpo anti-Gas1p o anti-Gap1p.


Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che possano essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi.

Amarillas, L., Chaidez, C., González-Robles, A. e León-Félix, J. (2016). Sequenza completa del genoma del nuovo batteriofago phiE142, che provoca contemporaneamente la lisi del multiresistente Escherichia coli O157: H7 e Salmonella enterica. In piedi. Genomica Sci. 11:89.

Altschul, S. F., Madden, T. L., Sch󤿾r, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., et al. (1997). Gapped BLAST e PSI-BLAST: una nuova generazione di programmi di ricerca di database proteici. Acidi nucleici Res. 25, 3389�. doi: 10.1093/nar/25.17.3389

Belle, A., Landthaler, M. e Shub, D. A. (2002). Homing senza introni: l'endonucleasi sito-specifica SegF del batteriofago T4 media l'esclusione di marcatori localizzati analoga alle endonucleasi homing degli introni del gruppo I. Geni Dev. 16, 351�. doi: 10.1101/gad.960302

Clokie, M. R., Millard, A. D., Letarov, A. V. e Heaphy, S. (2011). Fagi in natura. batteriofago 1, 31�.

Comeau, A. M., Bertrand, C., Letarov, A., Tétart, F. e Krisch, H. (2007). Architettura modulare della superfamiglia dei fagi T4: un genoma centrale conservato e una periferia plastica. Virologia 362, 384�. doi: 10.1016/j.virol.2006.12.031

Cuff, J. A., Clamp, M. E., Siddiqui, A. S., Finlay, M. e Barton, G. J. (1998). JPred: un server di previsione della struttura secondaria di consenso. Bioinformatica 14, 892�. doi: 10.1093/bioinformatica/14.10.892

Drivdahl, R.H., e Kutter, E.M. (1990). Inibizione della trascrizione del DNA contenente citosina in vitro dal prodotto del gene alc del batteriofago T4. J. batteriolo. 172, 2716�. doi: 10.1128/jb.172.5.2716-2727.1990

Frazier, M.W., e Mosig, G. (1990). Il batteriofago T4 gene mrh il cui prodotto inibisce l'espressione del gene T4 tardivo in an Escherichia coli mutante rpoH (𼌲). Gene 88, 7�. doi: 10.1016/0378-1119(90)90053-t

Gamkrelidze, M., e Dabrowska, K. (2014). Il batteriofago T4 come piattaforma di visualizzazione dei fagi. Arco. Microbiolo. 196, 473�. doi: 10.1007/s00203-014-0989-8

Gruber, H., Kern, G., Gauss, P., e Gold, L. (1988). Effetto della sequenza e della struttura del DNA sull'attività nucleasica della proteina DexA del batteriofago T4. J. batteriolo. 170, 5830�. doi: 10.1128/jb.170.12.5830-5836.1988

Herendeen, D.R., Williams, K.P., Kassavetis, G.A., e Geiduschek, E.P. (1990). Una proteina legante l'RNA polimerasi necessaria per la comunicazione tra un potenziatore e un promotore. Scienza 248, 573�. doi: 10.1126/science.2185541

Huang, Y.-J., Parker, M. M. e Belfort, M. (1999). Ruolo della degradazione esonucleolitica nell'homing dell'introne di gruppo I nel fago T4. Genetica 153, 1501�.

Kadyrov, F. A., Shlyapnikov, M. G. e Kryukov, V. M. (1997). Un'endonucleasi sito-specifica del fago T4, SegE, è responsabile di uno scambio genetico non reciproco tra fagi T-even-correlati. FEBS Lett. 415, 75�. doi: 10.1016/s0014-5793(97)01098-3

Kashlev, M., Nudler, E., Goldfarb, A., White, T. e Kutter, E. (1993). Batteriofago T4 Alc protein: un fattore di terminazione della trascrizione che rileva la modificazione locale del DNA. Cellula 75, 147�. doi: 10.1016/s0092-8674(05)80091-1

Appassionato, E. C. (2015). Un secolo di ricerche sui fagi: i batteriofagi e la formazione della biologia moderna. Biosaggi 37, 6𠄹. doi: 10.1002/bies.201400152

Kutter, E., Gachechiladze, K., Poglazov, A., Marusich, E., Shneider, M., Aronsson, P., et al. (1995). Evoluzione dei fagi correlati a T4. Geni del virus 11, 285�. doi: 10.1007/bf01728666

Lin, D. M., Koskella, B. e Lin, H. C. (2017). Terapia fagica: un'alternativa agli antibiotici nell'era della multiresistenza. Mondo J. Gastrointest. Farmaco. l. 8:162. doi: 10.4292/wjgpt.v8.i3.162

Loc-Carrillo, C., e Abedon, S. T. (2011). Pro e contro della terapia fagica. batteriofago 1, 111�. doi: 10.4161/bact.1.2.14590

Marblestone, J. G., Edavettal, S. C., Lim, Y., Lim, P., Zuo, X. e Butt, T. R. (2006). Confronto della tecnologia di fusione SUMO con i tradizionali sistemi di fusione genica: maggiore espressione e solubilità con SUMO. Proteine ​​Sci. 15, 182�. doi: 10.1110/ps.051812706

Miller, E. S., Kutter, E., Mosig, G., Arisaka, F., Kunisawa, T. e Ruger, W. (2003). Genoma del batteriofago T4. Microbiolo. Mol. Biol. rev. 67, 86�.

Mosig, G., e Eiserling, F. (2006). “T4 e relativi fagi: struttura e sviluppo,” in I batteriofagi, 2a edizione, ed. R. Calendar (Oxford: Oxford University Press), 225�.

Mosig, G., Colowick, N. E. e Pietz, B. C. (1998). Diversi nuovi geni T4 del batteriofago, mappati mediante il sequenziamento degli endpoint di delezione tra i geni 56 (dCTPasi) e dda (una ATPasi-elicasi DNA-dipendente) modulano la trascrizione. Gene 223, 143�. doi: 10.1016/s0378-1119(98)00238-8

Müller, U. e Marchin, G. (1977). Purificazione e proprietà di un fattore batteriofago T4 che modifica la valil-tRNA sintetasi di Escherichia coli. J. Biol. chimica 252, 6640�. doi: 10.1016/s0021-9258(17)39895-2

Müller, U., e Marchin, G. L. (1975). Aspetto temporale del batteriofago valil tRNA sintetasi modificato con T4 in Escherichia coli. J. Virol. 15, 238�. doi: 10.1128/jvi.15.2.238-243.1975

Pulitzer, J. F., Colombo, M. e Ciaramella, M. (1985). Nuovi elementi di controllo della trascrizione pre-replicativa del batteriofago T4. J. Mol. Biol. 182, 249�. doi: 10.1016/0022-2836(85)90343-2

Ramón, A., Señorale, M. e Marín, M. J. F. I. M. (2014). Organi di inclusione: non così male…. Davanti. Microbiolo. 5:56. doi: 10.3389/fmicb.2014.00056

Sharma, M., e Hinton, D. M. (1994). Purificazione e caratterizzazione della proteina SegA del batteriofago T4, un'endonucleasi correlata a proteine ​​codificate dagli introni del gruppo I. J. batteriolo. 176, 6439�. doi: 10.1128/jb.176.21.6439-6448.1994

Sharma, Regno Unito, e Chatterji, D. (2008). Meccanismi differenziali di legame dei fattori anti-sigma Escherichia coli Rsd e batteriofago T4 AsiA a E. coli RNA polimerasi portano a diverse conseguenze fisiologiche. J. batteriolo. 190, 3434�. doi: 10.1128/jb.01792-07

Skorupski, K., Tomaschewski, J., Rüger, W. e Simon, L. (1988). Un batteriofago T4 gene che funziona per inibire Escherichia coli Lon proteasi. J. batteriolo. 170, 3016�. doi: 10.1128/jb.170.7.3016-3024.1988

Stitt, B. L., e Mosig, G. (1989). L'espressione alterata di alcuni geni T4 del batteriofago prereplicativo spiega la sintesi alterata del DNA T4 in Escherichia coli mutanti rho (nusD). J. batteriolo. 171, 3872�. doi: 10.1128/jb.171.7.3872-3880.1989

Taj, M. K., Samreen, Z., Taj, I., Hassani, T. M., Ling, J. e Yunlin, W. (2014). Il batteriofago T4 come organismo modello. IMPATTO Int. J. Ris. Appl. Naz. Soc. Sci. 2, 19�.

Uzan, M., d𠆚ubenton-Carafa, Y., Favre, R., de Franciscis, V. e Brody, E. (1985). La proteina mot T4 funziona come parte di un complesso DNA-proteina pre-replicativo. J. Biol. chimica 260, 633�. doi: 10.1016/s0021-9258(18)89779-4

Wang, G., Vianelli, A. e Goldberg, E. (2000). Autoassemblaggio del batteriofago T4: ricostituzione in vitro della gp2 ricombinante in fago infettivo. J. batteriolo. 182, 672�. doi: 10.1128/jb.182.3.672-679.2000

Wilson, G. W. e Edgell, D. R. (2009). Il fago T4 mobE promuove il trans homing della defunta endonucleasi I-TevIII. Acidi nucleici Res. 37, 7110�. doi: 10.1093/nar/gkp769

Yang, Y., Ke, Z., Wang, Z., Li, Y., Li, Y., Wang, Y., et al. (2020). Assegnazioni NMR 1H, 13C e 15 N della proteina tag di solubilità Msyb of Escherichia coli. Biomol. Assegna RMN. 14, 251�. doi: 10.1007/s12104-020-09955-6

Yap, M. L. e Rossmann, M. G. (2014). Struttura e funzione del batteriofago T4. Microbiolo del futuro. 9, 1319�. doi: 10.2217/fmb.14.91

Zhang, K., Wang, Z., Chang, G., Wang, H., Wang, Y. e Liu, B. (2019). Assegnazioni di risonanza della proteina T4 Y04L del batteriofago. Biomol. Assegna RMN. 14, 51�. doi: 10.1007/s12104-019-09919-5

Parole chiave: batteriofago, T4, NMR, crio-EM, Mrh, Cef, Y04L e Gp57B

Citazione: Zhang K, Li X, Wang Z, Li G, Ma B, Chen H, Li N, Yang H, Wang Y e Liu B (2021) Espressione sistemica, purificazione e caratterizzazione strutturale iniziale delle proteine ​​T4 del batteriofago senza struttura nota Omologhi. Davanti. Microbiolo. 12:674415. doi: 10.3389/fmicb.2021.674415

Ricevuto: 01 marzo 2021 Accettato: 22 marzo 2021
Pubblicato: 13 aprile 2021.

Shuai Le, Army Medical University, Cina

Jianfeng Yu, Università di Shenzhen, Cina
Nan Hou, Accademia cinese delle scienze mediche, Cina

Copyright © 2021 Zhang, Li, Wang, Li, Ma, Chen, Li, Yang, Wang e Liu. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito secondo i termini della Creative Commons Attribution License (CC BY). L'uso, la distribuzione o la riproduzione in altri forum sono consentiti, a condizione che l'autore o gli autori originali e il proprietario del copyright siano citati e che la pubblicazione originale in questa rivista sia citata, in conformità con la pratica accademica accettata. Non è consentito alcun uso, distribuzione o riproduzione che non sia conforme a questi termini.