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Problemi con SDS-PAGE, nessuna separazione - quale potrebbe essere il problema?

Problemi con SDS-PAGE, nessuna separazione - quale potrebbe essere il problema?


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Lavoro in un laboratorio dove abbiamo una scorta comune di 30% di acrilammide, TEMED, TRIS-HCl (pH6.8 e pH 8.8.) e una soluzione SDS 10% (p/v) pH 7.2.

Usiamo la ricetta per il caricamento del buffer (che ovviamente mescoliamo con BME prima dell'uso):

  • 3,15 ml di acqua MilliQ
  • 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl
  • 2,9 ml 85% Glicerolo
  • 2 ml 10% SDS
  • 0,4 mL 0,5% (p/v) blu di bromofenolo

Il nostro problema è che non c'è separazione.

Ho provato a fare 2 gel perché pensavo di aver mescolato il gel di separazione e quello di impilamento, ma mi sono assicurato di non farlo la seconda volta. Poi ho chiesto a qualcun altro di fare il gel, e non ha funzionato neanche per loro (niente sul gel, nessun campione, nessuna scala).

Quindi ho rifatto la soluzione SDS al 10% ed entrambi i tamponi TRIS, ma di nuovo sta succedendo qualcosa di strano perché non otteniamo nulla sul gel.

I gel sono ovviamente polimerizzati come un gel solido quando li togli per macchiare e decolorare, e non capisco come il tampone di caricamento possa farlo anche se lo rovini (perché dovresti vedere qualcosa sul gel finché il tuo campione nel pozzo, anche senza denaturazione). Ovviamente abbiamo rifatto il caricamento del colorante e riprovato, ma non funziona.

So che ci sono proteine ​​nei campioni, poiché sto mettendo il pellet cellulare e la proteina purificata (di cui ho testato l'attività catalitica) sullo stesso gel.

Qualcuno ha una spiegazione razionale per questo, o suggerimenti su ciò che in genere può essere sbagliato.

Di seguito è riportata un'immagine del gel come appare quando ha quasi finito di funzionare a 200 V (80 mAmp) per circa 40 minuti. Quando macchiamo e decoloriamo non c'è niente sul gel. Inoltre penso che il colore (blu bromofenolo) sembri scorrere in modo un po' strano sul gel, non come dovrebbe normalmente, vedere l'immagine sotto, ma forse sto diventando un po' paranoico.


Dopo aver riaggiustato il pH di tutto e aver creato un nuovo tampone di corsa con la nuova soluzione SDS, la separazione sembra essere tornata.


SDS-PAGE "Hall of Shame"

Potresti benissimo aver preparato un gel quasi perfetto e avresti difficoltà a migliorare il prodotto. Se è così, allora gongolare con tutti i mezzi! Se non hai fatto un lavoro così eccitante, non disperare. Tutti i buoni scienziati imparano dai propri errori, infatti, senza commettere errori la maggior parte di noi non imparerebbe affatto!

La "Hall of Shame" presenta esempi di alcuni dei peggiori gel che gli studenti (e gli istruttori) hanno utilizzato nei laboratori passati, con un paio di esempi da un laboratorio di ricerca. Rappresentano molti dei modi in cui si può rovinare un gel (ma non tutti - stiamo ancora trovando nuovi modi!). Guarda quali caratteristiche del tuo gel erano insoddisfacenti - o almeno meno che perfette - e usa le illustrazioni per capire cosa potresti fare per migliorare la tua tecnica.


Scala proteica che non si separa - (Mar/10/2013 )

Ho eseguito diverse SDS-PAGE con risoluzione del 10% e stacking del 5%. Non sono sempre riuscito a risolvere la scala proteica di 25 kb. Dopo il marker 50kb, il resto sembra impilarsi e non separarsi. C'è una volta, anche il fronte del colorante si ferma presto anche se la corrente è in esecuzione.
È un problema del mio gel o dei tamponi?

La maggior parte dei coloranti proteici è sensibile al pH. Hai caricato il colorante o la scala cambia colore mentre è migrato lungo il gel? Stai usando gel già pronti o stai preparando i gel da solo? Se stai usando prodotti preconfezionati, i gel sono scaduti, sono stati conservati correttamente? Se stai preparando i gel da solo, è possibile che uno dei tuoi tamponi sia contaminato o che il pH sia spento. Hai apportato modifiche al buffer di esecuzione del western blot? Stai utilizzando una nuova scorta di una sostanza chimica (ad esempio SDS, Tris, Glycine, ecc.).

Qualcuno in laboratorio ha problemi simili con quel particolare impianto di western blot? Sei sicuro che il tuo apparecchio mantenga la tensione corretta? Qual è la temperatura del tuo running buffer nel tuo impianto western blot (caldo, bollente)?

Pensa ad alcune di queste domande e inizierà subito la risoluzione dei problemi.

Grazie al caricamento del colorante non ha cambiato colore. Sto preparando il gel da solo. C'è un compagno di laboratorio che ha lo stesso problema. Stavo pensando che potrebbe essere il problema del buffer in esecuzione poiché l'unica cosa che usiamo in comune è il buffer in esecuzione. Il tampone di corsa è solitamente 700 ml di H2O, 200 ml di tampone di corsa 10X e 100 ml di metanolo. La tensione che uso in genere è 60 V per 30 minuti e 120 V per 1,5 ore fino a quando il fronte del colorante raggiunge quasi la fine.

A causa dell'impilamento della scala proteica, a volte il mio fronte di tintura si fermava presto.

Sì, prova a rifare i buffer e guarda cosa succede. Aggiungi metanolo al tuo tampone di corsa?

il metanolo nel tampone di corsa eliminerà sds dalla proteina e causerà problemi di migrazione.

abbiamo visto l'arresto del colorante di tracciamento all'inizio della corsa. abbiamo scoperto che se avessimo continuato la corsa, il colorante sarebbe "saltato" sul fondo del gel, si sarebbe affinato e avrebbe continuato a migrare. il gel colorato risultante appariva normale. pensiamo che sia stato causato dall'invecchiamento di un componente nel buffer in esecuzione (molto probabilmente l'sds).

se hai bisogno di vedere la separazione di un'ampia gamma di dimensioni proteiche, potresti prendere in considerazione l'esecuzione di un gel gradiente.

le informazioni fornite con gli standard di dimensione (o possono essere trovate sul sito Web del produttore) dovrebbero mostrarti come dovrebbero apparire gli standard quando vengono eseguiti a varie concentrazioni di gel.

Ehm, quindi il tuo tampone di corsa è a concentrazione doppia? Dovresti solo aggiungere 100 ml di tampone 10X a una soluzione da 1 litro.

E non ho sentito parlare di aggiunta di metanolo al tampone di corsa, al tampone di trasferimento, certo, questo è comune, ma non al tampone di corsa. Hai forse confuso i tuoi protocolli?


Gel di poliacrilammide per SDS-PAGE

Sono stati sviluppati molti sistemi per l'elettroforesi proteica e l'apparato utilizzato per SDS-PAGE varia ampiamente. La metodologia utilizzata in queste pagine utilizza il metodo Laemmli. Il riferimento al metodo Laemmli in una sezione relativa a materiali e metodi elimina la necessità di descrivere i tamponi, la colata di gel, l'apparato, ecc. sezione metodi sono la percentuale di acrilammide totale (%T) in un gel, la percentuale relativa e il tipo di reticolante (%C) e forse un riferimento alle dimensioni del gel. Usiamo un sistema "mini-gel", con cassette di gel da 3 1/4" x 4".

SDS-PAGE può essere condotto su gel prefabbricati, risparmiando la fatica e il rischio di lavorare con l'acrilammide. La seguente descrizione si applica alle apparecchiature per la colata e la corsa prodotte in negozio che sono molto più economiche delle apparecchiature disponibili in commercio. Oltre all'efficacia in termini di costi, il vantaggio di creare i propri gel per la prima volta è una comprensione più profonda del processo.

Indipendentemente dal sistema, la preparazione richiede la colata di due diversi strati di acrilammide tra lastre di vetro. Lo strato inferiore (separatore o risolvente, gel) è responsabile della separazione effettiva dei polipeptidi per dimensione. Lo strato superiore (stacking gel) include i pozzetti del campione. È progettato per spazzare le proteine ​​in un campione tra due confini mobili in modo che vengano compresse (impilate) in strati sottili micrometri quando raggiungono il gel di separazione.


Protocollo

1. Preparazione del Gel

Pesare la massa appropriata di agarosio in un matraccio di Erlenmeyer. I gel di agarosio vengono preparati utilizzando una soluzione percentuale p/v. La concentrazione di agarosio in un gel dipenderà dalle dimensioni dei frammenti di DNA da separare, con la maggior parte dei gel compresi tra 0,5%-2%. Il volume del tampone non deve essere maggiore di 1/3 della capacità del pallone.

Aggiungere tampone in esecuzione al pallone contenente agarosio. Agitare per mescolare. I tamponi per la corsa del gel più comuni sono TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA).

Sciogliere la miscela di agarosio/tampone. Questo è più comunemente fatto riscaldando in un forno a microonde, ma può anche essere fatto su una fiamma Bunsen. A intervalli di 30 s, rimuovere il pallone e agitare il contenuto per mescolare bene. Ripetere fino a quando l'agarosio non si è completamente sciolto.

Aggiungere bromuro di etidio (EtBr) ad una concentrazione di 0,5 μg/ml. In alternativa, il gel può anche essere colorato dopo l'elettroforesi in tampone di corsa contenente 0,5 μg/ml EtBr per 15-30 min, seguito da decolorazione in tampone di corsa per un uguale periodo di tempo.

Nota: EtBr è un sospetto cancerogeno e deve essere adeguatamente smaltito secondo i regolamenti dell'istituto. I guanti devono essere sempre indossati quando si maneggiano gel contenenti EtBr. Sono disponibili coloranti alternativi per la colorazione del DNA, tuttavia EtBr rimane il più popolare a causa della sua sensibilità e del suo costo.

Lasciare che l'agarosio si raffreddi sul banco o mediante incubazione in un bagnomaria a 65 ଌ. In caso contrario, si deformerà il vassoio del gel.

Posizionare il vassoio del gel nell'apparato di colata. In alternativa, si possono anche fissare i bordi aperti di un vassoio di gel per creare uno stampo. Posizionare un pettine appropriato nello stampo in gel per creare i pozzetti.

Versare l'agarosio fuso nello stampo in gel. Lasciare che l'agarosio si rapprenda a temperatura ambiente. Rimuovere il pettine e posizionare il gel nella scatola del gel. In alternativa, il gel può anche essere avvolto in un involucro di plastica e conservato a 4 ଌ fino al momento dell'uso (Fig. 1).

2. Allestimento dell'apparato gel e separazione dei frammenti di DNA

Aggiungere il colorante di caricamento ai campioni di DNA da separare (Fig. 2). Il colorante per il caricamento del gel viene generalmente prodotto a una concentrazione 6X (0,25% blu di bromfenolo, 0,25% xilene cianolo, 30% glicerolo). Il caricamento del colorante aiuta a tenere traccia della distanza percorsa dal campione di DNA e consente inoltre al campione di affondare nel gel.

Programmare l'alimentatore alla tensione desiderata (1-5V/cm tra gli elettrodi).

Aggiungere abbastanza tampone in esecuzione per coprire la superficie del gel. È importante utilizzare lo stesso tampone di corsa utilizzato per preparare il gel.

Collegare i cavi della scatola del gel all'alimentatore. Accendere l'alimentatore e verificare che sia la scatola del gel che l'alimentatore funzionino.

Rimuovere il coperchio. Caricare lentamente e con attenzione il/i campione/i di DNA nel gel (Fig. 3). Un marcatore di dimensioni del DNA appropriato dovrebbe sempre essere caricato insieme ai campioni sperimentali.

Riposizionare il coperchio sulla scatola del gel. Il catodo (cavi neri) dovrebbe essere più vicino ai pozzetti rispetto all'anodo (cavi rossi). Controllare due volte che gli elettrodi siano inseriti negli slot corretti nell'alimentatore.

Accendere l'alimentazione. Esegui il gel fino a quando il colorante non è migrato a una distanza adeguata.

3. Osservazione di frammenti di DNA separati

Al termine dell'elettroforesi, spegnere l'alimentazione e rimuovere il coperchio della scatola del gel.

Rimuovere il gel dalla scatola del gel. Scolare il tampone in eccesso dalla superficie del gel. Posizionare il vassoio del gel su salviette di carta per assorbire l'eventuale tampone di corsa in più.

Rimuovere il gel dal vassoio del gel ed esporre il gel alla luce UV. Questo è più comunemente fatto usando un sistema di documentazione gel (Fig. 4). Le bande del DNA dovrebbero apparire come bande fluorescenti arancioni. Scatta una foto del gel (Fig. 5).

Smaltire correttamente il gel e il tampone di corsa secondo i regolamenti dell'istituto.

4. Risultati rappresentativi

Figura 5 rappresenta un tipico risultato dopo l'elettroforesi su gel di agarosio di prodotti di PCR. Dopo la separazione, i frammenti di DNA risultanti sono visibili come bande chiaramente definite. Lo standard o la scala del DNA devono essere separati in modo tale da consentire l'utile determinazione delle dimensioni delle bande di campionamento. Nell'esempio mostrato, frammenti di DNA di 765 bp, 880 bp e 1022 bp sono separati su un gel di agarosio all'1,5% insieme a una scala di DNA a 2 log.

Figura 1. Un gel di agarosio solidificato dopo la rimozione del pettine.

Figura 2. Una studentessa che aggiunge colorante di caricamento ai suoi campioni di DNA.

Figura 3. Uno studente che carica il campione di DNA in un pozzetto nel gel.

Figura 4. Un esempio di un sistema di documentazione del gel.

Figura 5. L'immagine di un gel post elettroforesi. EtBr è stato aggiunto al gel prima dell'elettroforesi ad una concentrazione finale di 0,5 μg/ml, seguita da separazione a 100 V per 1 ora. Il gel è stato esposto alla luce UV e la foto è stata scattata con un sistema di documentazione del gel.


Il sistema tampone discontinuo e il gel impilabile – allineandoli alla linea di partenza

Per condurre la corrente dal catodo (negativo) all'anodo (positivo) attraverso il gel è ovviamente necessario un tampone. Per lo più utilizziamo il sistema tampone discontinuo Laemmli. “Discontinuous” significa semplicemente che il tampone nel gel e il serbatoio sono diversi.

Tipicamente, il sistema è impostato con un gel di impilamento a pH 6,8, tamponato da Tris-HCl, un gel in esecuzione tamponato a pH 8,8 da Tris-HCl e un tampone per elettrodi a pH 8,3. Il gel impilabile ha una bassa concentrazione di acrilammide e il gel da corsa una concentrazione più elevata in grado di ritardare il movimento delle proteine.


Allora, che cos'è 8217 con tutti quei diversi pH e 8217?

Bene, la glicina può esistere in tre diversi stati di carica, positivo, neutro o negativo, a seconda del pH. Questo è mostrato nel diagramma sottostante. Il controllo dello stato di carica della glicina da parte dei diversi tamponi è la chiave dell'intera faccenda del gel di impilamento.

Quindi ecco come funziona il gel impilabile. Quando si accende l'alimentazione, gli ioni glicina caricati negativamente nel tampone dell'elettrodo a pH 8,3 sono costretti a entrare nel gel di impilamento, dove il pH è 6,8. In questo ambiente, la glicina passa prevalentemente allo stato zwitterionico (con carica neutra). Questa perdita di carica li fa muovere molto lentamente nel campo elettrico.

Gli ioni Cl- (da Tris-HCl) invece si muovono molto più velocemente nel campo elettrico e formano un fronte ionico che migra davanti alla glicina. La separazione di Cl- dal controione Tris (che ora si sta spostando verso l'anodo) crea una zona stretta con un forte gradiente di tensione che trascina dietro di sé la glicina, risultando in due fronti di ioni migratori strettamente separati, il Cl altamente mobile - anteriore, seguito dal fronte glicina più lento, per lo più neutro.

Tutte le proteine ​​nel campione di gel hanno una mobilità elettroforetica che è intermedia tra l'estremo della mobilità della glicina e del Cl-, quindi quando i due fronti attraversano il pozzetto del campione, le proteine ​​sono concentrate nella zona stretta tra il Cl - e fronti di glicina.


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L'analisi proteomica di successo enfatizza la preparazione del campione, la strumentazione e il software.

Una corretta preparazione del campione significa risultati migliori

Le proteine ​​di interesse per i ricercatori biologici sono generalmente presenti in una miscela complessa di altre proteine, che presenta due problemi significativi nell'analisi della SM:

  1. Le tecniche di ionizzazione utilizzate per le grandi molecole funzionano bene quando la miscela contiene quantità approssimativamente uguali di costituenti. Tuttavia, l'intervallo dinamico delle concentrazioni proteiche nei campioni biologici può superare i 10 ordini di grandezza. Se una tale miscela viene ionizzata mediante ionizzazione elettrospray (ESI), ad esempio, le specie più abbondanti hanno la tendenza a "soffocare" o a sopprimere i segnali di quelle meno abbondanti.
  2. Lo spettro di massa di una miscela complessa è molto difficile da analizzare completamente a causa del suo enorme numero di componenti. Questo problema è esacerbato dalla digestione enzimatica di un campione proteico in un gran numero di prodotti peptidici. Il successo della cromatografia liquida MS (LC-MS) e della MS tandem (LC-MS/MS) dipende da campioni puliti con una complessità del campione limitata per ridurre al minimo la soppressione della ionizzazione da parte di specie ad alta abbondanza e prevenire il sottocampionamento MS dei peptidi eluiti.

La preparazione delle proteine ​​per l'analisi MS può essere eseguita con molti metodi, quindi è importante comprendere i passaggi che portano all'analisi. Mentre le proteine ​​intatte sono tipicamente studiate mediante elettroforesi su gel, i flussi di lavoro di spettrometria di massa più comuni per campioni proteici complessi analizzano i peptidi, che sono più facili delle proteine ​​da frazionare mediante LC. I peptidi inoltre ionizzano e frammentano in modo più efficiente rispetto alle proteine ​​intere, ottenendo spettri più facili da interpretare per l'identificazione delle proteine. La preparazione dei peptidi comporta la riduzione e l'alchilazione delle cisteine, la digestione del campione in peptidi, la desalificazione e la concentrazione dei peptidi e l'analisi finale di questi peptidi mediante ionizzazione (ad es. ESI) più MS basata su orbitrap.

La decisione di utilizzare MALDI-MS o LC-MS o LC-MS/MS per l'analisi proteomica dipende da una serie di fattori, tra cui il livello di preparazione del campione e il potenziale di produttività. Ad esempio, poiché più campioni possono essere essiccati su una singola matrice MALDI, 96 campioni possono essere analizzati in un'ora rispetto a un solo campione mediante LC-MS o LC-MS/MS. Al contrario, tutta la riduzione della complessità del campione deve essere eseguita off-line con MALDI-MS, e quindi la preparazione del campione è considerevolmente più critica per questo approccio rispetto a LC-MS o LC-MS/MS, che richiede una preparazione minima del campione a causa della -linea fase inversa LC utilizzata per ridurre la complessità del campione prima dell'analisi MS.

Flusso di lavoro per la preparazione del campione. I campioni di lisato vengono preparati da campioni biologici o cellule in coltura mediante un protocollo personalizzato che può includere lisi cellulare, frazionamento subcellulare, deplezione di proteine ​​ad alta abbondanza, arricchimento di proteine ​​bersaglio, dialisi e desalificazione. La digestione in soluzione comporta la rottura irreversibile dei legami disolfuro tramite riduzione e alchilazione seguita dalla digestione delle proteine ​​in frammenti peptidici. Un approccio alternativo consiste nel risolvere prima le proteine ​​mediante elettroforesi 1D o 2D (rispettivamente 1DE o 2DE) e quindi raccogliere le fette di gel che contengono le bande desiderate. Le proteine ​​in questi tappi di gel vengono quindi ridotte, alchilate e digerite sul posto. Dopo che i peptidi sono stati estratti dalla matrice del gel, i peptidi vengono arricchiti e sali e detergenti rimossi e preparati per l'analisi MS. Sebbene questo diagramma comprenda i passaggi più comuni della preparazione del campione, il protocollo deve essere adattato a campioni specifici e tecniche MS per risultati ottimali.

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Risoluzione dei problemi relativi alla cromatografia a scambio ionico

Se solo alcuni picchi sono di interesse in questa separazione ben risolta, può essere vantaggioso passare a un'eluizione a stadi per risparmiare tempo e buffer. Il resto di questa sezione si concentra su problemi pratici che possono portare a una separazione IEX non ideale.

Figura 2. Il campione eluisce prima che inizi il gradiente di sale

Assicurarsi che i buffer siano nei contenitori corretti. Ridurre la forza ionica del campione mediante desalinizzazione, pagina 156, o diluizione con tampone di avvio. Per uno scambiatore di anioni, aumentare il pH del tampone, per uno scambiatore di cationi, diminuire il pH del tampone. Se le proteine ​​continuano a non legarsi a nessun pH, è possibile che la colonna sia stata contaminata dal detergente.

Figura 3. Campione ancora in eluizione quando inizia il gradiente

Dopo l'applicazione del campione, la traccia UV deve tornare alla linea di base prima che inizi l'eluizione, altrimenti le proteine ​​che non si legano alla colonna interferiscono con la separazione. Aumentare il volume del tampone iniziale (fase di equilibrio) prima di iniziare l'eluizione in gradiente.

Figura 4. Il campione eluisce durante il lavaggio ad alto contenuto di sale

Le proteine ​​si legano troppo forte. Assicurarsi che i buffer siano nei contenitori corretti. Se si utilizza uno scambiatore di anioni, diminuire il pH del tampone, se si utilizza uno scambiatore di cationi, aumentare il pH del tampone.

Proteine ​​di interesse che eluiscono in ritardo nel gradiente

Le proteine ​​si legano troppo forte. Aumenta la forza ionica del gradiente. È preferibile modificare il pH se è richiesta una concentrazione di sale molto elevata per l'eluizione. Per uno scambiatore di anioni, diminuire il pH del tampone e per uno scambiatore di cationi, aumentare il pH del tampone. Fare riferimento anche a Tabella 6.

Proteine ​​di interesse che eluiscono troppo presto nel gradiente:

Le proteine ​​non si legano fortemente. Controllare la forza ionica del gradiente. Alterare il pH, per uno scambiatore anionico, aumentare il pH del tampone e per uno scambiatore cationico, diminuire il pH del tampone. Fare riferimento anche a Tabella 6.

Proteine ​​di interesse non sufficientemente risolte

Fare riferimento ai contenuti di questo capitolo per rivedere i parametri chiave per migliorare la risoluzione. Fare riferimento anche a Tabella 6.

*Solventi organici polari come metanolo, etanolo, isopropanolo e acetonitrile possono essere utilizzati a concentrazioni dallo 0 al 20%, ma si ricorda che alcune proteine ​​possono perdere irreversibilmente la loro attività biologica in presenza di solventi organici. Controllare la solubilità del campione e del tampone, il pH del tampone e la stabilità chimica del terreno prima di eseguire una colonna.
Si noti che la contropressione può aumentare quando si lavora con soluzioni organiche.


Prevenzione dei disturbi del comportamento distruttivo

Non si sa esattamente perché alcuni bambini sviluppino disturbi del comportamento dirompente. Molti fattori possono svolgere un ruolo, inclusi fattori biologici e sociali. È noto che i bambini corrono un rischio maggiore quando sono esposti ad altri tipi di violenza e comportamenti criminali, quando subiscono maltrattamenti o genitorialità dura o incoerente, o quando i loro genitori hanno condizioni di salute mentale come disturbi da uso di sostanze icona esterna, depressione icona esterna o disturbo da deficit di attenzione/iperattività (ADHD). Anche la qualità della cura della prima infanzia può influire sul fatto che un bambino sviluppi problemi comportamentali.

Sebbene questi fattori sembrino aumentare il rischio di disturbi del comportamento distruttivo, ci sono modi per ridurre la possibilità che i bambini li sperimentino. Scopri gli approcci di salute pubblica per prevenire questi rischi:


Guarda il video: এসডএস পইজ ক? SDS PAGE Principle and Step-by-Step Procedure with Explanation (Febbraio 2023).